从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法

摘要

本发明提供一种从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，用一种简易的方法，可以从木霉发酵产生的酶系中有效的将果胶酶和纤维素酶分开，而且产率非常高。本发明提供的从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，包括：将木霉进行发酵制成发酵粗酶液和用含三价铁离子的盐将果胶酶和纤维素酶分开的工序。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，特别涉及一种从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法。

背景技术

木霉中的里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种重要的产纤维素酶的工业用菌种，在其分泌的酶系中包括了纤维素酶、果胶酶等组分。其中，纤维素酶常被用于棉料服装的酶洗，使用纤维素酶进行酶洗的服装，其质地柔软，可以产生独特的花纹。另外，纤维素酶还被用于纤维素生产燃料乙醇等。而酶系中的果胶酶在果汁澄清、麻料服装的酶洗等领域具有广泛的应用。因此，将里氏木霉产生的纤维素酶和果胶酶用简易的方法分离浓缩，具有很强的实用意义。

在中国专利申请200810137395.4中，虽然公开了一种由里氏木霉液体发酵产生纤维素酶和果胶酶等复合酶的方法，但是，在该文献中并没有公开如何分离其中的果胶酶和纤维素酶并浓缩的方法。

传统的酶和酶的分离方法有膜浓缩、薄膜蒸发、盐析等方法。但是，膜浓缩法容易产生膜的堵塞，而且由于这两种酶分别由不同分子量的多种蛋白质组成，因此，很难选用合适的膜孔尺寸进行分离，容易造成顾此失彼。对于薄膜蒸发虽然可以使酶液得到有效的浓缩，但是却不能将本发明所说的纤维素酶和果胶酶分开，如果想要将纤维素酶和果胶酶分开需要蒸汽等热源，耗能较大。而盐析一般要消耗大量的无机盐(如硫酸铵等)，对大规模的制备工艺来说，盐的回收成本高，极易引起环境污染。

发明内容

因此，在现有技术中还没有一种合理、且有效的将里氏木霉的液体发酵中产生的纤维素酶和果胶酶分离的方法。

本发明为鉴于上述问题而完成的发明，其目的在于提供一种从里氏木霉的液体发酵物中分离纤维素酶和果胶酶的方法，通过加入含三价铁离子的盐使木霉发酵液的酶系中的果胶酶和纤维素酶分离。

本发明为达到上述目的，提供一种从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，向木霉发酵制成的发酵粗酶液加入含三价铁离子的盐，使果胶酶和纤维素酶分离。

本发明的从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，其中，相对于发酵粗酶液总体积，所述含三价铁离子的盐的加入量为使其终浓度为10-100mM。

另外，本发明的从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，其中，相对于发酵粗酶液总体积，所述含三价铁离子的盐的加入量为使其终浓度为10-30mM。

本发明的从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，其中，所述含三价铁离子的盐为选自以下组成的组中的一种或多种：硫酸铁，三氯化铁，硝酸铁，磷酸铁、碳酸铁，特别优选为三氯化铁。

本发明的从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，其中，在加入含三价铁离子的盐之前，进一步包括对所述发酵粗酶液的预处理工序，即：调节发酵粗酶液的pH为4.0-7.0，基于该发酵粗酶液的总量，加入0.05-2.0重量％的钙盐后，固液分离，将得到的上清液作为要进行下一步加工的发酵粗酶液。

另外，本发明的从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，其中，在使果胶酶和纤维素酶分离之后，进一步包括重悬果胶酶的工序，即：向分离后的含果胶酶的固相中加入重悬液，使该固相再溶解得到浓缩果胶酶液，优选该重悬液含有使铁离子络合的络合剂，该重悬液的体积是发酵粗酶总液体积的5-50％。

本发明的从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，其中，在使果胶酶和纤维素酶分离之后，进一步包括提纯纤维素酶的工序，即，将使果胶酶和纤维素酶分离所得到的液相，加入锌盐进行沉淀，收集沉淀物，任选地向沉淀物中加入重悬液，使该沉淀物再溶解得到浓缩纤维素酶液，优选该重悬液含有锌盐络合的络合剂，其体积是发酵粗酶总液体积的3-50％。

本发明的从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，其中，调节所述液相的pH为6.0-7.5后，再加入锌盐。

