含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体及制备方法和应用。利用质粒rDNA－GFP，通过酶切和PCR酶切位点突变等方法，构建质粒T－GFP；利用嗜热四膜虫基因组DNA，通过PCR扩增和克隆等方法，构建质粒T－HSP702；利用质粒T－GFP、T－HSP702和pD5H8，通过酶切和连接最终构建得到质粒HSP702－GFP－pD5H8。该载体含有HSP702启动子，能实现外源基因高效表达；该载体上含有可替换的外源基因gfp，通过替换不同的外源基因，以实现四膜虫成为一个外源基因表达系统；在巴龙霉素药物筛选作用下，该载体替换掉四膜虫体内原有的绝大部分rDNA，使外源基因在四膜虫体内大量倍增，以实现目标基因的遗传转化。本发明方法易行，操作方便，该载体在转染进四膜虫中可用于环境中三丁基锡的检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体，同时还涉及含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体的制备方法，还涉及含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体在快速且高通量检测三丁基锡中的应用。

技术背景

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是生物适应环境温度或应激变化的一个重要媒介分子，过高或过低的温度都会诱导细胞或机体产生应激反应，迅速合成HSP作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、装配、运转和降解等过程，以维持细胞蛋白自稳，提高细胞对应激源的耐受性，增强抗氧化作用，使细胞维持正常的生理功能。热休克蛋白70(Hsp70)是HSP家族的主要一员，它是细胞在应激条件下的主要表达产物，用HSP70启动子作为调控外源基因表达的启动子，有利于启动外源基因的表达，并可通过应激对外源基因的转录进行调控(Bukau B，Horwich AL.The Hsp70and Hsp60chaperone machines.Cell.1998.92(3)：351-366；JG，Kristensen TN，Loeschcke V.The evolutionary and ecological role ofheat shock proteins.Ecol Lett.2003，6(11)：1025-1037；陈全，朱道银，骆旭东，蒋英，江山。用结核分枝杆菌HSP70启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒的研究。重庆医科大学学报。2003，28(6)：697-700；冯立芳，缪炜。不同纬度螅状独缩虫耐热能力及Hsp70mRNA表达水平的比较。动物学报。2008，54(3)：525-530。)。

绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)是从水母中分离出来的一种发光蛋白，以它作为标记蛋白具有诸多优点：检测方便，用荧光显微镜或激发光源即可观察；荧光稳定，无光漂白现象，能耐受长时间的光照，在很大pH值范围内(7～12)均正常发光；灵敏度高；对受体细胞基本无毒害；不受假阳性干扰，四膜虫本身不含有GFP，故不会出现假阳性结果；不需任何反应底物和辅助因子参与；可制成永久标本；分子量小，与其它基因的融合表达载体在真核细胞中所表达的融合蛋白具有目的基因和绿色荧光蛋白的双重活性，从GFP的荧光强度即能准确反映基因的表达水平，同时还能对目的基因进行亚细胞定位分析(Tsien RY.The green fluorescent protein.Annu Rev Biochem.1998，67：509-544；王晓丽，邵卫星，单虎。绿色荧光蛋白研究进展。动物医学进展。2008，29(1)：56-59。)。

四膜虫(Tetrahymena)是一种营自由生活的单细胞真核生物，隶属于原生动物中的纤毛门寡毛纲膜口目，广泛分布于全球各地的淡水环境中。四膜虫作为第一种实现细胞同步化的真核生物可以进行无菌纯培养，而且生长快(2-2.5小时繁殖一代)；比较基因组的研究也显示嗜热四膜虫较酵母等模式生物和人类具有更高程度的功能保守性；加之四膜虫中已建立了成熟的基因操作技术，是毒理学与生态毒理学研究中的优良模式生物(Turkewitz AP，Orias E，Kapler G.Functional genomics：the coming of age for Tetrahymena thermophila.Trends Genet.2002，18(1)：35-40；Coollins K，Gorovsky MA.Tetrahymena thermophila.Curr Biol.2005，15(9)：R317-318；傅诚杰，俞婷，缪炜，沈韫芬。四膜虫：毒理学与生态毒理学研究中的优良模式生物。动物学杂志。2005，40(1)：108-113。)。

丁基锡化合物作为添加剂广泛用于聚氯乙稀稳定剂、工业催化剂、农业杀虫剂、木材防腐剂等，尤其是自20世纪60年代以来，大规模用于船舶的防污涂料以防止海洋生物对船舶的吸附。然而，丁基锡化合物是有毒化合物，会危害水生态系统，其中以三丁基锡(Tributyltin，TBT)的毒性为最大。TBT浸溶于水中后通过遗传毒性、细胞毒性、神经毒性、致畸、免疫抑制、内分泌紊乱等危害贝类、蛤类、水蚯蚓、海星、鱼类等水生生物，并进入食物链进而影响到其它生物(HochM.Organotin compounds in the environment-an overview.Appl Geochem.2001，16(7-8)：719-743；Antizar-Ladislao B.Environmental levels，toxicity and humanexposure to tributyltin(TBT)-contaminated marine environment.A review.EnvironInt.2008，34(2)：292-308.)。目前，不少发达国家已经禁止或限制小型船舶(＜25m)使用TBT作为船舶防污剂，但港口、造船厂等船只活动频繁的水域，TBT的含量仍然较高；此外，诸多发展中国家还没有限制使用TBT，在江河湖泊中可检测到高浓度TBT的存在(Cao DD，Jiang GB，Zhou QF，Yang RQ.Organotin pollution inChina：an overview of the current state and potential health risk.J Environ manage.2009，90(suppl 1)：S16-24；Kotrikla A.Environmental management aspects for TBTantifouling wastes from the shipyards.J Environ manage.2009，90(suppl 1)：S77-85.)。所以，水体中TBT的检测非常重要，在快速、高通量检测方面显得尤为迫切(Feng LF，Miao W，Wu YX.Differentially expressed genes of in response totributyltin(TBT)identified by suppression subtractive hybridization and real timequantitative PCR.Aquat Toxicol.2007，81(1)：99-105.)。

