用于生产转基因猪的piggyBac转座载体及其构建方法

摘要

本发明公开了一种用于生产转基因猪的piggyBac转座载体的构建方法，包括以下步骤：将加入了FRT位点的ZsGFP基因连接到转座子PXL－BAC II上形成重组载体PXL－BAC II－ZsGFP；再将加入了FRT位点的Neomycin Resistant基因连接到PXL－BAC II－ZsGFP，得重组通用载体PXL－BAC II－ZsGFP－Neo。该载体具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明的转座载体能满足细胞筛选、鉴定及高效转基因的要求。

说明书

技术领域

本发明涉及构建一个用于生产转基因猪的新型piggyBac转座载体及其构建方法。

背景技术

piggyBac(以前叫作IFP2)转座子，是一个来源于鳞翅目昆虫的DNA型转座子，在结构上与II型短的插入重复因子相关，在分类上属于第二类型，这一类型的因子包括hobo、hermers、mariner、P、Tcl和AC因子。piggyBac转座子最初是在杆状病毒(Baculovirus)侵染Trichoplusia ni昆虫TN-368细胞株系时，从Galleria mellonella(GmMNPV)或Autographacalifornica(AcMNPV)核多角体病毒内首次分离得到的。

piggyBac转座子是一个自主因子，长2476bp，含有一个RNA聚合酶II启动子区和一个聚腺苷酸信号，该信号的侧面是一个可读编码框(ORF)，编码1个单一的长约2.1kb的转录产物，即1个68kD的转座酶，该转座酶是转座子高频率的切出和转座所需的。piggyBac转座子的末端是长13bp的反向重复序列(ITR)，其内侧各有一段间隔区(spacer)，但并不对称(左端长3bp，右端长31bp)，再靠内侧是各长19bp的对称的亚末端反向重复(STR)(图1)。piggyBac转座子反向重复序列的5’末端以2-3个C碱基结束，3’末端的G碱基在切出位点的选择过程中起作用。piggyBac转座子总是在TTAA目标位点处插入，因而被归纳为TTAA——一特殊的可转移因子家族。

目前，piggyBac转座系统已成为在昆虫中使用最广的转座子，它已被证明能够在5个目(鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目和直翅目)的20多种昆虫中转座。piggyBac转座主要用于昆虫的转基因研究，其携带的基因大多为可见的报告基因，如ZsGFP，DsRed1，EYFP等荧光标记。它们收位置影响比较小，可以很方便地测试转座效率。

piggyBac在昆虫中具有广泛的转座活性，鼓舞着研究者将它的应用拓展到其它的非脊椎动物中。piggyBac在非脊椎动物中广泛而高效的转座能力提示我们piggyBac的转座可能较少地依赖于宿主特异性的因子。随后的研究表明piggyBac转座系统不仅能在昆虫中使用，而且能在脊椎动物中使用，甚至在高等动物中也具有活性，如人，小鼠等(见Cell，122，473-483，2005)。但迄今为止还没有能用于转基因猪载体的构建。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能应用于生产转基因猪的piggyBac转座子。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于生产转基因猪的piggyBac转座载体的构建方法，包括以下步骤：将加入了FRT位点的ZsGFP基因连接到转座子PXL-BAC II上形成重组载体PXL-BAC II-ZsGFP；再将加入了FRT位点的Neomycin Resistant基因连接到PXL-BAC II-ZsGFP，得重组通用载体PXL-BAC II-ZsGFP-Neo。

本发明还同时提供了按照上述方法构建的重组通用载体PXL-BACII-ZsGFP-Neo，该载体具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

本发明构建了一个用于生产转基因猪的新型piggyBac转座载体；该载体包括一个ZsGFP的报告基因，一个Neomycin的抗性筛选基因，以及可以将这2个基因剔除的FRT位点；并将其连接到piggyBac，便于检测和筛选。在本发明中，选用名称为PXL-BAC II的一种piggyBac转座子；通过PCR从RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体中得到ZsGFP基因，连接到PXL-BAC II上形成重组载体PXL-BAC II-ZsGFP；再用PCR从pSilencer4.1-CMVneo载体上得到Neomycin Resistant基因，连接到PXL-BAC II-ZsGFP上，形成重组载体PXL-BAC II-ZsGFP-Neo。为了后期能将这两个筛选基因给剔除掉，又在ZsGFP基因和Neomycin Resistant基因的两端加入了FRT位点，形成最终的转座载体PXL-BAC II-FRT-ZsGFP-Neo。由于piggyBac转座子发生转座需要在转座酶的作用下，因此需要一种公知的能编码转座酶的Helper质粒。上述方法构建的重组通用载体PXL-BAC II-ZsGFP-Neo转座载体能在Helper质粒的帮助下高效转座，将目的DNA转座到宿主猪基因组上，形成转基因动物。

