嗜中性活性肽2(72)作为原发性肝癌标志物及其应用

摘要

本发明公开了一种嗜中性活性肽2(72)(Neutrophil－activating peptide2(72))作为原发性肝癌标志物及其应用，所述嗜中性活性肽2(72)存在于人的血清和肝癌组织中，为血小板碱性蛋白(Platelet basic protein)在胞外被胰酶酶切后，形成11条肽链的其中一条，分子量为7789道尔顿；在原发性肝癌病人的血清和组织中嗜中性活性肽2(72)表达明显升高。可利用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定肝癌患者血清嗜中性活性肽2(72)的含量，用免疫组化的方法检测肝癌组织中嗜中性活性肽2(72)的表达，用实时荧光定量PCR检测NAP－2(72)mRNA在肝癌SMMC－7721细胞株中的表达水平，以此作为肝癌检测的辅助指标。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种多肽标志物的应用，具体为一种嗜中性活性肽2(72)作为原发性肝癌血清标志物及其应用。

背景技术

原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma，以下简称肝癌)是世界上流行最广的恶性肿瘤之一，国际癌症研究中心(IARC)估计，2000年全球肝癌发病56.4万人，肝癌死亡54.9万人。而我国由于肝炎和肝炎转肝硬化的病人众多，致使肝癌在我国的发病率和死亡率均高于世界平均水平。与70年代比较，中国肝癌死亡率水平有了较大幅度的增高，与世界其他国家相比，我国肝癌死亡率位居各国肝癌死亡率之首。原发性肝癌是一种恶性程度高、进展快、预后差、侵袭性强的恶性肿瘤。早期一般无明显症状，一旦出现临床表现，病情大多已届入中、晚期。因此为降低其发病率和死亡率，诸多学者长期致力于防治肝癌的研究。近几十年来，肝癌的临床诊治及基础研究均取得了丰硕成果，但其总体预后并未得到显著改善，难以明确诊断而失去手术的时机是重要的原因之一。

目前图像检测(包括CT，MRI)、化学检测(血清学和免疫学)及细胞组织学检测是癌症诊断的三大支柱。常规的肝癌诊断主要为：血清AFP检测，肝脏B超检查或磁共振检查，肝动脉造影，肝穿刺活组织检查，外科手术活检或冰冻切片检查等。其中AFP已成为最有价值的肝癌标志物，多年以来一直作为诊断肝癌的重要参考依据。但是30％-40％的肝癌病人的AFP阴性，常使临床的早期诊断遇到这两种情况：一是APP浓度高于正常(20μg/L)但不达到诊断肝癌的标准(400μg/L)，如若影像诊断未有肝内占位性病变发现，则可能被视为活动性肝病，长期门诊随访，而坐失根治良机。二是AFP阴性病例，实时超声出现可疑占位性病变而无法定性，对这类病人进一步再作CT、磁共振成像、放射性核素扫描等检测，往往众说纷纭，结论不一，因而延误了肝癌的诊断。为此近年来提倡多种标志物联合检测以提高肝癌检测的灵敏度和特异度，但多项指标组合在提高肝癌诊断敏感性的同时，降低了其诊断的特异性及准确性，多种标志物联合检测的应用也具有了一定的局限性。因此，寻找有效的肿瘤标志物用于癌变机理研究、药物靶标的设计、肿瘤的诊断及高危人群的筛查成为肝癌研究的当务之急。

为了更快速、简便、直接检测在异源样品中大量的蛋白质，Hutchins和Yip提出了一种新的质谱技术表面增强激光解吸/电离时间飞行质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry，SELDI-TOF-MS)，这一技术为从蛋白质组学的角度研究肿瘤，寻找特异、灵敏的标志物提供了优良的技术平台。应用SELDI-TOF-MS技术目前已在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等研究中成功找到多个新的肿瘤标志物，并由此建立了一些检测恶性肿瘤的方法。进一步通过色谱纯化，SDS-PAGE凝胶电泳，胰酶消化，MALDI分析肽谱或MS/MS检测出部分序列，再通过网上比对可鉴定出部分蛋白标志物。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜中性活性肽2(72)在原发性肝癌检测中的应用。

高效液相色谱串联质谱技术鉴定原发性肝癌血清标本在7.7kDa位置蛋白为嗜中性活性肽2(72)(Neutrophil-activating peptide 2(72))，它存在于人的血清和肝癌组织中，为血小板碱性蛋白(Platelet basic protein)在胞外被胰酶酶切后，形成11条肽链的其中一条，分子量为7789道尔顿，由72个氨基酸组成，在原发性肝癌病人的血清和组织中嗜中性活性肽2(72)表达明显升高。