本发明的从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，其中，所述络合剂为柠檬酸钠溶液。

本发明的从木霉复合酶中分离浓缩果胶酶和纤维素酶的方法，其中，所述重悬液是pH为4.5-6.0，浓度为0.1-1.0M的柠檬酸钠溶液。

由本发明的分离方法，可以比较简单的从木霉复合酶中有效的分离出浓缩果胶酶和纤维素酶，比以往的酶分离方法相比，具有较高的果胶酶和纤维素酶收率。

具体实施方式

本发明者对如何从木霉复合酶中分离果胶酶和纤维素酶进行了广泛深入的研究，发现在发酵粗酶液中加入含三价铁的盐，可以使果胶酶和纤维素酶分离，从而完成了本发明。

本发明优选用产纤维素酶和果胶酶活力较高的里氏木霉为生产菌种，以麸皮、稻草粉等在发酵罐中制得富含纤维素酶和果胶酶的发酵粗酶液；将此粗酶液经过发酵液预处理；加入含三价铁的盐使果胶酶和纤维素酶分离；然后经过果胶酶沉淀与离心分离、纤维素酶沉淀与离心分离、酶液提纯等步骤可以制得高活力的浓缩纤维素酶液和果胶酶液。

在以下的实施方式中，具体的说明分离方法。

首先，对于木霉的菌种培养可以为常规的液体培养和固体培养两种。对于固体培养是将含有大量绿色孢子的木霉斜面菌种在无菌生理盐水中制成孢子悬液，接入固体菌种培养基中而进行培养。而液体培养则是将木霉的菌种在盛有以麸皮、稻草粉为主，另外，还含有使菌种生长的微量元素的无菌培养基的发酵罐中进行培养。

该培养条件为28℃、通过通风调节和转速调节控制溶氧在5-30％，培养72小时后，制得发酵粗酶液。该通风一般控制为每升发酵液每分钟的通气量为2升，转速随溶氧电极测定的发酵液中的溶解氧水平而定，一般开始设定转速为50转/分，溶氧下降到约15％时，将搅拌转速提高50转/分，到100转/分，使得发酵溶解氧尽可能控制在以上所述的5-30％的范围内，直到发酵反应结束。

该发酵粗酶液的生产方法可以是现有的任何方法，只要该发酵粗酶液中含有含纤维素酶和果胶酶，即可利于本发明的方法进行分离。

对于该发酵粗酶液，进行果胶酶和纤维素酶的分离。该分离是通过加入含三价铁的盐而进行的，发明人经过潜心研究，发现该含三价铁的盐是一种非常有效的果胶酶沉淀剂，可以用于将果胶酶和纤维素酶高效分离。对于该含三价铁的盐可以举出，硫酸铁，三氯化铁，硝酸铁，磷酸铁、碳酸铁等，其中，优选为三氯化铁。

本发明通过用含三价铁的盐这样简单的方法，就可以将果胶酶和纤维素酶进行分离，该分离方法简单，易行，并且是一种有效的将果胶酶和纤维素酶分离的方法。将此含三价铁的盐可以直接加入到发酵粗酶液中，也可以配制成溶液后再加入，为了使混合更加均匀，优选使用该盐的水溶液。将该含三价铁的盐边搅拌边加入到发酵粗酶液中，相对于待分离的发酵酶液体积使其终浓度为10-100mM，优选为10-30mM。静置，一般1个小时后就可以见分层。可以采用任何固、液相分离设备进行分离，比如用喷嘴排渣碟式分离机进行固、液相的分离，为了提高最终产品的纯度，优选控制流出出口的清液的吸光度，使该OD₆₀₀控制为0.1以下(即，将清液在600纳米下，用光程为1厘米的比色杯测定其吸光度在0.1以下)。液相为含有纤维素酶的相，进入第5工序进行分离，而固相为含有果胶酶的相，进入下一个工序进行分离。

由于在发酵粗酶液中含有很多杂质，可能会影响果胶酶和纤维素酶的分离，进而影响最终产品的纯度，所以优选对发酵粗酶液进行预处理。优选的方法是将发酵粗酶液的pH调节至4.0-7.0，优选为6.0-6.5，然后，迅速加入0.05-2.0％(重量百分比)，优选为0.1-0.2％的钙盐。该钙盐可以举出醋酸钙、丙酸钙、氯化钙、乳酸钙等，优选为氯化钙。缓慢搅拌，使其溶解，静置，2小时以上，溶液产生分层。可以采用任何固、液相分离设备进行分离，比如用喷嘴排渣碟式分离机进行离心分离，优选控制上料的流速使清液出口收集的上清的吸光度OD₆₀₀小于0.1，收集上清液，完成发酵粗酶液的预处理。

对于果胶酶和纤维素酶分离后的固相将进入到本工序中，进行果胶酶的重悬，该工序主要为用使铁离子络合的络合剂来重悬果胶酶的工序。该络合剂只要是可以使铁离子络合的络合剂，就没有特别的限定，例如可以举出：EDTA及其盐类；EGTA及其盐类；草酸及其盐类；聚马来酸(PMA)；柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸镁等可易溶于水的柠檬酸盐等，其中，优选为可易溶于水的柠檬酸盐，更优选为柠檬酸钠。