Blechinger等、Seok等利用HSP70基因5′端顺式调控序列作为启动子，以GFP为报告基因而构建的载体，在转染高等生物斑马鱼体内的应用已有报道(Blechinger SR，Warren JT，Kuwada JY，Krone PH.Developmental toxicology ofcadmium in living embryos of a stable transgenic zebrafish line.Environ Health Persp.2002，110(10)：1041-1046；Seok SH，Baek MW，Lee HY，Kim DJ，Na YR，Noh KJ，Park SH，Lee HK，Lee BH，Ryu DY，Park JH.Quantitative GFP fluorescence as anindicator of arsenite developmental toxicity in mosaic heat shock protein 70transgenic zebrafish.Toxicol Appl Pharm.2007，225(2)：154-161.)。但构建的载体转染生物体技术复杂、成功率低，具体应用到环境污染检测方面难度大。Bartos等以GFP为报告基因而构建的载体转染低等生物酵母体内应用于环境污染检测也已有报道(Bartos T，Letzsch S，Skarek M，Flegrova Z，Cupr P，Holoubek I.GFP assayas a sensitive eukaryotic screening model to detect toxic and genotoxic activity ofazaarenes.Environ Toxicol.2006，21(4)：343-348.)。但构建的载体启动子效率低，对有些化合物的检测灵敏度不够高。

最近，有关外源基因导入四膜虫体内技术的运用日益成熟，如Gaertig等、Barchetta等通过电穿孔技术将外源基因整合到四膜虫rDNA上，使得外源基因在四膜虫体内得到了大量的倍增(Gaertig J，Kapler G.Transient and stable DNAtransformation of Tetrahymena thermophila by electroporation.Method Cell Biol：Tetrahymena thermophila.Academic press.2000，vol 62：485-500；Barchetta S，LaTerza A，Ballarini P，Pucciarelli S，Miceli C.Combination of two regulatory elementsin the Tetrahymena thermophila HSP70-1gene controls heat shock activation.Eukaryot Cell.2008，7(2)：379-386.)。因此，构建能高效稳定表达、转染生物体的操作技术简单、成功率高的含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体用于环境中三丁基锡(Tributyltin，TBT)的检测具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体HSP702-GFP-pD5H8。该载体上含有的四膜虫HSP70-2基因启动子HSP70-25′UTR是一个强启动子，以实现gfp基因的高效表达；该载体上含有可替换的外源基因gfp，通过替换不同的外源基因，以实现四膜虫成为一个外源基因表达系统；在巴龙霉素药物筛选作用下，该载体替换掉四膜虫体内原有的绝大部分rDNA，使外源基因在四膜虫体内大量倍增，以实现目标基因的遗传转化。

本发明的另一个目的是在于提供了一种含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体HSP702-GFP-pD5H8的制备方法，方法简便易行，实验操作方便。

本发明的再一个目的是在于提供了一种含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体HSP702-GFP-pD5H8在污染物三丁基锡检测中的应用，将含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体HSP702-GFP-pD5H8在转染进四膜虫中后用于TBT的检测，而且检测结果具有高度的可信性和可重复性。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术措施：

本发明所述的载体HSP702-GFP-pD5H8是一种HSP70-2基因启动子驱动gfp基因的四膜虫转基因表达载体。四膜虫的HSP70-2基因启动子是一个强启动子，能高效启动下游基因的表达。以39℃热激和50μg/L浓度的TBT处理条件下的四膜虫cDNA为模板，采用实时定量PCR方法比较嗜热四膜虫HSP70-2基因与目前已报道嗜热四膜虫HSP70-1基因(Barchetta S，La Terza A，Ballarini P，Pucciarelli S，Miceli C.Combination of two regulatory elements in the Tetrahymenathermophila HSP70-1gene controls heat shock activation.Eukaryot Cell.2008，7(2)：379-386.)，发现无论在热激还是TBT处理条件下，HSP70-2基因的相对表达量更高，如图6所示，相应的HSP70-2基因的启动子效率也更高，对TBT的响应更敏感。基于此，本发明所述的载体HSP702-GFP-pD5H8上含有的四膜虫HSP70-2基因启动子是一个强启动子，能够实现gfp基因的高效表达和对TBT的迅速响应。

