用于细胞操作及电生理信号检测的微电极阵列器件及专用装置

摘要

本发明公开了一种用于细胞操作及电生理信号检测的微电极阵列器件及专用装置。所述微电极阵列器件由芯片单元、印刷电路板和一无底的培养腔体组成；所述芯片单元压焊至所述印刷电路板上并嵌入所述培养腔体中，所述培养腔体与所述印刷电路板密封连接；所述芯片单元自下至上依次包括基底、下金属层、绝缘层、上金属层和钝化层；所述下金属层上设有至少一个测量电极及其相应的电极引线和焊盘，所述上金属层上设有至少四个定位电极及其相应的电极引线和焊盘；其中，所述芯片单元的所有测量电极和定位电极中的每个电极均由单独的电极引线引出，一个电极引线与一个焊盘相连，每个电极能够被独立施加信号或被独立检测。

说明书

技术领域

本发明涉及用于细胞操作及电生理信号检测的微电极阵列器件及专用装置。

背景技术

微电极阵列芯片(microelectrode array，MEA)是指可以在神经细胞、组织或者系统水平多通道、实时地检测神经电生理信号或神经递质的微型装置总称，最早平面微电极阵列芯片是1972由Thomas等人报道的，用于记录体外培养心肌细胞的电活动。

如上所述，微电极阵列芯片最早是由于人们为了研究神经系统活动特性及机制而兴起的。1949年，Lilly首先采用灌注电解液的多管组合微电极插入方法研究灵长类动物的行为与神经元放电的关系；接着灌注金属(液态灌注再凝固成固态)的微电极开始应用，并促使集成式的微电极阵列芯片的发展；1970年，Wise等人利用集成电路的加工方法制作了微电极阵列探针，用于检测成年猫大脑皮层内的电活动；直到1972年，真正意义上的平面微电极阵列技术由Thomas等人首次报道，他们检测了心肌的电活动；1977年，Gross等人用激光去绝缘层的方法制作了单电极直径为10μm的微电极阵列，对蜗牛脑部的神经节进行检测；1985年，Gross领导的小组首次应用透明导电的铟锡氧化物作为电极及引线材料，虽然这种方法有利于观察电极表面细胞的生长情况，但它的阻抗要比金电极大很多，会严重降低信噪比。到1990年代体外培养式微电极阵列芯片逐渐趋于成熟，1998年，Pancrazio所在的小组采用工业化光刻微加工技术来生产芯片并发展出便携式胞外记录系统，目的是要开发一种集成的基于细胞的生物传感器，用来快速检测多种神经毒素。

此种微电极阵列芯片面临一个问题：体外培养的神经细胞并非准确定位在电极上，造成细胞与电极的贴附性较差或有距离，而且电刺激和电信号检测有可能发生在不同细胞的不同部位上。由于细胞外电极记录电信号对细胞与电极的空间位置关系非常敏感，导致获得的电信号幅值往往偏小(特别是对早期发育阶段的神经网络进行记录)，形状也较复杂，故不利于电信号的软件分选以及确定对应的神经细胞，期待改进。因此，如果能提供一种简便而有效的方法将细胞定位在记录电极上，将大大增强芯片的检测性能并扩大其适用范围。目前常见控制细胞定位的方法主要有两种。一种方法是通过微加工方法制作微型的凹坑、凹槽等结构。然而，这种方法缺陷明显，因为一般需要用玻璃微管将细胞逐个移到凹坑中，难度极大，而且细胞容易逃离凹坑。第二种方法是通过化学修饰方法，利用细胞在不同材料上的贴附性差异，实现细胞定位。但这种方法除了需要将活性生物分子有效地结合在基底之外，很难实现神经网络与微电极阵列的精确对准，且经过修饰的芯片却无法重复使用。

近年来，人们开始尝试用微电极产生介电力来定位神经细胞：Heida等人(HeidaT.et al.，IEEE Trans.Biomed.Eng.，49(10)：1195-1203，2002)利用四个电极通过负向介电力来汇集神经细胞；Ozkan领导的小组(Prasad S.et al.，J NeurosciMethods，135(1-2)：79-88，2004)则利用16个微电极阵列芯片直接产生正向介电力来吸附神经细胞，但将细胞推到电场强的区域会对细胞产生不可逆的损伤作用。2008年，Pan等人(Pan L.et al.，J Neurosci Methods，170：123-129，2008)公开了一种自动定位细胞并检测电生理信号的微电极阵列，其采用双层布线工艺，在下层金属层排布测量电极，在上层金属层排布8*8的定位电极阵列，他们将芯片上的定位电极根据所加信号的不同分为2组，并将这2两组电极分别连接在一起后引出，通过负向介电力的方式来富集细胞，但这种方法仅能形成单一固定的细胞网络，且仅能完成细胞定位并检测这单一功能。