在本工序中，首先，调节该络合剂的pH使其为4.5-6.0，制成浓度为0.1-1.0M的溶液，加入发酵液总体积的5％-50体积％的络合液，进行重悬，缓慢搅拌后可见沉淀变清。该溶液为浓缩果胶酶液，其总收率83％以上。

由此可见，由本发明的从木霉复合酶中分离果胶酶和纤维素酶的方法，可以简单、高效的将果胶酶和纤维素酶分离，得到较高收率的果胶酶。

该果胶酶酶活的测定是通过分光光度法来测定的，由于果胶酶分解果胶，产生带有还原性醛基的还原糖(半乳糖醛酸计)，而一些显色剂可与其发生显色反应，可以根据颜色的深浅不同，通过分光光度计来测定果胶酶的活力的大小，显色剂一般用3，5-二硝基水杨酸。

第5工序为纤维素酶的重悬的工序。首先，配制锌盐溶液，该锌盐溶液为一种沉淀剂，用于将纤维素酶沉淀分离。对于该锌盐溶液，只要是含有锌的盐溶液就没有特别的限定，例如可以举出氯化锌、硝酸锌、硫酸锌、醋酸锌、乳酸锌、丙酸锌、苹果酸锌等，其中，优选为硫酸锌。

用含三价铁的盐将果胶酶和纤维素酶分离而得到的含纤维素酶的液相缓慢调pH，使其pH为6.0-7.5，将此锌盐溶液边搅拌边加入到此液相中，相对于待浓缩的纤维素酶的体积而言使其终浓度达到20-30mM，静置，1个小时以上，见分层，可以采用任何固、液相分离设置进行分离，比如用喷嘴排渣碟式分离机将沉淀分离，优选控制流出出口的清液的吸光度，使该OD₆₀₀控制为0.1以下，收集沉淀物。

沉淀物用使锌盐络合的络合剂进行与工序4相同的重悬工序，加入pH为4.5-6.0，体积为发酵液总体积的3-50体积％，缓慢搅拌可见沉淀变清。该澄清液为浓缩纤维素酶液，总收率大约为69-74％。对于络合剂只要是使锌盐络合的络合剂，就没有特别的限定，例如可以举出：EDTA及其盐类；EGTA及其盐类；草酸及其盐类；聚马来酸(PMA)；柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸镁等可易溶于水的柠檬酸盐等，优选为可易溶于水的柠檬酸盐，更优选为柠檬酸钠。

纤维素酶活的测定是根据一定的温度和pH下，将纤维素底物(羧甲基纤维素钠)水解，释放出还原糖，在碱性、煮沸条件下，3，5-二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)的量成正比。通过在540nm下测其吸光度，可得到产生还原糖的量，从而计算出CMCA-DNS酶的活力。以此值代表纤维素酶的活力。按照国家标准(QB 2583-2003)纤维素酶制剂进行测定。

本发明的pH，在发酵过程中pH的控制用柠檬酸或氨水进行调节，而在分离过程中pH的调节可以使用醋酸或饱和碳酸钠溶液。

实施例

以下，基于实施例，进一步具体说明有关本发明。但是，本发明不限于以下的实施例。

实施例1

1.制备发酵粗酶液

在50升的发酵罐中，放入稻草粉3公斤、麸皮1公斤、七水硫酸镁0.01公斤、硫酸铵0.2公斤、磷酸二氢钾0.2公斤、马铃薯皮粉末1公斤、自来水40升、然后，用氨水调节pH到5.0，制成发酵培养基。

120℃、灭菌15分钟后，将灭菌后的培养基降温至室温后开始接入1升液体生产菌种，进行培养。该发酵温度控制为28℃，控制转速为开始时50转/分，溶氧一旦下降到15％便增加50转/分，通风量控制在80升/分钟，使溶氧在5-10％，在开始时不控制pH，但是，pH超过3.5时用柠檬酸来调节，pH下降到3.45以下时用氨水进行回调，使pH保持在3.50，发酵72小时，制成发酵粗酶液。

对该发酵粗酶液测定其果胶酶与纤维素酶的活性，果胶酶活为63单位/毫升，纤维素酶活为37单位/毫升。

2.发酵粗酶液的预处理

发酵粗酶液用氨水调节pH到6.0，加0.2重量％的氯化钙，缓慢搅拌溶解，静置2小时以上，溶液发生分层。用喷嘴排渣碟式分离机离心(型号为DBS215，湘潭碟式离心机有限公司产，分离因素10800G以上，流速控制低于60升/小时，使流出清液的吸光度OD600(1厘米光程)小于0.1。控制上料的流速使清液出口收集的上清的吸光度OD600小于0.1)，收集上清液。

