一种消除水产品革兰氏阳性致病菌的蛭弧菌菌株及其应用

摘要

本发明公开了一种消除水产品革兰氏阳性致病菌的蛭弧菌菌株及其应用。本发明分离得到一株在电子显微镜下观察呈单细胞，弧形，大小为0.65×0.2μm，端生鞭毛，鞭毛长度至少1.8μm的蛭弧菌BDS02。将其以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1－2mm的透明圆形噬菌斑。应用所述蛭弧菌BDS02制备的微生物制剂对水产品食用前，运输过程及养殖过程中的常见革兰氏阳性致病菌，包括结核分枝杆菌、星状诺卡氏菌、红串红球菌、粪链球菌、表皮葡萄球菌、产气荚膜梭菌及谷氨酸棒状杆菌有显著的消除作用，不仅可提高消费者生食水产品的安全系数，保护消费者的健康，也为水产品的绿色加工生产提供保障。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛭弧菌，特别涉及一种消除水产品革兰氏阳性致病菌的蛭弧菌菌株及其应用。

背景技术

近年来，世界各地相继发生重大的食品安全事件，不仅带来巨大的经济损失，还是对社会稳定和安全的考验，使得食品安全问题成为人们日益关注的问题。对此，世界各国和组织都设定了多种食品安全相关的法律法规，以达到预防和控制食品安全问题的目的。微生物是污染食品的重要因素之一，由于其个体微小、分布广泛、生存能力强、繁殖迅速等特点，使得如何避免和减少微生物污染成为食品加工和流通等环节考虑的首要问题。

养殖病害一直是制约水产养殖业持续健康发展的瓶颈之一，仅2004年我国监测到的水产病害损失就达151亿元。抗生素及化学消毒药物的滥用又使养殖经济动物抗病能力明显下降，既不利于养殖动物的健康生长，也不符合健康养殖理念及可持续发展的需要。随着对水产品安全要求的提高和对耐药菌株危害的重视，符合环境友好和可持续发展的生态防治技术则是当前和今后水产养殖病害最有希望的发展方向之一，而微生物则在其中扮演着最重要的角色。但是，一些微生态制剂在应对水生动物疾病防治方面还是存在诸多缺陷，而噬菌蛭弧菌具有独特的裂解细菌的生物学特性，为水生动物的疾病防治开辟了新的途径，一种绿色、环保、健康的天然“抗生素”正逐渐走进水产养殖产业。如能在水产品在养殖期间、运输过程或食用、加工前，先进行致病菌的生物消除工作，则一方面可以减少或消除食物中毒的机率，减少或消除药物残留的可能，提高产品质量安全系数，保护消费者的健康，另一方面也可为水产品的加工提供优质原材料和加工上的便利，为出口创汇提供强有力的保障。

水产养殖中可引起水产品病害的革兰氏阳性菌主要包括能引发分枝杆菌病的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、引发诺卡氏菌病的诺卡氏菌(Nocardia sp.)、引发链球菌病的链球菌(Streptococcus sp.)、引发葡萄球菌病的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、引发梭菌性肠炎的梭菌(Clostridium sp.)、导致水体养殖环境发生变化而影响养殖对象的健康状况的红球菌(Rhodococcus sp.)和引发棒状杆菌病的棒状杆菌(Corynebacterium sp.)。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种消除水产品革兰氏阳性致病菌的蛭弧菌菌株。

本发明的另一目的在于提供所述蛭弧菌菌株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种消除水产品革兰氏阳性致病菌的蛭弧菌菌株，名称为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209170；

对所述蛭弧菌BDS02进行负染后于电子显微镜下形态观察(见图1)：BDS02呈单细胞，弧形，大小为0.65×0.2μm，端生鞭毛，鞭毛长度至少1.8μm；所述蛭弧菌BDS02以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1-2mm的透明圆形噬菌斑；

