蛇孢假壳素(ophiobolin)类二倍半萜烯化合物及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及蛇孢假壳素(ophiobolin)类二倍半萜烯化合物及其制备方法和用途。本发明用从文昌头苑红树林植物木榄根系的土壤样品中分离得到的焦曲霉094102(Aspergillusustus 094102，菌种保藏编号CCTCC M 208153)生产出结构新颖的上述类型的化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。

说明书

技术领域：

本发明涉及用焦曲霉094102(Aspergillus ustus 094102)制备蛇孢假壳素(ophiobolin)类二倍半萜烯化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。

背景技术：

蛇孢假壳素(ophiobolin)类二倍半萜烯化合物已有一些文献报道，该类化合物显示了广谱的抗菌活性，如抗线虫、抗真菌及抗细菌等，此外还对多种肿瘤细胞具有显著细胞毒活性。据报道，该家族的ophiobolinA能抑制钙离子活化的环核苷酸磷酸二酯酶的活性并导致小鼠白血病细胞L1210细胞的凋亡。

到目前为止已发现该类化合物30余种，该类化合物的结构特征是均具有一个三轮列的5-8-5环结构。此外，有14、17位形成环氧结构的，如ophiobolinA、ophiobolin J等(Antonio，E.，Anna，A.，Alessio C.，et al.Ophiobolin E and 8-epi-ophiobolin J produced by Drechsleragigantean，a potential mycoherbicide of weedy grasses.Phytochemistry，2006，67，2281-2287)；有16、17位双键被氢化而饱和的，如ophiobolins B-D、ophiobolin F、ophiobolin M等(Athanasios T.，Akinlolu A.A.，Jan S.T.，et al.Ophiobolin M and Analogues，NoncompetitiveInhibitors of Ivermectin Binding with Nematocidal Activity.Bioorg.Med.Chem.，1996，4，531-536)；有5、21位之间形成内酯环或半缩酮的，如ophiobolin Alactone、ophiobolin H、ophiobolin L等(Hong W.，Takuya I.，Masahiro K.，et al.Cytotoxic sesterterpenes，6-epi-ophiobolin G and 6-epi-ophiobolin N.from marine derived fungus Emericella vaiecolor GF 10.Tetrahedron，2004，60，6015-6019)。本发明人研究发现焦曲霉094102(Aspergillus ustus094102)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞坏死活性，遂对其活性成分进行了研究，结果发现了三个蛇孢假壳素(ophiobolins)类二倍半萜烯化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见对该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。

发明内容：

本发明旨在提供一种结构独特的具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性的新化合物。

本发明的目的还在于提供一类新化合物的制备方法及其新化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。

本发明首次从焦曲霉094102(Aspergillus ustus094102)发酵物中发现了结构新颖的蛇孢假壳素(ophiobolins)类二倍半萜烯化合物，如式I、式II所示：

式I                                    式II

其结构特征是：式I中R₁、R₂为氢、烃基、酰基，式II中R₁为氢、烃基。

本发明的式I、式II化合物优选其中化合物1中R₁R₂均为甲基，21位的甲氧基为β构型；和化合物2中R₁R₂均为甲基，21位的甲氧基为α构型。所述的式II化合物3中R₁为甲基。

上述发明中最优选的化合物是由红树林来源的焦曲霉094102(Aspergillus ustus 094102)的液体发酵物经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为溶剂进行梯度洗脱，石油醚-丙酮3∶1的洗脱物，再经凝胶柱层析以氯仿-甲醇1∶1为洗脱剂，洗脱产物再经反相柱层析，以甲醇-水为溶剂进行梯度洗脱，甲醇-水85∶15洗脱产物经制备HPLC分离纯化，以甲醇-水90∶10洗脱得式I 1和2、式II化合物3。

本发明采用SRB法测试了化合物1，2，3对A549人肺癌细胞株的抗肿瘤活性，采用MTT法测试了化合物1，2，3对HL-60人白血病细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，这3个化合物对这两种肿瘤细胞均有增殖抑制作用。