3.果胶酶和纤维素酶的分离

取1M三氯化铁水溶液，将此三氯化铁溶液边搅拌边加入到以上上清液(待分离的发酵酶液)中，相对于待分离的发酵酶液体积使其终浓度10mM浓度，静置1小时见分层。用喷嘴排渣碟式分离机将固相和液相分离(型号为DBS215，湘潭碟式离心机有限公司产，分离因素10800G以上，流速控制低于60升/小时，使流出清液的吸光度OD600(1厘米光程)小于0.1)。固相进入下一步的分离，液相进入“第5步”分离。

4.果胶酶的重悬

加入体积为发酵液总体积5％的pH5.0、0.6M的柠檬酸钠，缓慢搅拌可见沉淀变清，测定果胶酶活为861单位/毫升，果胶酶的收率为89％。

5.纤维素酶的重悬

将“第三步”离心所得的含纤维素酶的(液相)缓慢用饱和碳酸钠调pH到6.0，将浓度为1M的硫酸锌溶液边搅拌边加入到其中，相对于第三步”离心所得的含纤维素酶的液相体积，使其终浓度达到30mM，静置1小时，见分层，用喷嘴排渣碟式分离机将沉淀分离(型号为DBS215，湘潭碟式离心机有限公司产，分离因素10800G以上，流速控制低于60升/小时，使流出清液的吸光度OD₆₀₀(1厘米光程)小于0.1)，收集沉淀。

沉淀用pH为4.5的0.9M的柠檬酸钠溶液使锌离子进行络合，加入体积为发酵液总体积的3.6％，缓慢搅拌可见沉淀变清。测定纤维素酶活为595单位/毫升，纤维素酶的收率为74％。

6.酶活的测定方法

1)对于果胶酶活采用如下方法进行测定：

配制DNS试剂：称取DNS(10±0.1)g，置于约600毫升水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50度水浴中搅拌溶解后，依次加入酒石酸钾钠200克、苯酚2克和无水亚硫酸钠5克，待全部溶解并澄清后，冷却到室温，用水定容至1000毫升，过滤，贮于棕色瓶中，于暗处放置7天后使用。

然后，取0.5％的果胶溶液0.5毫升，加入到0.5ml的酶液(控制稀释后酶反应液显色净吸光度值在0.3-0.75之间)中，摇匀，在50℃水中反应0.5小时后，取出，迅速在沸水中加热5min，冷却，取0.5ml的反应液移入加有0.5ml的DNS试剂的试管中，然后加4ml的蒸馏水，摇匀，沸水中加热5min后，迅速冷却。用分光光度计在540nm处测定其吸光度值。

将加热到100℃、灭活5min的0.5ml的稀释酶液与0.5ml的5％的果胶充分混合摇匀，取0.5ml的此液体移入加有0.5ml的DNS试剂的试管中，加4ml的蒸馏水，摇匀，沸水中加热5min，迅速冷却。用分光光度计在540nm处测定其吸光度值，作为空白反应值。

采用标准曲线法，配制一系列已知浓度的标准葡萄糖溶液，在540nm处测吸光度(A)，以葡萄糖浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标做标准曲线，由标准曲线可得公式：

A＝曲线斜率×C

未知试液测定吸光度A值(消除空白)后，可以通过上式求得C(mg葡萄糖/ml)。

果胶酶活(mg半乳糖醛酸/ml/h)＝酶液稀释倍数×C×R×L

式中：

L：葡萄糖换算成半乳糖醛酸的量

R：测定中稀释酶液被0.5％果胶溶液稀释的倍数

2)对于纤维素酶活采用QB 2583-2003纤维素酶制剂进行测定。

实施例1中，用三氯化铁将果胶酶和纤维素酶进行分离后，果胶酶富集于固相中，纤维素酶富集于液相中，对其测定酶活，发现果胶酶的总收率为89％，而纤维素酶的总收率74％，可以较好的从木霉中分离果胶酶和纤维素酶，得到良好的收率。

实施例2～8

实施例2～8基本上按照实施例1的步骤顺序进行实验，只是如表1所示，用○表示各实施例中所采用的具体步骤，用该具体步骤代替实施例1中的相应步骤，来进行从木霉中分离果胶酶和纤维素酶的操作，各实施例所得到的收率见表1。

表1

从表1中可以看出，本发明的分离方法具有操作便利，容易放大、成本低廉，污染低等特点，对纤维原料转化利用领域(如纤维素生产燃料乙醇等)的酶解成本的整体降低等具有重要的实用意义。用上述的分离方法可以有效的将果胶酶和纤维素酶分离、浓缩，其活力非常高，总收率分别为83％以上和69％以上。