蛭弧菌BDS02的16S-ITS rDNA序列如下(序列表SEQ ID NO.1所示)：CAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGGGTAGCAATACCTAGTGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTGGATAATCTGCCTTGGAGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATAAGACCACAGGAGCTGCGGCTCTAGGGGTCAAAGGTTTTTCGTTCCAAGATGAGTCCGCGTAAGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCTTTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTCGCAGGGGAATAACACAATGAATGTACCCTGTAAGAAAGGATCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGAGGGATCCTAGCGTTGTTCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGGATGTAGGTGGCTTTGTAAGTCAGATGTGAAAGCCCAGGGCTCAACCCTGGAAGTGCATTTGATACTGCGAAGCTTGAGTGTCGGAGAGGTTACTAGAATTGTTGGTGTAGTGGTGAAATACGTAGATATCAACAGGAATACCGGAGGCGAAGGCGGGTAACTGGCCGAACACTGACACTGAGATCCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTTGTTGTTAGAGGTATTGACCCCTTCAGTGACGAAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGGCTTGACATGTACTGGAAGATTGGCAGAAATGTCGTCGCCCGCAAGGGTCGGTACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGCATTTAGTTGCCAGCATTCAGTTCGGCACTCTAGATGGACTGCCGGTGTTAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGCCTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGTCACAGAGCGAAGCTAAGCCGCGAGGTAGAGCAAATCGCTTAAAAGCTATCTAAGTTCAGATTGATCTCTGCAACTCGAGATCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGAACAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAAAGTCGGCTGTACCAGAAGTCGCTGCGCTAACCGTAAGGAGGCAGGCGCCCAAGGTATGGTCGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGGAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGTTTATCCGGTCAATCTTCATCAAGACTTGTTCTTGATAAGTTAAAATGACCCAATCTTAGGTCAACTTACTCTTCCCGAGTAAGTGAGTCCCAAAAATCTATCTAGCTGTTTAGTTTTGAGAGAGTGAAGCCTAACGGGCCTGTAGCTCAGTTGGTTACAGCACACGCTTGATAAGCGTGGGGTCGGAAGTTCGAGTCTTCCCAGGCCCACCAAGTTCTACTGTACTGGAATGCGGTGTAAGTTAGAGTTTTGCTGAACGGTTTTCGTTCTTTGACATTTGAATAGATTGATTTAGTTGATTTTTAGCGAGGTTAGTTCCATTCTTTTAAGCTACAAAGGGCTTACGGTGGATGCCCTGGCAGTCA

一种消除水产品革兰氏阳性致病菌的微生物制剂，含有所述的蛭弧菌BDS02；

所述的微生物制剂还含有蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS01；

所述蛭弧菌BDS01于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M209169；将所述蛭弧菌BDS01进行负染后于电子显微镜下形态观察：BDS01呈单细胞，弧形，大小为0.9×0.25μm，端生鞭毛，鞭毛长度为4μm；所述蛭弧菌BDS01以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1-2mm的透明圆形噬菌斑；

所述的蛭弧菌BDS02优选通过申请号“200710031166.X”，名称为“高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术”国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行发酵；

所述蛭弧菌BDS01优选通过申请号“200710031166.X”，名称为“高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术”国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行发酵；

所述的蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDS01优选按细菌数1∶1混合；

所述微生物制剂应用于消除水产品革兰氏阳性致病菌；

所述水产品优选淡水产品；

所述水产品革兰氏阳性致病菌包括结核分枝杆菌(Mycobacteriμmtuberculosis)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、产气荚膜梭菌(Clostridiμm perfringens)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriμm glutamicμm)；

所述微生物制剂应用于消除食用或加工前水产品携带的革兰氏阳性致病菌，应用时蛭弧菌最佳浓度范围为10⁴～10⁸pfu/mL；

所述微生物制剂应用于控制水产品运输过程中的革兰氏阳性致病菌，应用时蛭弧菌最佳浓度范围为10³～10⁶pfu/mL；

所述微生物制剂应用于控制水产品养殖水体中的革兰氏阳性致病菌，应用时蛭弧菌最佳浓度范围则为10²～10⁵pfu/mL；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明所述的微生物制剂在消除水产品携带的革兰氏阳性致病菌的应用效果显著。

本发明所述的微生物制剂在消除水产品食用或加工前、运输过程及其养殖水体中革兰氏阳性致病菌的应用效果显著，以罗非鱼、南美白对虾、河蚬、大闸蟹例，如图2～13所示，对革兰氏阳性致病菌均有较高的消除率，消除率均达90％以上。

2、在食用前用蛭弧菌消除水产品中致病性革兰氏阳性菌安全性好

蛭弧菌消除水产品中革兰氏阳性致病菌方法是生物的方法，蛭弧菌可侵染、裂解宿主细菌的特性使之适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，且其在裂解完宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，因此对人和动物无毒副作用。不仅可提高消费者生食水产品的安全系数，保护消费者的健康，也为水产品的绿色加工生产提供保障。