因此本发明的式I、式II化合物可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。

式I、式II化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。

式I、式II化合物还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，式I、式II化合物可溶于甲醇中，也可溶于二甲基亚砜中加以应用。

本发明的式I、式II化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离纯化而得到；也可由上述优选化合物经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。

需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I、式II化合物的方法可采用其它任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为生产菌用于制备式I、式II化合物。

本发明的实施例中列举了利用焦曲霉094102株制备优选的本发明式I、式II化合物的实例。

该真菌094102株由从文昌头苑红树林木榄土壤中分离，并经分类学研究和分子生物学研究鉴定为焦曲霉Aspergillus ustus，并由中国典型培养物保藏中心保藏(编号：CCTCC M208153，日期：2008年10月10日，地点：中国武汉、武汉大学)。

该焦曲霉094102(Aspergillus ustus 094102)株具有如下微生物菌学特征：

菌落在查氏培养基28℃培养7天的直径25～35mm，培养15天的直径45～60mm；菌落呈灰褐色，有白色边缘，质地棉絮状，无渗出液；菌落反面不均匀的黄褐色。分生孢子梗发生于气生菌丝，分生孢子头幼时为球形，老后成为辐射形。孢梗茎400～800μm×10～16μm，具褐色，壁光滑。顶囊球形或半球形，6～13μm，大部分表面可育；产孢结构双层，梗基4～9μm×3～3.5μm，瓶梗4～10μm×2～3μm；分生孢子球形，3～5μm，明显粗糙，具小突起。

该焦曲霉094102(Aspergillus ustus 094102)株具有如下分子生物学特征：

ITS序列信息：

GGGGTTCGAGTGAGACTCTGGGTCACCTCCCACCCGTGTCTATCGTACCTTGTTGCTTC

GGCGGGCCCGCCGTTTCGACGGCCGCCGGGGAGGCCTTGCGCCCCCGGGCCCGCGCC

CGCCGAAGACCCCAACATGAACGCTGTTCTGAAAGTATGCAGTCTGAGTTGATTATCG

TAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCA

GCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACG

CACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTC

AAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGTCCCCCTCTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGG

CAGCGGCGGACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCTGCTCTGTAGG

CCCGGCCGGCGCCAGCCGACACCCAACTTTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGG

TAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA

18S序列信息：

GCCGGCTTGTCTCAGATTAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATCTATACTGTGAAAC

TGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCT

GTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGGAGGGGTGTATTTAT

TAGATAAAAAACCAATGCCCCTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATAATAACTTAACGAATC

GCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGT

AGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGA

GAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTAC

CCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTC

TCGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAACCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGT

CTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGT

TAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTAC

TGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAAGCCCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGG

AACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGGATA

CATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCG

CCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATT

CTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAAT

CAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATA

AACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGGCGTTTCTATGATGACCCGCTCGGCACCTTACG

AGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAG

AAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACAC

GGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTG

ATCTTTTGGATGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATT

GCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGCGTCTGCGGGCCGCTG

GCTTCTTAGGGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTGCGCGGCAATAACAGGTCTG

TGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAGGGCCAGCGAGTAC

ATCACCTTGGCCGAGAGGCCTGGGTAATCTTGTTAAACCCTGTCGTGCTGGGGATAGA

GCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAGGCACGAGTCATCAGCTCGG

CCGAAAGGGGGTCGAGGGAACA

需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I、式II化合物的方法可采用其它任何能生产蛇孢假壳素(ophiobolin)类二倍半萜烯化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可用作产素菌用于制备式I、式II化合物。

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物1、2、3的化学结构分别是：(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)

式I                                            式II

式I中化合物1的R₁R₂均为甲基，21位的甲氧基为β构型；化合物2的R₁R₂均为甲基，21位甲氧基为α构型。式II中化合物3的R₁为甲基。

实施例1化合物1、2、3的发酵生产及分离精制

1发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取焦曲霉094102(Aspergillus ustus094102)适量，接种到PDA斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。