本发明所述的载体HSP702-GFP-pD5H8上含有的外源基因gfp是个可替换的外源基因。由于载体HSP702-GFP-pD5H8上含有多个BamH I与Xho I酶切位点，不适合直接酶切替换，而质粒HSP702-GFP(本发明所构，见图3)上仅含1个BamH I与1个Xho I酶切位点。首先将拟研究对象外源基因X(可在四膜虫体内表达的任何无毒外源基因)经PCR扩增，在其起始密码子ATG前加上BamHI酶切位点，在其终止密码子TGA后加上Xho I酶切位点。接着经BamHI+Xho I酶切将质粒HSP702-GFP上的外源基因gfp替换为拟研究对象——外源基因X，得到质粒HSP702-X。然后将质粒HSP702-X经Not I酶切后插入到pD5H8载体(Gaertig J，Gorovsky MA.Efficient mass transformation of Tetrahymenathermophila by electroporation of conjugants.Proc Natl Acad Sci USA.1992，89(19)：9196-9200.)上唯一的Not I酶切位点，构成所需质粒HSP702-X-pD5H8(具体操作过程可参考本发明中所述表达载体HSP702-GFP-pD5H8的构建方法)。最后用电穿孔法转染所构质粒HSP702-X-pD5H8到四膜虫体内，便使四膜虫成为一个表达外源基因X的表达系统。

将所述的载体HSP702-GFP-pD5H8通过电穿孔法转染到四膜虫体内后，在巴龙霉素药物筛选作用下，使得外源基因gfp在四膜虫体内拷贝数大量倍增。以18s基因代表四膜虫体内本身具有的rDNA拷贝数(Karrer KM.Tetrahymenagenetics：two nuclei are better than one.Method Cell Biol：Tetrahymena thermophila.Academic press.2000，vol 62：138-140.)，以gfp基因代表转染质粒HSP702-GFP-pD5H8在四膜虫体内的拷贝数。用实时定量PCR方法比较四膜虫18s基因与gfp基因的相对数量，即可推算出四膜虫体内rDNA与质粒HSP702-GFP-pD5H8的拷贝数(详见附图说明7)。如图7所示，在巴龙霉素药物筛选作用下，四膜虫的绝大部分rDNA被替换掉，只剩下约550个拷贝；质粒HSP702-GFP-pD5H8则大量倍增，高达约8450个拷贝，也就是说，外源基因gfp在四膜虫体内拷贝数达到约8450个拷贝，实现了目标基因的遗传转化。

构建一种含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体HSP702-GFP-pD5H8的具体实验技术参考J.萨姆布鲁克与D.W.拉塞尔著的《分子克隆实验指南》(黄培堂等译，2002年8月第三版，北京：科学出版社)。本发明中所用限制性内切酶均购买自TOYOBO公司、Biospin胶回收试剂盒购买自BioFlux公司、质粒DNA小量提取试剂盒购买自BioFlux公司、pGEM-T载体购买自Promega公司、DNA聚合酶购买自BD Biosciences公司、T4连接酶购买自New England Biolabs公司、热敏磷酸酶购买自New England Biolabs公司、转化用大肠杆菌E.coli DH5α购买自天根生化公司、DNA分子量标记Marker均购买自天根生化公司、琼脂糖购买自Biowest公司、TBT购买自Acros Organic公司、所有离心管、吸头均购买自Axygen公司、所用引物均由武汉鼎国生物技术有限公司合成，所有测序均由联合基因上海联众基因研究院完成。本发明所用嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)SB210株系信息参考Eisen等(Eisen JA，Coyne RS，Wu M，Wu D，Thiagarajan M，Wortman JR，Badger JH，Ren Q，Amedeo P，Jones KM，Tallon LJ，Delcher AL，Salzberg SL，Silva JC，Haas BJ，Majoros WH，Farzad M，Carlton JM，Smith RK Jr，Garg J，Pearlman RE，Karrer KM，Sun L，Manning G，Elde NC，Turkewitz AP，Asai DJ，Wilkes DE，Wang Y，Cai H，Collins K，Stewart BA，Lee SR，Wilamowska K，Weinberg Z，Ruzzo WL，Wloga D，Gaertig J，Frankel J，Tsao CC，Gorovsky MA，Keeling PJ，Waller RF，Patron NJ，Cherry JM，Stover NA，Krieger CJ，del Toro C，Ryder HF，Williamson SC，Barbeau RA，Hamilton EP，Orias E.Macronuclear genome sequence of the ciliate Tetrahymena thermophila，a modeleukaryote.Plos Biol.2006，4(9)：e286.)，质粒rDNA-GFP信息参考Barchetta等(Barchetta S，La Terza A，Ballarini P，Pucciarelli S，Miceli C.Combination of tworegulatory elements in the Tetrahymena thermophila HSP70-1gene controls heatshock activation.Eukaryot Cell.2008，7(2)：379-386.)，质粒pD5H8信息参考Gaertig等(Gaertig J，Gorovsky MA.Efficient mass transformation of Tetrahymenathermophila by electroporation of conjugants.Proc Natl Acad Sci USA.1992，89(19)：9196-9200.)。

一种含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体HSP702-GFP-pD5H8的构建方法，包括如下步骤：