嗜中性活性肽2(72)在原发性肝癌检测中的应用，用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定肝癌患者血清嗜中性活性肽2(72)的含量，用免疫组化的方法检测肝癌组织中嗜中性活性肽2(72)的表达，用实时荧光定量PCR检测NAP-2(72)mRNA在肝癌细胞株中的表达水平。

利用嗜中性活性肽2(72)对肝癌的检测具体通过以下方案实现：

(1)用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定原发性肝癌患者与健康的血清标本的7.7-7.9kDa位置蛋白的差异图谱。

(2)利用高效液相色谱串联质谱技术鉴定7.7kDa位置蛋白为嗜中性活性肽2(72)。

(3)用相应的抗体进行免疫沉淀实验验证7.7kDa位置蛋白为嗜中性活性肽2(72)。

本发明利用弱阳离子(WCX2)芯片检测原发性肝癌患者与健康人对照样本，发现原发性肝癌血清样本在7.7kDa位置蛋白表达水平明显高于健康对照样本。选择在SELDI检测中7.7kDa位置蛋白高表达的肝癌病人血清，运用Blue 3GA和Protein A去除血清中的白蛋白和IgG，将去除白蛋白和IgG的血清样品与样品缓冲液混匀后，Tricine-SDS-PAGE电泳，将凝胶目的蛋白条带用1.5mm切胶笔切下，置于离心管中，脱色后进行胶内酶解。将酶解好的样品用C18反相柱进行分离后，直接串联质谱检测，质谱打击条件为ESI喷雾电压3.2kV，ION TRAP碰撞能量35％。将质谱检测到的肽段的质量和序列在蛋白质数据库SWlSS-PROT/TrAEM-BL上进行搜索比较，获取可信的完整蛋白。确定蛋白质一级序列后制备相应的多克隆抗体，并用抗体与目的蛋白高表达的样本结合，再用质谱检测以验证7.7kDa位置蛋白为嗜中性活性肽2(72)。

本发明应用SELDI质谱仪，高效液相色谱串联质谱技术等，首次发现嗜中性活性肽2(72)可用于肝癌的检测，为原发性肝癌的发现和检测提供了新的标志物，对进一步提高目前原发性肝癌的诊治水平具有一定的意义。

附图说明

图1为SELDI检测嗜中性活性肽2(72)在肝癌中高表达，上为肝癌病人血清，下为正常对照血清。

图2为SELDI检测免疫沉淀实验，图2中的①为未加抗体的肝癌血清中嗜中性活性肽2(72)高表达，②为与相应抗体反应过后的血清，嗜中性活性肽2(72)水平明显下降。

图3为嗜中性活性肽2(72)在肝癌组织中的表达，A为肝癌组织NAP-2阳性表达，箭头所指为阳性表达的肝癌细胞，B为癌旁组织NAP-2阴性表达。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1

肝癌相关血清标志物的鉴定

分离用的样本为1ml肝癌病人血清。运用Blue 3GA和Protein A去除血清中的白蛋白和IgG，配制Tricine-SDS-PAGE分离胶、间隙胶和浓缩胶，将去除白蛋白和IgG的血清样品与样品缓冲液混匀后，煮沸5min，上样，使用垂直小电泳槽进行电泳，40V约1.5h，当样品进入分离胶时，电压升至60V约1.5h，电泳结束后，考马斯亮染色1h，双蒸水洗净胶面直到背景清晰，将凝胶目的蛋白条带用1.5mm切胶笔切下，置于离心管中，脱色后进行胶内酶解，将酶解好的样品用C18反相柱进行分离后，直接高效液相串联质谱检测，质谱打击条件为ESI喷雾电压3.2kV，ION TRAP碰撞能量35％。将质谱检测到的肽段的质量和序列在蛋白质数据库SWlSS-PROT/TrAEM-BL上进行搜索比较，获取可信的完整蛋白。把各完整蛋白的分子量、等电点和可能被剪切成的肽链与目的蛋白进行比较，选择可能与目的蛋白对应的完整蛋白或其肽链进行基因和蛋白质水平的分析。确定蛋白质一级序列后制备相应的抗体，并用抗体与高表达样本结合，将相应的蛋白质结合掉再用SELDI质谱检测以验证结果。

质谱结果在蛋白质数据库SWlSS-PROT/TrAEMBL上进行搜索比较发现，检测到的一个肽段(MW＝1101.29Da，序列为NIQSLEVIGK或Asn Ile Gln Ser LeuGlu Val Ile Gly Lys)与嗜中性活性肽2(Neutrophil-activating peptide2)的一个肽段MW＝1100.6310Da，序列相符合，且这一肽链的分子量与SDS-PAGE电泳测定的分子量也基本吻合。因此，根据肽链的分子量和等电点范围进行推测，嗜中性活性肽2(72)可能和目的蛋白7789Da(pI＞4)的氨基酸序列相同。其完整序列如序列表中所示。