发明内容

本发明的目的是提供用于细胞操作及电生理信号检测的微电极阵列器件及专用装置。所述器件可以单独对其中任一个电极进行操作，从而形成不同聚集程度的细胞网络并对其释放的电信号进行检测。同时，此器件还可以对细胞进行操作，例如完成细胞电旋转等功能。

本发明所提供的用于细胞操作及电信号检测的微电极阵列器件，包括芯片单元、印刷电路板和一无底的培养腔体；所述芯片单元压焊至所述印刷电路板上并嵌入所述培养腔体中，所述培养腔体与所述印刷电路板密封连接；所述芯片单元自下至上依次包括基底、下金属层、绝缘层、上金属层和钝化层；所述下金属层上设有至少一个测量电极及其相应的电极引线和焊盘，所述上金属层上设有至少四个定位电极及其相应的电极引线和焊盘；其中，所述芯片单元的所有测量电极和定位电极中的每个电极均由单独的电极引线引出，一个电极引线与一个焊盘相连，每个电极均能够被独立施加信号或被独立检测。

采用上述的结构后，由于微电极阵列中的每一个电极均单独引出并独立施加信号，因此可以控制每一个电极是否施加信号及施加何种信号，当选通的定位电极数量不同时，可得到聚集程度不同的细胞网络，当相邻四个电极施加相差为90°的信号时，可完成细胞电旋转功能。

为减小定位电极信号的衰减及相互之间的串扰，并降低噪声、提高采集信号的信噪比，对上述装置进行了如下改进：

所述微电极阵列器件芯片单元的下金属层和上金属层均设有若干地电极，所述绝缘层设有通孔，所有的地电极通过所述通孔进行连通，使得所述若干地电极将任意两个相邻的电极引线分隔开。所述下金属层和所述上金属层的所有电极引线均采用弧形进行转向。所述下金属层中的所有电极引线由电极到焊盘以扇形的方式逐渐变宽；所述至少一个测量电极中的每个电极表面电镀一层多孔材料；所述多孔材料优选为铂黑。所述芯片单元的绝缘层和钝化层为氮化硅-二氧化硅材料制成的双层结构。

采用上述改进后，由于引线的弧形及渐变设计均可降低高频信号在引线中的反射，氮化硅-二氧化硅双层结构可减少两层引线间的电容效应(二氧化硅阻挡钠离子移动的能力较弱，而氮化硅可有效阻止高频电场中钠离子的振荡)，地电极可屏蔽不同引线间的串扰，铂黑的多孔结构可增大电极表面积，进而能有效降低界面阻抗，从而提高施加和采集信号的信噪比。

作为本发明的另一种改进，所述微电极阵列器件的芯片单元采用玻片作为基底材料，定位电极采用环形设计，以方便使用传统生物实验室倒置显微镜进行观察。

当所述微电极阵列器件的芯片单元中的电极阵列较大时，会出现数目众多的压焊焊盘，为方便压焊、提高压焊成功率，本发明的改进如下：

所述印刷电路板设有两排焊盘，位于内排的焊盘为圆形，位于外排的焊盘为矩形；所述芯片单元的下金属层的焊盘和上金属层的焊盘都均匀分布于所述芯片单元的边缘，所述印刷电路板上的焊盘与所述芯片单元上的焊盘相连。所述印刷电路板上设有与所述印刷电路板上的焊盘对应的焊盘引线，所有焊盘引线均采用弧形转向。

采用如上改进后，增加了焊盘的面积，从而降低压焊难度及印刷电路板加工难度，降低成本。

本发明的另一个目的是提供一种用于细胞操作的装置。

本发明所提供的用于细胞操作的装置，包括所述的微电极阵列器件和金属夹具；

所述金属夹具包括印刷电路板、具有镂空底部的金属外壳和盖板三部分；

所述印刷电路板设有至少三个定位孔，所述至少三个定位孔使得所述印刷电路板固定于所述金属外壳的镂空底部；

所述印刷电路板上设有若干弹簧针，使得印刷电路板与所述的微电极阵列器件的印刷电路板通过所述弹簧针实现电连接；

其中，所述金属夹具还包括盖板，所述盖板置于所述微电极阵列器件上将所述微电极阵列器件固定于所述金属夹具中，并保证所述电连接的紧密、稳定。所述金属外壳设有与所述微电极阵列器件相匹配的导轨，以使所述微电极阵列器件仅能沿所述弹簧针方向垂直移动。