A、将质粒rDNA-GFP经Not I酶切，然后回收2.1kb DNA小片段，得到HSP70-15′UTR-GFP-HSP70-13′UTR；

B、将HSP70-15′UTR-GFP-HSP70-13′UTR经BglII酶切，然后回收1.2kbDNA片段，得到GFP-HSP70-13′UTR，两端酶切位点为BglII与Not I；

C、合成PCR扩增嗜热四膜虫SCP2基因启动子的引物，其序列如下：

上游引物：5′GCG GCC GCT GTT GAA ATG CCT TGC TTG T-3′(下划线为Not I酶切位点)

下游引物：5′AGA TCC AAC GGC GAA GTG GTA AAC AG-3′(下划线为BglII酶切位点)；

D、以嗜热四膜虫基因组DNA为模板，用上述引物扩增得到的SCP2基因启动子片段与pGEM-T载体连接，得到质粒T-SCP2；

E、将质粒T-SCP2经BglII+Not I酶切，然后回收大片段，其长度为3kb；

F、将步骤B中回收得到的1.2kb DNA片段GFP-HSP70-13′UTR与步骤E中回收得到的3kb DNA片段连接，得到质粒GFP-BglII，克隆示意过程见图1(质粒rDNA-GFP经Not I酶切得到片段HSP70-15′UTR-GFP-HSP70-13′UTR，片段HSP70-15′UTR-GFP-HSP70-13′UTR经BglII酶切得到片段GFP-HSP70-13′UTR；PCR扩增得到SCP2基因启动子片段，接着与PGEM-T载体连接得到质粒T-SCP2，质粒T-SCP2经BglII+Not I酶切后与片段GFP-HSP70-13′UTR连接得到质粒GFP-BglII)；

G、合成PCR扩增步骤F中得到质粒GFP-BglII的引物，以修改BglII酶切位点变为BamH I酶切位点，其序列如下：

上游引物：5′GGA TCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CT-3′；(下划线为BamHI酶切位点)

下游引物：5′-TAG AAT ACT CAA GCT ATG CAT CCA AC-3′；

H、以步骤F中得到质粒GFP-Bgl II为模板，用上述引物扩增得到片段GFP-BamH I，其一端含有BamH I酶切位点，将该片段与pGEM-T载体连接，得到质粒T-GFP，克隆示意过程见图2(质粒GFP-Bgl II经PCR扩增得到片段GFP-BamH I，接着与pGEM-T载体连接得到质粒T-GFP)；

I、将步骤H中的质粒T-GFP经BamHI+SphI酶切，然后回收小片段，其长度为1306bp；

J、合成PCR扩增嗜热四膜虫HSP70-2基因启动子的引物，其序列如下：

上游引物：5′GCG GCC GCA ATT GTT CTT GCT TGT TTT GG-3′(下划线为Not I酶切位点)

下游引物：5′GGA TCC AGC TTT TTA TTT TCC AGA CAT-3′(下划线为BamH I酶切位点)；

K、以嗜热四膜虫基因组DNA为模板，用上述引物扩增得到的HSP70-2基因启动子片段与pGEM-T载体连接，得到质粒T-HSP702；

L、将质粒T-HSP702经BamH I+SphI酶切，然后回收大片段，其长度为4132bp；

M、将步骤I中回收得到的小片段与第L步中回收得到的大片段连接，得到质粒HSP702-GFP，对质粒HSP702-GFP进行测序，得到HSP70-25′UTR-GFP-HSP70-13′UTR片段(图3中HSP702-GFP载体图的HSP70-25′UTR部分、GFP部分、HSP70-13′UTR部分)的序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，克隆示意过程见图3(PCR扩增得到HSP70-2基因启动子片段，接着与pGEM-T载体连接得到质粒T-HSP702；质粒T-HSP702与质粒T-GFP分别经BamH I+SphI酶切后连接，得到质粒HSP702-GFP)；

N、将步骤M中得到质粒HSP702-GFP经Not I酶切，然后回收含HSP70-25′UTR-GFP-HSP70-13′UTR的小片段，其长度为2341bp，酶切结果见图5中的泳道“1”(质粒HSP702-GFP经Not I酶切所得电泳结果)；

O、将质粒pD5H8经Not I酶切，回收长度为13839bp的大片段，酶切结果见图5中的泳道“2”(质粒pD5H8经Not I酶切所得电泳结果)，并用热敏磷酸酶对该回收大片段进行去磷酸化处理；

P、将步骤N中回收得到的小片段与第O步中经去磷酸化酶处理后得到的大片段连接，得到所述表达载体HSP702-GFP-pD5H8，克隆示意过程见图4(质粒HSP702-GFP与质粒pD5H8经Not I酶切后连接，得到质粒HSP702-GFP-pD5H8)。将质粒HSP702-GFP-pD5H8经Not I酶切鉴定，得到约2.3kb与14kb的两个片段，酶切结果见图5中的泳道“3”(质粒HSP702-GFP-pD5H8经Not I酶切所得电泳结果)，表明载体构建正确。用此载体转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，用于其增殖和-70℃加甘油保藏。