用相应的兔抗人抗体与人肝癌血清样本反应后经SELDI检测7.7kDa这个峰明显消失，如图2所示。

实施例2

嗜中性活性肽2(72)在肝癌和对照样本中的差异表达

从-80℃冰箱中取出血清样品，置冰盒上溶解，以10000rpm，4℃离心5min，取血清10μl，加入2倍体积U9缓冲液(含DTT)稀释。稀释时注意不要用移液器反复吹吸，避免产生大量气泡，用手指轻敲样品管底部或震荡器，将样品充分混匀。取以上样品冰浴300rpm震荡30min或每隔5分钟用手指轻弹混匀一次，将30μl上述变性后样品加入50mM NaAC，pH4.0的结合缓冲液360μl，使得血清的总稀释倍数达到约40倍。尽快混匀，避免蛋白质变性产生沉淀和气泡产生。

小心取出WCX2芯片，将芯片装入生物芯片处理器(Bioprocessor)，每孔加入50mM NaAC，pH4.0的结合缓冲液200μl，置振荡器300rpm震荡5min，甩掉缓冲液。重复上述操作一次。在芯片处理器每孔中加入100μl处理好的样品，置振荡器300rpm，室温震荡1小时。甩弃样品或将样品甩入预装消毒剂的容器。每孔加入50mM NaAc，pH4.0的结合缓冲液200μl，室温置振荡器300rpm震荡5min，甩去孔中液体，注意不要甩得太干，再次加入结合缓冲液200μl，重复操作一次。每孔加入1mM，pH 4.0的HEPES 200μl，然后立刻甩出。立刻拆开芯片处理器，取出芯片后，待干后，在每个加样孔上加SPA0.5μl，待干后，重复加SPA0.5μl一次。自然干燥待干，上机测定。

采用PBS 11-c型蛋白芯片阅读仪读取芯片信息。用加有标准蛋白质的All-in-one芯片校正仪器，使分子量偏差至0.1％范围内。芯片阅读仪参数设置如下：激光强度185，检测灵敏度8，优化范围2000-10000Da，最高分子量50000Da，芯片上的每个点采集130次。用Ciphergen ProteinChip 3.2软件采集数据，所有原始数据先用Proteinchip Software 3.2做校正总离子强度及分子量的均一，将所有样本2000m/z以上的质荷比峰，用Proteinchip Software3.2的biomark wizard过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，第二次的噪音过滤值为2，以10％为最小阈值进行聚类。

嗜中性活性肽2(72)在肝癌患者和健康人中的差异表达结果如下：7789Da在原发性肝癌病人血清中的表达量为21.662616±9.007951，在正常对照人群血清中的表达量为8.8290885±6.779427(P＜0.05)。嗜中性活性肽2(72)在肝癌病人血清中表达显著高于正常对照人群。

实施例3

嗜中性活性肽2(72)在肝癌组织中的表达

肝癌组织和对应的癌旁组织标本30例，均系07年1月至08年1月期间在广西医科大学第一附属医院肝胆外科住院患者。所有患者均经肝切除术，术前未接受化疗、放疗和/或其他抗肿瘤治疗，术后病理检查证实为原发性肝细胞癌。标本均采用中性福尔马林固定，石蜡包埋。

兔抗人NAP-2多克隆抗体(加拿大Immunechem Pharmaceuticals，INC)，羊抗兔HRP标记二抗(广西南宁中加生物免疫科技公司)，DAB试剂盒(福州迈新公司)，人肝癌细胞株SMCC-7721和人肝正常细胞株HL-7702由广西医科大学医学科学实验中心肿瘤实验室提供。

肝癌组织和对应的癌旁组织蜡块4μm厚连续切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，用柠檬酸盐高温修复法修复抗原，用3％过氧化氢处理20min后加正常羊血清封闭15min，滴加1∶3000稀释的抗NAP-2抗体，免疫湿盒内4℃过夜。滴加HRP标记羊抗兔二体置37℃30min，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作空白对照。结果判定：以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性标志，分4个级别。分级标准：胞核阳性率＜5％为阴性(-)，6％～40％胞核阳性率为弱阳性(+)，41％～70％胞核阳性率为阳性(++)，71％～100％胞核阳性率为强阳性(+++)。实验结果采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，以卡方检验比较计数资料间的显著性差异。