同时，为了保证弹簧针的垂直焊接，所述装置还包括一个焊接夹具，所述焊接夹具上设有插孔和定位孔；所述插孔的位置、直径和数量与所述金属夹具上的弹簧针相匹配；所述定位孔与所述金属夹具上的定位孔一一对应。置于插孔中的弹簧针可垂直插入印刷电路板的弹簧针焊盘中，并通过定位孔保持位置的固定，从而在整个焊接过程中不出现偏移及错位的情况，保证焊接后的弹簧针彼此平行并垂直于印刷电路板。

附图说明

图1加工微电极阵列器件芯片单元电极区域的掩模板版图

a-e为用于加工所述微电极阵列器件芯片单元的掩模板版图，f为一个芯片单元的俯视图。

图2为微电极阵列器件芯片单元电极区域的剖面图。

图3为微电极阵列器件芯片单元引线区域的剖面图。

图4为微电极阵列器件的印刷电路板的版图

a微电极阵列器件的印刷电路板的版图；b为焊盘区域放大图。

图5为微电极阵列器件封装流程图。

图6为封装后实物图。

图7为微电极阵列器件芯片单元全部电极显微镜照片

a：微电极阵列器件芯片单元全部电极正置显微镜照片；b：微电极阵列器件芯片单元全部电极倒置显微镜照片。

图8为微电极阵列器件芯片单元部分电极的显微镜照片

a：微电极阵列器件芯片单元部分电极放大图的正置显微镜照片，b：微电极阵列器件芯片单元部分电极放大图的倒置显微镜照片。

图9为金属夹具装配及使用方法说明图。

图10为金属夹具印刷电路板的版图。

图11为导轨示意图。

图12为焊接夹具示意图。

图13为焊接夹具使用方法说明图。

图14为完成细胞定位的实验方案流程图。

图15为进行细胞电旋转实验的方案流程图。

具体实施方式

实施例1、用于细胞操作及电信号检测的微电极阵列器件903

本发明的用于细胞操作及电信号检测的微电极阵列器件903，由芯片单元501、印刷电路板401和一无底的培养腔体506组成。

1)制备微电极阵列器件的芯片单元501

图1a～e为用于加工所述微电极阵列器件芯片单元501的掩模板版图。图2为芯片单元501电极区域的剖面图，图3为芯片单元501引线区域的剖面图。该芯片单元的微加工方式如下：

(1)所用玻片205清洗干净；

(2)溅射第一金属层，此层结构为Ti-Au-Ti；

(3)用第一块掩模板a光刻测量电极102，引线103，焊盘112及地电极101，并进行刻蚀；

(4)应用等离子增强化学汽相沉积(PECVD)绝缘层202，此层结构为Si₃N₄-SiO₂；

(5)用第二块掩模板b光刻测量电极106、焊盘112及地电极引线孔105，并使用湿法、干法交替刻蚀绝缘层；

(6)溅射第二金属层，此层结构为Ti-Au-Ti；

(7)用第三块掩模板c光刻定位电极109，引线108，焊盘112及地电极115，并进行刻蚀；

(8)应用等离子增强化学汽相沉积(PECVD)钝化层204，此层结构为Si₃N₄-SiO₂；

(9)用第四块掩模板d光刻定位电极109、测量电极113、地电极窗口114及焊盘窗口112，并使用湿法、干法交替刻蚀钝化层；

(10)用第五块掩模板e光刻电镀窗口111；

(11)应用恒流法、在超声环境中电镀铂黑203；

(12)划片并去胶清洗。

为获得更好的细胞定位效果并提高电信号检测的信噪比，对此微电极阵列器件的芯片单元进行了下述的优化设计：

(1)电极引线103、108采用弧形设计；

(2)测量电极引线103由电极到焊盘以扇形的方式逐渐变宽；

(3)在测量电极层及定位电极层均排布一圈地电极101、115，并通过绝缘层通孔105连通，以保证每两条电极引线103、108间均有地电极101和115作为屏蔽；

(4)测量电极表面电镀铂黑203；

同时，为了方便使用倒置显微镜进行观察，上述加工采用玻片205作为芯片单元加工的基底，并将定位电极109设计为环形，从而增加可视区域，如图7b、图8b所示，当采用这种设计时，定位电极109中心区域为透明。