3、将本发明应用于水产品运输过程中，方便、安全且效果好

水产品在运输过程中采用蛭弧菌来控制革兰氏阳性致病菌可防止水质恶化、提高水产品存活率，同时避免使用抗生素，确保水产品的优质。

4、本发明适合推广应用于水产品的养殖过程

在养殖期间即进行致病菌的消除工作，特别有利于减少或消除化学药物如抗生素的使用和残留，确保水产品的优质，以罗非鱼、南美白对虾、河蚬、大闸蟹养殖为例，2株蛭弧菌混合得到的微生物制剂使用时对淡水鱼虾贝蟹养殖水体中革兰氏阳性致病菌的消除试验的效果如图13所示，养殖水体中致病菌的数量，可控制在100cfu/mL以内。

5、本发明为消除水产品所携带的致病菌提供一种新的方法并可适用于水产品养殖到食用前的全过程中，有效地减少或消除化学药物如抗生素的残留，确保水产品的优质，从根本上避免水产品食物中毒事件的发生，为出口创汇提供强有力的保障。

附图说明

图1是蛭弧菌BDS02于电镜下观察的形态图。

图2是只含BDS02的微生物制剂用于消除水产品食用前的革兰氏阳性致病菌产气荚膜梭菌的效果图。

图3是只含BDS02的微生物制剂用于消除水产品食用前的革兰氏阳性致病菌红串红球菌的效果图。

图4是只含BDS02的微生物制剂用于消除水产品食用前的革兰氏阳性致病菌谷氨酸棒状杆菌的效果图。

图5是由BDS01和BDS02组成的微生物制剂用于消除水产品食用前的革兰氏阳性致病菌的效果图。

图6是只含BDS02的微生物制剂用于消除水产品运输过程中的革兰氏阳性致病菌产气荚膜梭菌的效果图。

图7是只含BDS02的微生物制剂用于消除水产品运输过程中的革兰氏阳性致病菌红串红球菌的效果图。

图8是只含BDS02的微生物制剂用于消除水产品运输过程中的革兰氏阳性致病菌谷氨酸棒状杆菌的效果图。

图9是由BDS01和BDS02组成的微生物制剂用于消除水产品运输过程中的革兰氏阳性致病菌的效果图。

图10是只含BDS02微生物制剂用于消除水产品养殖过程中的革兰氏阳性致病菌产气荚膜梭菌的效果图。

图11是只含BDS02微生物制剂用于消除水产品养殖过程中的革兰氏阳性致病菌红串红球菌的效果图。

图12是只含BDS02微生物制剂用于消除水产品养殖过程中的革兰氏阳性致病菌谷氨酸棒状杆菌的效果图。

图13是由BDS01和BDS02组成的微生物制剂用于消除水产品养殖过程中的革兰氏阳性致病菌的效果图。

图14是由BDS01和BDS02组成的微生物制剂用于消除淡水产品养殖过程中的致病菌的效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)蛭弧菌BDS02的分离纯化

将宿主嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172)接种于含100mL灭菌LB(Luria-Bertani)液体培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2)的三角瓶中，置于转速为200rpm，温度为28℃的恒温摇床中培养16h，使其处于对数生长期。培养液在4℃温度条件下，以6000rpm速度离心20min，弃去上清液，沉淀下来的菌体用1mL DNB(dilute nutrient broth)液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000mL蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)重新悬浮后(浓度约为3×10¹⁰cfu/mL)置于4℃冰箱，待用。

对采集的泥样进行预处理，取泥样约3g加入到含50mL灭菌DNB液体培养基的三角瓶中，同时加入已制备好的增殖蛭弧菌的嗜水气单胞菌菌悬液0.5mL，将三角瓶置于转速为200rpm，温度为28℃的恒温摇床中培养36h，培养液先在4℃条件下，1500rpm离心15min离心去泥渣，后6000rpm离心20min去宿主，上清液再在4℃温度条件下，以16000rpm速度离心20min，弃去上清液，沉淀物用1mL DNB液体培养基重新悬浮，成为样品浓缩液。