结果：NAP-2在肝癌细胞中呈强阳性表达，但在癌旁细胞中呈弱阳性或阴性表达。阳性细胞以黄色、棕黄色及棕褐色细颗粒均匀着色，NAP-2表达主要定位于细胞核(图3)。肝癌组织中NAP-2表达阳性率为100％(30/30)，其中63.3％(19/30)表达为强阳性。癌旁组织NAP-2表达与肝癌组织比较，癌旁组织NAP-2表达阳性率及表达程度与肝癌组织有明显差别(x²＝15，p＜0.01)

实施例4

嗜中性活性肽2(72)基因mRNA在肝癌SMMC-7721细胞株中的表达

根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)所提供的Enrtez核酸数据库中检索到的人源NAP-2基因和内参看家基因β-actin的完整cDNA序列，应用oligo6.0软件进行引物设计，然后将引物输入BLAST数据库比较序列同源性，最终得到特异性引物序列及PCR产物片段长度。所有的引物合成由大连宝生物生物工程有限公司合成。扩增NAP-2基因的引物为：P1 5’GTGACTTGTATGCTGAACTCC3’，P2 5’TGGCAGAAACAGAA CAAAT 3’，扩增产物218bp。扩增β-actin的引物为：P1 5’CGGGAAATCGTGCGTGAC 3’，P2：5’GGAAATGA GGGCAGGACTTAG3’，扩增产物275bp。

肝癌7721细胞和正常肝细胞7702两株细胞长满250ml培养瓶后，用PBS洗3遍后，每瓶加入8mlTrizol试剂，轻摇几次，室温静置5分钟。转移裂解液于15ml离心管中，按每1mlTrizol加0.2ml氯仿的比例加入氯仿1.6ml，剧烈震荡15秒，室温静置3分钟，12000g，低温离心15分钟。转移水相于另一离心管中，加入异丙醇4ml，室温静置10分钟，12000g，低温离心10分钟。弃上清，用75％酒精洗3次，每次8ml，7500g低温离心5分钟。干燥RNA沉淀，用DEPC水溶解。检测RNA纯度和完整性。

按如下条件进行逆转录PCR反应：Total RNA 1-5μg，Oligo(dT)182μl，dNTP Mixture(10mM)2μl，Rnase Free dH208μl，70℃5min，冰浴2min。加入5×reaction Buffer 4μl，DTT(0.1M)1μl，TIANScript M-MLV1μl，42℃50min，95℃5min。

按如下条件进行Real-time PCR反应：反应体系包括SYBR 10μl，ROX0.4μl，上下引物各0.4μl，cDNA 2μl，ddH₂O 6.8μl。95℃1min后进入循环，95℃5S，60℃25S，72℃15S，共进行40个循环。荧光定量PCR的结果以Ct值显示。实时荧光定量PCR中每个样本重复2次，取Ct值的平均值。采用Comparative Delta-delta Ct法(2ΔΔCt)比较各基因表达的差异：ΔCt值＝目的基因Ct值-内参基因Ct值；ΔΔCt值＝目的基因ΔCt值-内参基因ΔCt值；以对照组表达量为1，2ΔΔCt值即为目的基因较正常段基因表达的倍数。

结果：处理样品的待测基因SMMC-7721临界循环值的均数Ct1＝26.036，处理样品持家基因SMMC-7721β-actin临界循环值的均数Ct2＝21.476，对照样品待测基因7702待测基因的临界循环值的均数Ct3＝29.675，7702β-actin对照样品持家基因的临界循环值的均数Ct4＝22.3135。

ΔΔCt＝(26.036-21.476)-(29.675-22.3135)＝4.56-7.3615＝-2.8015

Folds＝2^-ΔΔCt＝2^-(-2.8015)＝2^2.8015＝6.9716，即NAP-2(72)的mRNA在SMMC-7721肝癌细胞的表达水平相对于HL-7702正常肝细胞上调了将近7倍。

SEQUENCE LISTING

<110>广西医科大学

<120>嗜中性活性肽2(72)作为原发性肝癌标志物及其应用

<130>123

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>72

<212>PRT

<213>人类

<400>1

Asp Leu Tyr Ala Glu Leu Arg Cys Met Cys Ile Lys Thr Thr Ser Gly

1               5                   10                  15

Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Leu Glu Val Ile Gly Lys Gly Thr

            20                  25                  30

His Cys Asn Gln Val Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asp Gly Arg Lys

        35                  40                  45

Ile Cys Leu Asp Pro Asp Ala Pro Arg Ile Lys Lys Ile Val Gln Lys

    50                  55                  60

Lys Leu Ala Gly Asp Glu Ser Ala

65                  70