综上所述，本发明的优点如下，构建一个新型的piggyBac转座子，能应用与生产转基因猪。该系统具有高效性和稳定性，并且具有一个ZsGFP的报告基因，一个Neomycin的抗性筛选基因，便于检测和筛选。由于在ZsGFP报告基因和Neomycin抗性基因的两端加入了FRT位点，因此最终可以将这两个基因给剔除掉。本发明的转座载体能满足细胞筛选、鉴定及高效转基因的要求。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是piggyBac转座子的结构示意图；

图2是构建PXL-BAC II-ZsGFP载体示意图；

图3是构建PXL-BAC II-ZsGFP-Neo载体示意图；

图4是piggyBac转座系统应用在猪PK15细胞中，观察到的绿色荧光蛋白表达示意图。

图5是piggyBac转座载体转座后PK15细胞中目的基因的PCR扩增图；

图5中：

M，标准分子量；1，阴性细胞ZsGFP基因；2，阳性细胞ZsGFP基因；3，阴性细胞Neo基因；4，阳性细胞Neo基因。

具体实施方式

实施例1、ZsGFP报告基因的获取及连接

RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体为模板，并设计ZsGFP报告基因的引物，该引物具体如下：

ZsGFP-F：GGATATCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG

ZsGFP-R：GGGCACCCTGGAAACAT；

在正向引物的前端加入一个FRT位点，得：

ZsGFP-FRT-F：

GgatatcGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG

(gatatc为EcoRv酶切位点，下划线为FRT位点序列)。

ZsGFP-R：同上。

PCR合成的条件为94℃预变性5分钟，再以94℃/45sec，55℃/45sec，72℃/2min，共35个循环，最后72℃延长10分钟，将PCR产物回收后连接到PXL-BACII上。具体内容如下(如图2所示)：将上述PCR产物和PXL-BACII质粒分别用EcoRv和XhoI双酶切；凝胶回收后用T4连接酶相连接，形成PXL-BAC II-ZsGFP。

实施例2、Neomycin筛选基因的获取及连接

以pSilencer 4.1-CMVneo载体为模板，并设计Neomycin筛选基因的引物，该引物具体如下：

Neomycin-F：CTCGAGAAGCCTATAGAGTACGAGCCA

Neomycin-R：AGATCTCAGACATGATAAGATACATTGATGA；

在反向引物的前端加入一个FRT位点，得

Neomycin-R：

agatctGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCCAGACATGATAAGATACATTGATGA(agatct为Bgl II酶切位点，下划线为FRT位点序列)；

Neomycin-F  同上。

PCR合成的条件为94℃预变性5分钟，再以94℃/45sec，55℃/45sec，72℃/2min，共35个循环，最后72℃延长10分钟，将PCR产物回收后连接到实施例1所得的PXL-BAC II-ZsGFP上，具体内容如下(如图3所示)：将上述PCR产物和PXL-BAC II-ZsGFP质粒分别用Bgl II和Xho I双酶切；凝胶回收后用T4连接酶相连接，形成PXL-BAC II-ZsGFP-Neo(如SEQ ID No：1所示)。

实施例3、构建成功的piggyBac转座载体在猪PK15中的应用

将PK15铺于平板中，在细胞密度达到80-90％后，将piggyBac(即实施例2所得的PXL-BAC II-ZsGFP-Neo)和Helper质粒(公知质粒，见Nat.Biotechnol.，2000，18：81-84)按照1∶1的比例共转染PK15细胞。3小时后换完全培养基培养，荧光显微镜检测到绿色荧光蛋白表达(如图4所示)。

实施例4、转基因

取经过piggyBac转座载体转染、筛选并克隆化的猪PK15细胞，充分悬浮细胞后离心(500g，5分钟)，弃上清，取细胞沉淀，采用细胞基因组DNA提取试剂盒提取细胞基因组。使用两对引物分别扩增ZsGFP基因，约1600bp；Neo基因，约2200bp。引物序列为：ZsGFP-F：TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG，ZsGFP-R：GGGCACCCTGGAAACAT；Neo-F：AAGCCTATAGAGTACGAGCCA，Neo-R：CAGACATGATAAGATACATTGATGA

PCR条件设置为94℃预变性5分钟，再以94℃/45sec，55℃/45sec，72℃/2min，共35个循环，最后72℃延长10分钟。

结果如图5，图中：M，标准分子量；1，阴性细胞ZsGFP基因；2，阳性细胞ZsGFP基因；3，阴性细胞Neo基因；4，阳性细胞Neo基因。在阴性细胞中均没有扩增到目的条带，在阳性细胞中均有目的条带，大小符合目的条带。结果表明：目的基因已经成功转座到猪PK15细胞基因组上。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO：1