采用双层平板法：取0.5mL样品浓缩液和0.5mL嗜水气单胞菌悬浮液混合，此混合液再与3～3.5mL 50℃的DNB上层培养基(蒸馏水1000mL，pH7.2，琼脂粉7g)混合均匀，倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.2，琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28℃恒温培养箱中培养，每隔12h观测实验结果。待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑，挑取不断扩大的单斑，加入到含有50mL DNB液体培养基的三角瓶中悬浮，同时加入相应的宿主菌浓缩液，置于转速为200rpm，温度为28℃的恒温摇床中连续培养30h。然后，培养液在4℃温度条件下，以6000rpm的速度离心20min，上清液在4℃温度条件下，再以16000rpm的速度离心20min，倾倒双层琼脂平板检验，再次挑取不断扩大的单斑，并重复若干次，至单噬菌斑传代形成形状、大小、透明均一致的噬菌斑即为一株蛭弧菌纯菌株。挑选形状规则、透明且噬菌斑最大的噬菌斑，命名为蛭弧菌BDS02。将其进行负染后于电子显微镜下形态观察(图1)：蛭弧菌呈单细胞，弧形，大小为0.65×0.2μm，端生鞭毛，鞭毛长度至少1.8μm；所述蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1～2mm的透明圆形噬菌斑。根据伯杰氏手册(Bergey’s Manual)对蛭弧菌的描述：蛭弧菌是寄生于其他细菌上的细菌，在寄生阶段、细胞呈单个、小、弯曲、运动的杆状，极生鞭毛运动，鞭毛有鞘。由此可以确认，分离得到的蛭弧菌BDS02为Bdellovibrio sp.。应用DNA纯化试剂盒提取蛭弧菌BDS02的基因组DNA，扩增其16S rDNA。通过测序和拼接后(见序列表SEQ ID NO.1)在GenBank中进行同源性搜索，比对结果显示蛭弧菌BDS02的16S-ITS rDNA与其他已经公开的蛭弧菌16S rDNA序列相似度高，但不完全相同，说明蛭弧菌BDS02是首次分离得到。所述蛭弧菌BDS02于2009年8月7日在位于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M209170。

(2)消除水产品革兰氏阳性致病菌的微生物制剂的制备

蛭弧菌菌液通过申请号“200710031166.X”的国家发明专利申请公开的高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行发酵：分别在2个装有100mL LB(蛋白胨10g，酵母膏5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2)液体培养基的锥形瓶中接种嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172)，250rpm、30℃摇床培养24小时，培养液分别于4℃、6000rpm离心15min，弃上清。分别将沉淀加入到2个装有100mL DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000mL蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)的锥形瓶中，同时再分别从双层平板上挑取蛭弧菌BDS02和蛭弧菌BDS01(于2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M209169)的噬菌斑至已加入嗜水气单胞菌的DNB液体培养基中。恒温摇床200rpm、30℃培养24h。培养液分别于4℃6000rpm离心20min，取上清液，再将上清液分别于4℃16000rpm离心20min，保留沉淀，加入DNB液体培养基重新悬浮蛭弧菌沉淀物，使蛭弧菌BDS02菌液和蛭弧菌BDS01菌液的浓度分别为10¹⁰pfu/mL。

微生物制剂为由蛭弧菌数为10¹⁰pfu/mL的蛭弧菌BDS02菌液组成。

(3)将微生物制剂用于消除水产品食用前的革兰氏阳性致病菌

①、制备水产品革兰氏阳性致病菌液

产气荚膜梭菌(Clostridiμm perfringens ATCC13124，购于广东省微生物菌种保藏中心)，用强化梭菌培养基(酵母膏3g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉1g，葡萄糖5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl 3g，NaAc 3g，蒸馏水1000mL，pH8.5)，厌氧条件下28℃培养24h。红串红球菌(Rhodococcuserythropolis ATCC4277，购于中国普通微生物菌种保藏中心)，用ATYP培养基(KH₂PO₄ 1g，CaCl₂ 0.1g，NaHCO₃ 3g，乙酸钠1g，MgCl₂ 0.5g，NH₄Cl 1g，NaCl 1g，微量元素溶液1mL，维生素溶液1mL，琥珀酸钠1g，酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，蒸馏水1000mL；pH 6.8；微量元素配方为：FeCl₂·4H₂O 1.8g，CoCl₂·6H₂O 0.25g，NiCl₂·6H₂O 0.01g，CuCl₂·2H₂O 0.01g，MnCl₂·4H₂O 0.7g，ZnCl₂ 0.1g，H₃BO₃ 0.5g，NaMoO₄·2H₂O 0.03g，Na₂SeO₃·5H₂O 0.01g，蒸馏水1000mL；维生素溶液配方为：生物素0.1g，烟酸0.35g，盐酸硫胺素0.3g，对氨基苯甲酸0.2g，盐酸吡多胺0.1g，泛酸钙0.1g，维生素B₁₂0.05g，蒸馏水1000mL)摇床培养，30℃160rpm培养48h。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriμmglutamicμm ATCC13032，购于广东省微生物菌种保藏中心)用普通营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.4)摇床培养，28℃160rpm培养24h。上述各菌的培养液分别经6000rpm、4℃离心20min，弃上清液，沉淀菌体用DNB液体培养基重新悬浮，分别调整各自浓度为10⁹cfu/mL。产气荚膜梭菌菌液、红串球菌菌液和谷氨酸棒状杆菌菌液以1∶1∶1的比例混合，得到水产品革兰氏阳性致病菌液。