本发明提供了一种含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体HSP702-GFP-pD5H8，将四膜虫热休克蛋白70启动子、编码绿色荧光蛋白的基因gfp、四膜虫热休克蛋白70终止子连接进嗜热四膜虫的rDNA载体pD5H8中，连入的三部分序列HSP70-25′UTR-GFP-HSP70-13′UTR为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。这些序列由联合基因上海联众基因研究院经2次测序确认。HSP70-25′UTR-GFP-HSP70-13′UTR全长2341bp，具体位置信息描述如下：

Not I酶切位点为：1-8和2334-2341；

BamH I酶切位点为：1127-1132；

Xho I酶切位点为：1850-1855；

HSP70-2基因启动子(HSP70-25′UTR)：9-1126；

gfp基因起始密码子(ATG)：1133-1135；终止密码子(TGA)：1847-1849；

HSP70-1基因终止信号(HSP70-13′UTR)：1850-2333。

将本发明的表达载体HSP702-GFP-pD5H8，经电穿孔法转染到四膜虫体内，然后将转染过的四膜虫暴露在一定浓度范围的TBT环境中(1μg/L至100μg/L)，通过观察四膜虫细胞荧光强度的大小，以确定环境TBT浓度的高低，这在检测水环境中TBT的污染具有重要的应用价值。

本发明中所用不同交配型的野生型嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)B2086与CU428株系信息参考Hamilton与Orias(Hamilton EP，Orias E.Geneticcrosses：setting up crosses，testing progeny，and isolating phenotypic assortants.Method Cell Biol：Tetrahymena thermophila.Academic press.2000，vol 62：219-228.)；SPP培养基配方参考Orias等(Orias E，Hamilton EP，Orias JD.Tetrahymena as a laboratory organism：useful strains，cell culture，and cell linemaintenance.Method Cell Biol：Tetrahymena thermophila.Academic press.2000.vol62：194.)；四膜虫细胞的固定、计数方法参考章宗涉、黄祥飞编著的《淡水浮游生物研究方法》(北京：科学出版社。1991：334-339。)；电穿孔技术方法参考Gaertig等(Gaertig J，Kapler G.Transient and stable DNAtransformation of Tetrahymenathermophila by electroporation.Method Cell Biol：Tetrahymena thermophila.Academic press.2000，vol 62：485-500.)；TBT溶液配制方法参考Feng等(Feng LF，Miao W，Wu YX.Differentially expressed genes of in response to tributyltin(TBT)identified by suppression subtractive hybridization and real time quantitative PCR.Aquat Toxicol.2007，81(1)：99-105.)；图像分析软件Image-Pro Plus 6.0使用方法参考Media Cybernetics公司编写的《Image-Pro Plus v6.0(for windows)快速入门指南》。

载体HSP702-GFP-pD5H8转染进四膜虫用于TBT检测中的应用基本操作步骤如下：

(1)载体HSP702-GFP-pD5H8经电穿孔法转染到四膜虫体内。

A.将不同交配型的野生型嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)B2086与CU428株系分别在50ml SPP培养基中培养，直至密度长到3×10⁵个/ml。

B.用10mM pH7.530℃温育的Tris缓冲液(上海三浦化工有限公司产品)洗涤四膜虫2次。

C.用10mM pH7.5的Tris缓冲液调整细胞密度至3×10⁵个/ml，并于30℃水浴中温育2小时。

D.将B2086与CU428按1∶1细胞数目比例在2L容量的锥形瓶内混合，并于30℃水浴摇床160rpm振荡18小时。

E.停止振荡10小时后，取15ml配对四膜虫(4×10⁷个细胞)用10mMpH7.530℃温育的Hepes缓冲液(Sigma公司产品)清洗四膜虫一次，并富集至125μl。

F.将富集的125μl四膜虫与50μg相同体积的30℃温育的质粒HSP702-GFP-pD5H8混匀，并迅速转移到30℃温育的0.2cm电击杯(Bio-Rad公司产品)中，用Bio-Rad电穿孔仪进行电击，电击参数为：300V，25μF，50Ω，电击后的电击杯于室温(20-25℃，以下相同)静置1min。

(2)转染后四膜虫的培养及筛选

A.将电击后的四膜虫转移到24ml SPP培养基中，于30℃恒温箱静置2小时，然后均匀分装到24孔一次性培养皿(CellStar公司产品)。

B.电击12～16小时后向24孔培养皿内加巴龙霉素(Sigma公司产品)，使每孔内的巴龙霉素浓度达到100μg/ml。

C.电击后第3天，将长势良好的四膜虫转移至新的24孔一次性培养皿中，并将巴龙霉素浓度提高至200μg/ml。此后每天增加的巴龙霉素浓度梯度为200μg/ml，直至1000μg/ml。

D.从1000μg/ml巴龙霉素浓度下长势良好的四膜虫培养液中挑取单个四膜虫细胞到96孔一次性培养皿(CellStar公司产品)中。

E.单细胞挑选3天后，从96孔一次性培养皿内选取长势良好的四膜虫转移到含有2ml SPP培养基的24孔一次性培养皿中30℃恒温培养，保持培养基内巴龙霉素浓度为1000μg/ml。