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc  60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga  120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc  180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc  240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag  300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa  360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac  420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg  480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg  540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg  600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcctcgtt cattcacgtt tttgaacccg tggaggacgg  660

gcagactcgc ggtgcaaatg tgttttacag cgtgatggag cagatgaaga tgctcgacac  720

gctgcagaac acgcagctag attaacccta gaaagataat catattgtga cgtacgttaa  780

agataatcat gcgtaaaatt gacgcatgtg ttttatcggt ctgtatatcg aggtttattt  840

attaatttga atagatatta agttttatta tatttacact tacatactaa taataaattc  900

aacaaacaat ttatttatgt ttatttattt attaaaaaaa aacaaaaact caaaatttct  960

tctataaagt aacaaaactt ttatcgaatt cacgcgtaaa aaatggtact cctcaactgc  1020

tgtctcttga acagcagttg aggagtacca cggatcctcg tcctttccac aagatatata  1080

aagccaagaa atcgaaatac tttcaagtta cggtaagcat atgatagtcc attttaaaac  1140

ataattttaa aactgcaaac tacccaagaa attattactt tctacgtcac gtattttgta  1200

ctaatatctt tgtgtttaca gtcaaattaa ttctaattat ctctctaaca gccttgtatc  1260

gtatatgcaa atatgaagga atcatgggaa ataggccctc ttcctgccca gatctaattg  1320

attactatta ataactagaa ttcaaaaaac gaccaggaat acaatatctc tcttgaagat  1380

attgtattcc tggtcgcgga tcctcgtcct ttccacaaga tatataaagc caagaaatcg  1440

aaatactttc aagttacggt aagcatatga tagtccattt taaaacataa ttttaaaact  1500

gcaaactacc caagaaatta ttactttcta cgtcacgtat tttgtactaa tatctttgtg  1560

tttacagtca aattaattct aattatctct ctaacagcct tgtatcgtat atgcaaatat  1620

gaaggaatca tgggaaatag gccctcttcc tgcccagatc tgaagttcct atactttcta  1680

gagaatagga acttccagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta  1740

gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa  1800

ccattataag ctgcaataaa caagttgggg tgggcgaaga actccagcat gagatccccg  1860

cgctggagga tcatccagcc ggcgtcccgg aaaacgattc cgaagcccaa cctttcatag  1920

aaggcggcgg tggaatcgaa atctcgtgat ggcaggttgg gcgtcgcttg gtcggtcatt  1980

tcgcgaaccc cagagtcccg ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg  2040

ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc  2100

aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc  2160

cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa  2220

gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg ccttgagcct  2280

ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac  2340

aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa  2400

tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac  2460

tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag  2520

cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt  2580

cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg caccggacag  2640

gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc  2700

agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc  2760

cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc  2820

ttgatcagat ccgaaaatgg atatacaagc tcccgggagc tttttgcaaa agcctaggcc  2880

tccaaaaaag cctcctcact acttctggaa tagctcagag gcagaggcgg cctcggcctc  2940

tgcataaata aaaaaaatta gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt  3000

taggggcggg atgggcggag ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgcat  3060

gctttgcata cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta  3120

attgagatgc atgctttgca tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacacca  3180