②将微生物制剂用于消除水产品食用前的革兰氏阳性致病菌

试验容器为25L的水族箱，分为试验组(试验组共有3组，其中使用的蛭弧菌终浓度分别为10⁴pfu/mL、10⁶pfu/mL和10⁸pfu/mL)和对照组，每组设3个平行。试验用水为滤膜过滤的养殖淡水，每个水族箱注入16L过滤水。水族箱在实验前经二氯异腈尿酸钠消毒，水温为26℃。在每个水族箱中加入步骤①制备水产品革兰氏阳性致病菌液，终浓度为分别1×10⁴cfu/mL。然后每个水族箱放罗非鱼、南美白对虾、河蚬以及大闸蟹各10只。试验所用罗非鱼约重140～190g，罗非鱼、南美白对虾体长约为15-20cm，河蚬平均体长为40mm，大闸蟹规格为30～40g。对照组为只加步骤①制备水产品革兰氏阳性致病菌液但不加蛭弧菌，实验组分别加入微生物制剂，使用的蛭弧菌终浓度分别为10⁴pfu/mL、10⁶pfu/mL、和10⁸pfu/mL。培养72小时后，取1000ml水样，用0.22um滤膜(Millipore)过滤浓缩细菌，然后在用10ml无菌水洗下滤膜上的菌体，再按10倍稀释法稀释，最后从每个稀释梯度样品中吸取0.2mL的水样涂平板进行检测。做三个平行样检测。

产气荚膜梭菌的检测采用强化梭菌琼脂(强化梭菌培养基中加入琼脂15g即可得)选择性培养，红串红球菌的检测采用加入丁二酸(1％W/V)的改良Raymond培养基(Na₂CO₃ 0.1g，CaCI₂·6H₂O 0.01g，MnCI₂·4H₂O0.007g，Na₂HPO₄·12H₂O 35.8g，KH₂PO₄ 13.6g，MgCl₂·6H₂O 0.16g，NH₄Cl2.0g，NaCl 5.0g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，丁二酸1％W/V，pH 6.7)选择培养，谷氨酸棒状杆菌的检测采用CLED培养基(蛋白胨4g，牛肉粉3.0g，胰蛋白胨4g，乳糖10g，半胱氨酸0.128g，溴麝香草酚蓝0.02g，蒸馏水1000mL，琼脂15g，pH 3.0)选择性培养。计算活菌数。

从图2，图3和图4中可知，添加只由蛭弧菌BDS02制成的微生物制剂72h后，试验系列中试验组的各革兰氏阳性致病菌产气荚膜梭菌、红串红球菌和谷氨酸棒状杆菌浓度均呈下降趋势。作用72小时后，蛭弧菌浓度为10⁴pfu/mL时，对产气荚膜梭菌、红串红球菌和谷氨酸棒状杆菌的消除率分别为98.42％、97.48％和98.00％。实验结果表明，应用只由蛭弧菌BDS02制成的微生物制剂对革兰氏阳性致病菌进行消除时，蛭弧菌的浓度越大，作用时间越长，消除效果就越好。

实施例2

(1)消除水产品革兰氏阳性致病菌的微生物制剂的制备

制备过程同实施例1步骤(2)，区别仅在于加入生理盐水重新悬浮蛭弧菌沉淀物，蛭弧菌BDS01菌液和蛭弧菌BDS02菌液的浓度分别为10¹⁰pfu/mL，将蛭弧菌BDS01菌液和蛭弧菌BDS02菌液按细菌数1∶1混合，得到微生物制剂。