F.待24孔一次性培养皿中四膜虫长到对数期时，加入TBT至终浓为50μg/L，处理1小时。

G.处理四膜虫用ZEISS显微镜(Zeiss Axioplan 2imaging显微成像系统)在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导的四膜虫进行荧光检测，四膜虫发出强烈的绿色荧光，则相应的96孔一次性培养皿内筛选到的四膜虫转染成功，四膜虫的rDNA上含有HSP702-GFP-pD5H8片段。

(3)转染的四膜虫在TBT检测中的应用。

A.将转染成功的四膜虫转接至装有50ml SPP培养基的锥形瓶中于30℃培养，巴龙霉素浓度为1000μg/ml。

B.待四膜虫密度长至3×10⁵个/ml，取2ml四膜虫于24孔一次性培养皿中，共取4孔，并在每孔内加入不同浓度的TBT(1μg/L，15μg/L，50μg/L，100μg/L)溶液，处理1小时。

C.取TBT处理后的1ml四膜虫富集至50μl，离心条件为：1500rpm、30℃、2min，然后用ZEISS显微镜在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导的四膜虫进行荧光观察，并用ZEISS显微镜配套的数码成像系统拍照记录，照片保存格式选用TIF，如图8所示。

D.为方便高效地评估四膜虫在TBT处理条件下所产生的绿色荧光强度，申请人用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics公司产品)计算所拍照片上四膜虫产生绿色荧光强度的光密度值，一个四膜虫产生的绿色荧光强度计为一个光密度值。用SPSS 13.0统计4个浓度的TBT处理条件下四膜虫产生的平均光密度值(表1)，其中Mean表示平均光密度值，N表示某一浓度TBT处理条件下拍照记录的四膜虫个数，Std.Deviation表示样本均数标准差。

表1.不同浓度TBT处理条件下四膜虫产生的平均光密度值

E.从表1中，可以看出随着TBT浓度的升高，四膜虫产生的光密度值也随之增加，提示我们，TBT浓度与光密度值间存在某种相关性。将TBT浓度与每个四膜虫产生的光密度值之间用SPSS 13.0进行相关性分析，结果如表2所示。

表2.TBT浓度与光密度值之间的相关性分析

^＊＊Correlation is significant at the 0.01 level(2-tailed).

F.从表2中，可知TBT浓度与光密度值是显著相关的，可进一步做回归分析。以不同浓度的TBT为自变量，在不同浓度的TBT处理条件下四膜虫产生的光密度值为因变量，用SPSS 13.0计算光密度值与TBT浓度之间的关系。在多次实验中，申请人都模拟出了TBT浓度与光密度值间关联度很好的线性关系。以图9为例(所用数据为表1中的764个光密度值)：R²＝0.805，说明TBT浓度对四膜虫产生绿色荧光强度的光密度值的解释力度达到80.5％；p＝1.320462991774e-272＜0.01，说明TBT浓度与光密度值的关系是为Y＝411*X+255。此结果证明了在不同批次的实验中，转染四膜虫产生的绿色荧光强度与TBT的浓度间存在着线性关系，且结果可信、重复性高，能够快速、高通量检测一定浓度范围的TBT。

综上所述，所述表达载体HSP702-GFP-pD5H8上含有四膜虫HSP70-2基因启动子序列、gfp基因、与四膜虫rDNA序列高度相似的pD5H8载体序列，具有如下特征：

(1)表达载体HSP702-GFP-pD5H8上含有高效表达启动子。四膜虫HSP70-2基因启动子是一个强启动子，能高效启动下游基因的表达。与现已报道的四膜虫HSP70-1基因相比，在热激和TBT处理条件下，效率分别高1.9倍与1.5倍(见图6)，实现gfp基因的大量表达。

(2)该载体上含有可替换的外源基因gfp，通过替换不同的外源基因，以实现四膜虫作为一个外源基因表达系统；

(3)在巴龙霉素药物筛选作用下，表达载体HSP702-GFP-pD5H8替换掉四膜虫体内原有的绝大部分rDNA(见图7)，使外源基因在四膜虫体内大量倍增，高达8450个拷贝，实现目标基因的遗传转化。

本发明所述的载体HSP702-GFP-pD5H8经电穿孔法转染到四膜虫体内后用于检测环境中TBT的方法与现有技术相比具有以下优点：

(1)只需将表达载体HSP702-GFP-pD5H8经电穿孔法转染到四膜虫体内即可。

(2)将转染后的四膜虫暴露在1μg/L至100μg/L浓度范围的TBT环境中，通过观察四膜虫细胞的荧光强度，可确定环境中TBT浓度的高低，并且TBT浓度与光密度值间具有关联度很好的线性关系。

(3)暴露于TBT的每一个四膜虫产生的绿色荧光都被用来计算各个光密度值，因此基于光密度值所反映的环境中TBT浓度具有高度的可信性和可重复性。

(4)由于检测绿色荧光蛋白不需要破碎细胞，因此使用该法可对环境样品进行实时检测。

(5)相比化学分析法和免疫学法，该法检测简便、快速、费用低，以及可以高通量操作，更能准确反应TBT对生物机体的影响。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。