2)制备微电极阵列器件的印刷电路板401

图4中a为所述微电极阵列器件印刷电路板401的版图，b为a的焊盘区域放大图，使用标准电路板加工工艺进行加工。为使用倒置显微镜进行观察，印刷电路板401中央403镂空，芯片单元首先粘至印刷电路板401中央404区域内，然后通过金丝球焊工艺将芯片单元焊盘112与印刷电路板焊盘405和406相连。由于所有电极均单独引出，压焊点数目较大，为使用压焊机进行自动压焊，降低对手工的依赖，需尽可能扩大压焊区域，以保证自动压焊所需的足够大的焊盘，因此，采用如焊盘405和406所示的双排焊盘设计，内排为大直径圆形焊盘405，外排为矩形长条焊盘406。同时，为尽量降低信号衰减，提高施加信号及采集信号的信噪比，所有引线402采用弧形设计。

3)微电极阵列器件的封装

图5为所述微电极阵列器件的封装示意图：首先，芯片单元501粘至印刷电路板401中央；其次，进行金丝球焊，使用双排金丝503和504将芯片单元焊盘与印刷电路板焊盘相连，其中金丝503压焊至印刷电路板外排焊盘406，金丝504压焊至印刷电路板内排焊盘405；然后，用硅胶505保护压焊的金丝503和504；最后，将培养腔体506粘至印刷电路板401上，并使芯片单元501嵌入该腔体中。图6为装配后的微电极阵列器件。

实施例2、用于细胞操作的装置

本发明的用于细胞操作的装置，包括实施例1制备的微电极阵列器件903和金属夹具；金属夹具的制备及组装方法如下：

图9为配套金属夹具的组装及使用的示意图，由3部分组成：金属外壳904、金属夹具的印刷电路板905及盖板901。焊有弹簧针的印刷电路板905通过4个螺丝固定于金属外壳904镂空的底部，微电极阵列器件903放于弹簧针上，通过盖板901压紧，并用梢钉902锁紧。

图10为金属夹具的印刷电路板905的版图。其中，1001为印刷电路板边缘，1002为定位孔并用其将金属夹具的印刷电路板固定于金属外壳904上，1004是为方便显微镜观察的开孔，1005为弹簧针焊盘，1010为排线插座，同时，为提高信噪比，所有引线1009采用弧形转向设计。

图11为金属夹具上的导轨示意图，通过与微电极阵列器件匹配的导轨1101将微电极阵列器件完全限制在规定的移动范围内，使其仅能沿规定方向上下移动，并使其上焊盘407与弹簧针一对一完全对应。

本发明的用于细胞操作的装置还包括一个焊接夹具。该焊接夹具保证在整个焊接过程中不出现偏移及错位的情况，焊接后的弹簧针彼此平行并垂直于印刷电路板。

图12和13为焊接夹具及其使用示意图，1202为弹簧针插孔，保证弹簧针彼此平行并与金属夹具的印刷电路板905垂直；1201为定位孔，通过1002将其固定于金属夹具的印刷电路板905上，同时保证插孔1202中的弹簧针可垂直插入金属夹具的印刷电路板905的焊盘1005中及焊接后弹簧针间彼此平行并垂直于金属夹具的印刷电路板。

实施例3、用于细胞定位及电信号检测的装置的应用

图14是利用负向介电力定位细胞并进行检测的流程图。首先，将细胞(如神经细胞)悬液加入用于细胞定位及电信号检测的装置的培养腔体506中；然后在不同数目的定位电极上施加定位信号以产生介电力，其区别在于，既可以在所有定位电极上均施加了信号，也可以仅在某些特定的定位电极上施加信号，或完全不施加信号作为对照，从而令细胞构成不同的网络图形。介电力可由交流电产生，也可由直流电产生，交流信号可在很宽的频率范围内起作用(例如500Hz到50MHz)；且定位信号可以始终施加在定位电极上，也可以施加一段时间，暂停一段时间，然后再施加一段时间(如施加5s，暂停5s，再施加5s，再暂停5s，如此循环)。其中一种定位信号的参数为，相对电极施加频率为5MHz，峰峰值为4V，相位相差180°的高频正弦波，作用时间为30分钟。此后，可将上述用于细胞定位及电信号检测的装置放于二氧化碳培养箱(37℃，5％CO₂，100％湿度)中进行培养，若形成的网络由神经细胞等可兴奋并发放电信号的细胞构成，则可在不同测量电极位点记录电信号，并比较之间差异。

图15为细胞电旋转实验流程图。首先将细胞悬浮体系通过离心等方法置换为低电导溶液(PBS加等渗蔗糖，50μS/cm～1mS/cm)，然后将其加入培养腔体506中，并在相邻的四个电极上分别施加四相频率相同、幅值相同的正弦波(例如，116-0°，117-90°，109及123-180°，115及122-270°)，并移至显微镜下进行观察。