(2)将微生物制剂用于消除水产品食用前的革兰氏阳性致病菌

①制备水产品所含的革兰氏阳性致病菌液

结核分枝杆菌(Mycobacteriμm tuberculosis ATCC607，购于中国普通微生物菌种保藏中心)，用液体培养基(取嫩椰子汁经过棉纱布垫过滤后，再通过Whatmann 1号滤纸过滤，每80mL嫩椰子汁滤液加入20mL马血清和5mL甘油，再加苯甲青霉素至混合液中，使培养基中苯甲青霉素最后浓度达到100IU/mL，混合液再经0.22um醋酸纤维素膜过滤)摇床培养，160rpm 37℃培养7d。星状诺卡氏菌(Nocardia asteroids ATCC19247，购于广东省微生物菌种保藏中心)用ISP-2培养基(酵母提取物4g，麦芽提取物10g，葡萄糖4g，蒸馏水1000mL，pH7.3)摇床培养，160rpm 28℃培养7d。粪链球菌(Streptococcus faecalisATCC29212，购于广东省微生物菌种保藏中心)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC12228，购于广东省微生物菌种保藏中心)分别用普通营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.4)摇床培养，160rpm 28℃培养36h。产气荚膜梭菌(Clostridiμmperfringens ATCC13124)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis ATCC4277)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriμm glutamicμm ATCC13032)的培养同实施例1步骤(3)①。上述各菌的培养液分别经6000rpm、4℃离心20min，弃上清液，沉淀菌体用DNB液体培养基重新悬浮，分别调整各自浓度为10⁹cfu/mL。将上述菌按相同比例混合，得到水产品革兰氏阳性致病菌液。

②将微生物制剂用于消除水产品食用前的革兰氏阳性致病菌

实验方法同实施例1步骤(3)②，微生物试剂的使用中，蛭弧菌的终浓度也与实施例1步骤(3)②相同。培养72小时后，取1000ml水样，用0.22um滤膜(Millipore)过滤浓缩细菌，然后在用10ml无菌水洗下滤膜上的菌体，再按10倍稀释法稀释，最后从每个稀释梯度样品中吸取0.2mL的水样涂平板进行检测。做三个平行样检测。

结核分枝杆菌的检测采用Middlebrook 7H10(Difco，DISEASES OFAQUATIC ORGANISMS，Vol.61：41-51，2004)的复合琼脂培养基选择培养，星状诺卡氏菌的检测采用含氯霉素的沙氏葡萄糖培养基(蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂粉11g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000mL，pH 6.0±0.2)选择培养，粪链球菌的检测采用KF链球菌琼脂(蛋白胨10g，酵母粉10g，NaCl 5g，甘油磷酸钠10g，麦芽糖20g，乳糖1.0g，叠氮化钠0.15g，溴甲酚紫0.015g，琼脂20g，pH 7.2)选择培养，表皮葡萄球菌的检测采用甘露醇高盐琼脂平板(牛肉浸出粉1g，多价胨10g，氯化钠75g，甘露醇10g，酚红0.025g，琼脂12g，蒸馏水1000mL，PH 7.4±0.2)选择培养。产气荚膜梭菌的检测采用强化梭菌琼脂选择培养，红串红球菌的检测采用加入丁二酸(1％W/V)的改良Raymond培养基选择培养，谷氨酸棒状杆菌的检测采用CLED培养基选择培养。计算活菌数。

如图5，不加蛭弧菌时，革兰氏阳性菌总浓度有一定的增加；加入蛭弧菌后，革兰氏阳性菌总浓度均减少。当蛭弧菌使用终浓度浓度为10⁴pfu/mL、10⁶pfu/mL、10⁸pfu/mL时，微生物制剂作用于食用罗非鱼、南美白对虾、河蚬和大闸蟹，72小时后革兰氏阳性菌总浓度的消除率分别为99.90％、99.95％和99.98％。

实施例3

将只含有蛭弧菌BDS02的微生物制剂用于消除水产品运输过程中的革兰氏阳性致病菌，具体过程如下：

试验容器、试验用水和试验所用罗非鱼、南美白对虾、河蚬、大闸蟹规格均同实施例1。每个水族箱内放4只完好的网格，在每一个网格中分别放入罗非鱼、南美白对虾、河蚬及大闸蟹，封好网格盖子后立即把它平放到水族箱中，排出箱内多余用水，使其水位刚好盖过网格。在实验前经二氯异腈尿酸钠消毒，水温为26℃。实验期间用水连续充气。3个水族箱作为对照组，仅加入实施例1步骤(3)①制备的水产品革兰氏阳性致病菌液，终浓度为1×10⁴cfu/mL。试验组中，3个水族箱为一组，共四组，除了致病菌加入与对照组一样外，还分别加入实施例1制备的微生物制剂，使用的蛭弧菌终浓度分别达到10³pfu/mL、10⁴pfu/mL、10⁵pfu/mL、10⁶pfu/mL。培养72小时后，取1000ml水样，用0.22um滤膜(Millipore)过滤浓缩细菌，然后在用10ml无菌水洗下滤膜上的菌体，再按10倍稀释法稀释，最后从每个稀释梯度样品中吸取0.2mL的水样涂平板进行检测。做三个平行样检测。