取斜面培养4天的焦曲霉094102(Aspergillus ustus 094102)适量，接种到装有120mL培养液[培养基组成(克/升)：甘露醇20.0，麦芽糖20.0，葡萄糖10.0，味精10.0，酵母膏3.0，玉米浆1.0，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.3，pH6.5]的500mL锥型瓶中，在28℃、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获得焦曲霉094102(Aspergillus ustus 094102)的种子培养液。将该种子培养液按10％接种量分别接种于装有300毫升生产培养液[培养基组成(克/升)：甘露醇20.0，麦芽糖20.0，葡萄糖10.0，味精10.0，酵母膏3.0，玉米浆1.0，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.3，pH6.5]的1000mL三角烧瓶中，进行为期30天24℃的静置生产发酵，获得菌丝体和发酵液。

2浸膏的获得

用绢布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮破碎浸提三次，减压浓缩至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏。发酵液减压浓缩为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共15.0克。

3化合物的分离精制

浸膏(15.0克)用氯仿-甲醇(9∶1)混合溶剂溶解后，加70克200～300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为溶剂进行梯度洗脱，分为10个流份。Fr-6(1.8克，石油醚-丙酮9∶3洗脱物)，再经凝胶柱层析以氯仿-甲醇1∶1为洗脱剂，洗脱产物再经反相柱层析，以甲醇-水为溶剂进行梯度洗脱，其中甲醇-水85∶15洗脱产物经制备HPLC分离纯化，以甲醇-水90∶10洗脱得式I、式II化合物1(16mg)、2(14mg)、3(3mg)。

化合物1，白色无定型粉末，[α]_D²⁰+34.7°(c 0.1，MeOH)，分子式C₂₇H₄₂O₄；UVλ_maxnmin MeOH：238；IR v_max cm^-1(KBr)：3400、2966、2864、1728、1643、1275、1088；¹H及¹³C NMR数据见表1和表2。

化合物2，白色无定型粉末，[α]_D²⁰+72.6°(c 0.1，MeOH)，分子式C₂₇H₄₂O₄；UVλ_maxnmin MeOH：238；IR v_max cm^-1(KBr)：3420、2958、2813、1710、1655、1290、1088；¹H及¹³C NMR数据见表1和表2。

化合物3，白色无定型粉末，[α]_D²⁰+58.2°(c0.1，MeOH)，分子式C₂₅H₃₈O₂；UVλ_maxnmin MeOH：238；IR v_max cm^-1(KBr)：3435、1670、1659、1376、1230、1154；¹H及¹³C NMR数据见表1和表2。

表1化合物1～3的¹H(600MHz in CDCl₃)

表2化合物1～3的¹³C NMR数据(150MHz in CDCl₃)

实施例2抗肿瘤活性的测试

1实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物1～3。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。

细胞系及细胞的继代培养：活性测试采用A549和HL-60细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在37℃通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。

细胞增殖抑制活性测试方法(SRB法和MTT法)

本发明采用SRB法和MTT法，测试评价了被测试样品对癌细胞A549和HL-60增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的甲月替(formazan)，formazan的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。

活性测试时，取对数生长期的HL-60细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升5×10⁴个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，在37℃下培养24小时后，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培养4小时，移出150μL培养液后加入150μL DMSO溶解formazan，在540nm处测定其吸收度。按照IR％＝(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。

2实验结果

化合物1～3的细胞增殖抑制活性：

表3.化合物1～3对A549和HL-60细胞的抑制率

3结论

化合物1～3对人癌细胞具有抗肿瘤作用。因此，本发明的式I、式II化合物可作为抗肿瘤剂(即抗肿瘤药物)用于肿瘤的治疗，也可作为细胞增殖抑制的低分子生物探针用于探索生命现象本质的生命科学实验研究中。