图1为质粒GFP-BglII构建示意图。

图2为质粒T-GFP构建示意图。

图3为质粒HSP702-GFP构建示意图。

图4为质粒HSP702-GFP-pD5H8构建示意图。

图5为质粒HSP702-GFP-pD5H8用Not I酶切结果。其中，M1：DNA分子标记，条带从大到小分别为7000、5500、3500、2000、1000、500bp；1：质粒HSP702-GFP被Not I酶切；2：质粒pD5H8被Not I酶切；3：质粒HSP702-GFP-pD5H8被Not I酶切；M2：DNA分子标记，条带从大到小分别为15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp。

图6为用实时定量PCR方法比较HSP70-1基因与HSP70-2基因分别在39℃热激与50μg/L浓度的TBT处理条件下的相对表达量。将四膜虫分别在39℃热激与50μg/L浓度的TBT条件下处理1小时，然后用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)分别抽提总RNA，接着用反转录试剂盒(Promega公司产品)将总RNA逆转录为cDNA(具体操作步骤参考Feng LF，Miao W，Wu YX.Differentiallyexpressed genes of in response to tributyltin(TBT)identified by suppressionsubtractive hybridization and real time quantitative PCR.Aquat Toxicol.2007，81(1)：99-105.)。根据嗜热四膜虫基因组数据库(Tetrahymena Genome Database，http://www.ciliate.org/)提供的全基因组序列，用软件Primer Premier 5.0分别设计嗜热四膜虫HSP70-2基因引物：hsp702-F：5′-ATC TTG GTT GAT GTC ACTCCT C-3′；hsp702-R：5′-TTC ATC CTC AGC CTT GTA TTA T-3′；与HSP70-1基因引物：hsp701-F：5′-AGA TAA TGG AGG AAC TTC TAC TGA-3′；hsp701-R：5′-AAG GTC TTT AGC ACT CAC ATT TA-3′。以上述2个处理条件下的cDNA为模板，用HSP70-1基因与HSP70-2基因特异引物分别进行扩增，采用实时定量PCR方法(Pfaffl MW，Horgan GW，Dempfle L.Relative expression software tool(REST)for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results inreal-time PCR.NucleicAcids Res.2002，30(9)：e36.)分析这两个基因在不同处理条件下各自的相对表达量。发现HSP70-2基因较HSP70-1基因在热激和TBT处理条件下的相对表达量分别高1.9倍与1.5倍，说明HSP70-2基因的启动子效率更高，对TBT的响应更敏感，能够实现gfp基因的高效表达，为后面应用GFP发光指示环境中TBT浓度高低打下了坚实的基础。

图7为四膜虫本身具有的rDNA与转染进四膜虫的质粒HSP702-GFP-pD5H8，二者的拷贝数比较。载体pD5H8上含有18s基因(GaertigJ，Gorovsky MA.Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila byelectroporation of conjugants.Proc Natl Acad Sci USA.1992，89(19)：9196-9200.)，故所构载体HSP702-GFP-pD5H8上同样也含有18s基因，选用18s基因可代表质粒HSP702-GFP-pD5H8与rDNA的拷贝数之和(Karrer KM.Tetrahymena genetics：two nuclei are better than one.Method Cell Biol：Tetrahymena thermophila.Academic press.2000，vol 62：138-140.)，选用gfp基因可代表质粒HSP702-GFP-pD5H8的拷贝数。通过比较18s基因与gfp基因之间的相对表达量，可推算出转染质粒HSP702-GFP-pD5H8在巴龙霉素药物筛选作用下四膜虫体内的拷贝数。由于只在同一个样品内比较不同基因相对表达水平的差异，不需要调整样品的初始浓度，所以这里就不需要看家基因来对样品的浓度进行标准化处理。根据嗜热四膜虫基因组数据库(Tetrahymena Genome Database，http://www.ciliate.org/)提供的全基因组序列和质粒T-GFP测序所得结果(见SEQID NO.1所示的核苷酸序列)，用软件Primer Premier 5.0分别设计18s基因引物：18s-F：5′-CCT GGG AAG GTA CGG GTA AT-3′；18s-R：5′-AAG GTT CAC CAGACC ATT CG-3′；与gfp基因引物：GFP-F：5′-GAA GCG TTC AAC TAG CAGACC-3′；GFP-R：5′-ATG TGG CTC CTT ATC TTA CCC TA-3′。以转染质粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜虫基因组DNA为模板，用实时定量PCR方法得到18s基因与gfp基因的相对数量比值为1.13，即rDNA∶HSP702-GFP-pD5H8＝13∶200(拷贝数之比)。已知野生型四膜虫体内rDNA拷贝数高达9000个，则转染质粒HSP702-GFP-pD5H8拷贝数与rDNA拷贝数之和也为9000个(TurkewitzAP，Orias E，Kapler G.Functional genomics：the coming of age for Tetrahymenathermophila.Trends Genet.2002，18(1)：35-40.)，rDNA与HSP702-GFP-pD5H8的拷贝数分别约为550个与8450个。所以，在巴龙霉素药物筛选作用下，质粒HSP702-GFP-pD5H8替换了四膜虫体内绝大部分的rDNA，使得外源基因gfp在四膜虫体内拷贝数大量倍增，实现了目标基因的遗传转化。