产气荚膜梭菌(Clostridiμm perfringens ATCC13124)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis ATCC4277)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriμmglutamicμm ATCC13032)的检测方法同实施例1，进行活菌计数。

消除试验效果如图6～8所示。图6～8为试验系列中蛭弧菌终浓度分别为10³pfu/mL、10⁴pfu/mL、10⁵pfu/mL和10⁶pfu/mL时产气荚膜梭菌、红串红球菌和谷氨酸棒状杆菌各自浓度的对数值。所有数据均为三个平行样(水族箱)的平均值。当蛭弧菌BDS02浓度为10³pfu/mL时，对产气荚膜梭菌、红串红球菌及谷氨酸棒状杆菌的消除率分别为96.84％、96.02％和94.99％。

实验结果表明，蛭弧菌BDS02能有效消除革兰氏阳性菌。将只含有蛭弧菌BDS02的微生物制剂用于消除水产品运输过程中的革兰氏阳性致病菌，蛭弧菌使用终浓度为10³～10⁶pfu/mL时，革兰氏阳性菌浓度均保持下降趋势。随着蛭弧菌BDS02使用浓度的增大，革兰氏阳性菌的消除率越大。

实施例4

将含有蛭弧菌BDS02和BDS01的微生物制剂用于消除水产品运输过程中的革兰氏阳性致病菌，具体过程如下：

实验方法同实施例3，区别仅在于所用的微生物制剂和水产品革兰氏阳性致病菌分别为实施例2制备的微生物制剂和水产品革兰氏阳性致病菌。

72小时后，采用实施例2的方法进行检测，计算活菌数目。

由图9可知，与对照系相比较，试验系列中革兰氏阳性菌总浓度均保持下降趋势。当蛭弧菌使用终浓度浓度分别为10³pfu/mL、10⁴pfu/mL、10⁵pfu/mL、10⁶pfu/mL时，微生物制剂在罗非鱼、南美白对虾、河蚬和大闸蟹的运输过程中对革兰氏阳性菌总浓度的消除率分别为99.80％、99.87％、99.92％和99.95％。

实施例5

将含有蛭弧菌BDS02的微生物制剂用于消除水产品养殖过程中的革兰氏阳性致病菌，具体过程如下：

试验前，临时建造12个养殖水池(0.5m×0.5m×0.5m＝125L)。将养殖水池分为试验组和对照组。试验用水为不过滤的养殖淡水，每个水池注入100L。养殖水池在实验前经二氯异腈尿酸钠消毒，试验期间水温为26℃，每个水池放罗非鱼、南美白对虾、河蚬及大闸蟹各20只，每日早晚各投饵一次。试验所用罗非鱼、南美白对虾、河蚬、大闸蟹规格均同实施例1。3个水池为对照组，仅加入实施例1步骤(3)①制备的水产品革兰氏阳性致病菌液，终浓度为1×10⁴cfu/mL。试验组中，3个水池为一组，除了致病菌加入与对照组一样外，还分别加入实施例1制备的微生物制剂，使用的蛭弧菌终浓度分别达到10²pfu/mL、10³pfu/mL、10⁴pfu/mL和10⁵pfu/mL。

72小时后，采用实施例1的方法进行检测，计算活菌数目。

消除试验效果如图10～12所示。图10～12为试验系列中蛭弧菌终浓度分别为10²pfu/mL、10³pfu/mL、10⁴pfu/mL和10⁵pfu/mL时产气荚膜梭菌、红串红球菌和谷氨酸棒状杆菌各自浓度的对数值，所有数据均为三个平行样(养殖水池)的平均值。当蛭弧菌BDS02的浓度为10²pfu/mL时，对产气荚膜梭菌、红串红球菌及谷氨酸棒状杆菌的消除率分别为94.99％、92.05％和90.00％。

实验结果表明，蛭弧菌BDS02能有效消除革兰氏阳性菌。将只含有蛭弧菌BDS02的微生物制剂用于消除水产品养殖过程中的革兰氏阳性致病菌，蛭弧菌使用终浓度为10²～10⁵pfu/mL时，革兰氏阳性菌浓度均保持下降趋势。随着蛭弧菌BDS02使用浓度的增大，革兰氏阳性菌的消除率越大。