atattattga agcatttatc agggttattg tctcataagc ttttcaccgt catcaccgaa  3240

acgcgcgagg cagccagctt acctcccggt ggtgggtcgg tggtccctgg gcaggggtct  3300

cccgatcccg gacgagcccc caaatgaaag acccccgctg acgggtagtc aatcactcag  3360

aggagaccct cccaaggaac agcgagacca caagtcggat gcaactgcaa gagggtttat  3420

tggatacacg ggtacccggg cgactcagtc aatcggagga ctggcgcccc gagtgagggg  3480

ttgtgggctc ttttattgag ctcggggagc agaagcgcgc gaacagaagc gagaagcgaa  3540

ctgattggtt agttcaaata aggcacaggg tcatttcagg tccttggggc accctggaaa  3600

catctgatgg ttctctaggg tcgaccctgt tccatctgtt cctgaccttg atctgaactt  3660

ctctattctc agttatgtat ttttccatgc cttgcaaaat ggcgttactt aagctagctt  3720

gccaaaccta caggtggggt ctttcattcc cccctttttc tggagactaa ataaaatctt  3780

ttattttatc tatggctcgt actctatagg cttctcgagt tagggcaagg cggagccgga  3840

ggcgatggcg tgctcggtca ggtgccactt ctggttcttg gcgtcgctgc ggtcctcgcg  3900

ggtcagcttg tgctggatga agtgccagtc gggcatcttg cggggcacgg acttggcctt  3960

gtacacggtg tcgaactggc agcgcaagcg gccaccgtcc ttcagcagca ggtacatgct  4020

cacgtcgccc ttcaagatgc cctgcttggg cacggggatg atcttctcgc aggagggctc  4080

ccagttgtcg gtcatcttct tcatcacggg gccgtcggcg gggaagttca cgccgtagaa  4140

cttggactcg tggtacatgc agttctcctc cacgctcacg gtgatgtcgg cgttgcagat  4200

gcacacggcg ccgtcctcga acaggaagga gcggtcccag gtgtagccgg cggggcagga  4260

gttcttgaag tagtcgacga tgtcctgggg gtactcggtg aacacgcggt tgccgtacat  4320

gaaggcggcg gacaagatgt cctcggcgaa gggcaagggg ccgccctcca ccacgcacag  4380

gttgatggcc tgcttgccct tgaaggggta gccgatgccc tcgccggtga tcacgaactt  4440

gtggccgtcc acgcagccct ccatgcggta cttcatggtc atctccttgg tcaggccgtg  4500

cttggactgg gccatggtgg cgaccggtag cgctagcgga tctgacggtt cactaaacca  4560

gctctgctta tatagacctc ccaccgtaca cgcctaccgc ccatttgcgt caatggggcg  4620

gagttgttac gacattttgg aaagtcccgt tgattttggt gccaaaacaa actcccattg  4680

acgtcaatgg ggtggagact tggaaatccc cgtgagtcaa accgctatcc acgcccattg  4740

atgtactgcc aaaaccgcat caccatggta atagcgatga ctaatacgta gatgtactgc  4800

caagtaggaa agtcccataa ggtcatgtac tgggcataat gccaggcggg ccatttaccg  4860

tcattgacgt caataggggg cgtacttggc atatgataca cttgatgtac tgccaagtgg  4920

gcagtttacc gtaaatactc cacccattga cgtcaatgga aagtccctat tggcgttact  4980

atgggaacat acgtcattat tgacgtcaat gggcgggggt cgttgggcgg tcagccaggc  5040

gggccattta ccgtaagtta tgtaacgcgg aactccatat atgggctatg aactaatgac  5100

cccgtaattg attactatta ataactagaa gttcctatac tttctagaga ataggaactt  5160

cgatatctat aacaagaaaa tatatatata ataagttatc acgtaagtag aacatgaaat  5220

aacaatataa ttatcgtatg agttaaatct taaaagtcac gtaaaagata atcatgcgtc  5280

attttgactc acgcggtcgt tatagttcaa aatcagtgac acttaccgca ttgacaagca  5340

cgcctcacgg gagctccaag cggcgactga gatgtcctaa atgcacagcg acggattcgc  5400

gctatttaga aagagagagc aatatttcaa gaatgcatgc gtcaatttta cgcagactat  5460

ctttctaggg ttaatctagc tgcatcagga tcatatcgtc gggtcttttt tccggctcag  5520

tcatcgccca agctggcgct atctgggcat cggggaggaa gaagcccgtg ccttttcccg  5580

cgaggttgaa gcggcatgga aagagtttgc cgaggatgac tgctgctgca ttgacgttga  5640

gcgaaaacgc acgtttacca tgatgattcg ggaaggtgtg gccatgcacg cctttaacgg  5700

tgaactgttc gttcaggcca cctgggatac cagttcgtcg cggcttttcc ggacacagtt  5760

ccggatggtc agcccgaagc gcatcagcaa cccgaacaat accggcgaca gccggaactg  5820

ccgtgccggt gtgcagatta atgacagcgg tgcggcgctg ggatattacg tcagcgagga  5880

cgggtatcct ggctggatgc cgcagaaatg gacatggata ccccgtgagt tacccggcgg  5940

gcgcgcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca  6000

attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg  6060

agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg  6120

tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc  6180

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta  6240

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag  6300

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg  6360

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg  6420

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg  6480

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga  6540

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc  6600

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aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact  6720

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg  6780

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt  6840

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt  6900

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct  6960

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg  7020

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gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg  7260

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gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg  7380

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca  7440

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga  7500

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct  7560

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg  7620

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca  7680

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata  7740

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct  7800

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact  7860

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa  7920

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc  7980

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga  8040

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga  8100

aaagtgccac                                                         8110