实施例6

将微生物制剂用于消除水产品养殖过程中的革兰氏阳性致病菌，具体过程如下：

实验方法同实施例5，区别仅在于所用的微生物制剂和水产品革兰氏阳性致病菌分别为实施例2制备的微生物制剂和水产品革兰氏阳性致病菌。

72小时后，采用实施例2的方法进行检测，计算活菌数目。

消除试验效果如图13所示，所有数据均为三个平行样(养殖水池)的平均值。

由图13可知，与对照组相比较，试验系列中革兰氏阳性菌总浓度均保持下降趋势。蛭弧菌使用终浓度为10²pfu/mL、10³pfu/mL、10⁴pfu/mL和10⁵pfu/mL，革兰氏阳性菌的消除率分别为99.00％，99.60％，99.75％和99.87％。2株蛭弧菌联用，能明显消除养殖水体中的革兰氏阳性菌的浓度，保证了淡水养殖过程中水产品的健康生长。

实施例7

将微生物制剂用于消除淡水养殖水体中的致病菌，具体过程如下：

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.193)及大肠杆菌(Escherichia coli，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.42)分别用用普通营养肉汤培养基摇床培养，160rpm 28℃培养12h。培养液分别于4℃6000rpm离心20min，弃上清液，沉淀菌体用无菌蒸馏水重新悬浮，再将这些沉淀菌体混合，并使其终浓度分别达到1×105cfu/mL。嗜水气单胞菌的检测采用RimLer-shotts选择性培养基(L-盐酸鸟氨酸0.05％w/v，L-盐酸鸟氨酸0.65％w/v，麦芽糖0.35％w/v，次亚硫酸钠0.68％w/v，L-半脱氨酸盐酸盐0.03％w/v，溴百里酚蓝0.003％w/v，枸橼酸铁铵0.08％w/v，脱氧胆酸钠0.1％w/v，新生霉素0.0005％w/v，酵母抽提物0.3％w/v，氯化钠0.5％w/v，琼脂1.35％w/v，pH7.0)，恶臭假单胞菌的检测采用NMS选择性培养基(KH₂PO₄ 0.58g/l；Na₂HPO₄·12H₂O 2.17g/l；NaNO₂ 0.85g/l；K₂SO₄0.17g/l；MgSO₄·7H₂O 0.037g/l；FeSO₄·7H₂O 0.012g/l；微量元素溶液2mL，pH7.0)，迟缓爱德华菌(请提供菌株和来源，是多出的菌株？)的检测采用HE选择性琼脂培养基(脉胨12g，牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水杨素2g，胆盐20g氯化钠5g，溶于400mL蒸馏水，加入20mL甲液(硫代硫酸钠34g，柠檬酸铁铵4g，蒸馏水100mL)，20mL乙液(去氧胆酸钠10g，蒸馏水100mL)，0.4％溴麝香草酚蓝溶液16mL，Andrade指示剂20mL(酸性复红0.5g，1mol/L氢氧化钠溶液16mL，蒸馏100mL，将复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1～2mL，pH7.5，再与琼脂混合)，大肠杆菌的检测采用TBX(一种显色培养基)选择性琼脂培养基。

将革兰氏阴性致病菌与步骤(2)制备的革兰氏阳性致病菌按1∶1，得到淡水养殖水体中的致病菌。

实施例2制备的微生物制剂消除淡水养殖水体中的致病菌实验的实验方法同实施例6，区别仅在于所用的致病菌为本实例制备的致病菌。

72小时后，进行活菌计数。

对养殖水体中革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌的消除试验的效果如图14所示。所有数据均为三个平行样(养殖水池)的平均值。

如图14，不加蛭弧菌时，养殖水体中的致病菌浓度有一定的增加；当加入浓度为10²pfu/mL蛭弧菌时，致病菌的浓度最初为1×10⁵cfu/mL，到72h时，致病菌的浓度还不到100cfu/mL。可知这2株蛭弧菌合用能很好的控制养殖水体中革兰氏阳性及革兰氏阴性致病菌的浓度。蛭弧菌发使用浓度为10²～10⁵pfu/mL，蛭弧菌浓度越大，消除致病菌的效果就越好。在淡水养殖水体中加入所述的微生物制剂，既能全面预防各种病害，同时又保证了水产品的优质。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>华南理工大学

<120>一种消除水产品革兰氏阳性致病菌的蛭弧菌菌株及其应用

<130>8

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1835

<212>DNA

<213>蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)

<400>1

caggcctaac acatgcaagt cgaacggggt agcaatacct agtggcgcac gggtgagtaa   60

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