图8a为1μg/L浓度的TBT处理转染质粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜虫1小时后，在荧光显微镜下观察到的示意图；图8b为15μg/L浓度的TBT处理转染质粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜虫1小时后，在荧光显微镜下观察到的示意图；图8c为50μg/L浓度的TBT处理转染质粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜虫1小时后，在荧光显微镜下观察到的示意图；图8d为100μg/L浓度的TBT处理转染质粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜虫1小时后，在荧光显微镜下观察到的示意图。可以看到，本发明中的载体HSP702-GFP-pD5H8能在四膜虫体内顺利表达出绿色荧光蛋白；而且随着TBT浓度的增加，荧光信号有增强的趋势，此结果表明本发明中的载体HSP702-GFP-pD5H8在转染四膜虫后所产生的绿色荧光强度与环境中的TBT浓度间存在着正相关关系，这就为后面的用四膜虫产生的绿色荧光强度反映环境中的TBT打下了基础。

图9为不同浓度TBT处理条件下四膜虫产生绿色荧光强度与相应的TBT浓度间的线性关系图。根据每个浓度(1μg/L，15μg/L，50μg/L，100μg/L)TBT处理条件下四膜虫产生的绿色荧光强度，用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0得到相应的光密度值，一个四膜虫产生的绿色荧光强度计为一个光密度值。然后以不同浓度的TBT为自变量，在不同浓度TBT处理条件下四膜虫产生的光密度值为因变量，用SPSS 13.0模拟出了TBT浓度与光密度值间关联度很好的线性关系：R²＝0.805，说明TBT浓度对四膜虫产生绿色荧光强度的光密度值的解释力度达到80.5％；p＝1.320462991774e-272＜0.01，说明TBT浓度与光密度值的关系是为Y＝411*X+255。此结果证明基于本发明用转染质粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜虫反映环境中的TBT具有很高的可信性和可重复性。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明：

实施例1：

质粒T-GFP构建：

(1)将质粒rDNA-GFP经Not I在37℃酶切10小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，10μg质粒rDNA-GFP，5μl Not I酶，补无菌水至50μl。将酶切产物用1.0％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收2.1kb DNA小片段(回收过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书)，得到HSP70-15′UTR-GFP-HSP70-1 3′UTR片段。回收的2.1kb DNA小片段再用BglII在37℃酶切3小时，酶切体系为：5μl 10×Buffer，30μl回收的HSP70-15′UTR-GFP-HSP70-1 3′UTR片段，5μl BglII酶，补无菌水至50μl。将酶切产物用1.2％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收1.2kb DNA大片段，此步骤得到GFP-HSP70-13′UTR片段，酶切过程见图1。

(2)(a)根据嗜热四膜虫基因组数据库(Tetrahymena Genome Database，http://www.ciliate.org/)提供的全基因组序列，用软件Primer Premier 5.0设计引物。(b)所用引物如下：上游引物：5′GCG GCC GCT GTT GAAATG CCT TGC TTG T-3′，其中GCG GCC GC为Not I酶切位点；下游引物：5′AGA TCC AAC GGC GAA GTG GTA AAC AG-3′，其中AGA TCC为BglII酶切位点。(c)以嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila SB210)基因组DNA为模板，用Eppendorf PCR仪扩增出1239bp长度的SCP2基因启动子序列。(d)PCR反应体系组分：5μl10×Buffer(含MgCl₂)，1μldNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM Taq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(e)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(f)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃70s循环35次；72℃延伸10min。(g)用Biospin胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段后，与pGEM-T载体16℃过夜连接。(h)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。(i)挑取单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。(j)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒T-SCP2(质粒提取过程参考BioFlux公司的质粒DNA小量提取试剂盒说明书)。(k)质粒T-SCP2经BglII+Not I双酶切及Not I单酶切在37℃反应2小时，电泳鉴定表明质粒T-SCP2构建正确。(1)将经酶切鉴定的T-SCP2质粒送往联合基因上海联众基因研究院测序，测序结果表明SCP2基因启动子序列以逆时针方向插入。此步骤得到的质粒T-SCP2含有BglII、Not I、SphI酶切位点。具体克隆过程见图1。

(3)(a)将步骤(2)中得到的质粒T-SCP2经BglII+Not I在37℃酶切2小时，酶切产物用1.0％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收3kbDNA大片段。(b)将步骤(1)中回收得到的1.2kb“GFP-HSP70-13’UTR”DNA片段与步骤(3)中回收得到的3kb DNA大片段按5∶1的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。(c)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。(d)然后从中挑取单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。(e)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒GFP-Bgl II。(f)质粒GFP-Bgl II经BglII+Not I双酶切及Not I单酶切，在37℃反应2小时，电泳鉴定表明质粒GFP-Bgl II构建正确。(g)将经酶切鉴定的GFP-Bgl II质粒送往联合基因上海联众基因研究院测序，测序结果表明GFP-HSP70-13’UTR序列以顺时针方向插入。此步骤得到质粒GFP-BglII内含有GFP-HSP70-13’UTR序列，序列两端酶切位点为BglII与Not I。具体克隆过程见图1。

(4)(a)根据步骤(3)中测序得到的GFP-Bgl II序列，用软件Primer Premier5.0设计引物。(b)所用引物如下：上游引物：5′-GGA TCC ATG AGT AAAGGA GAA GAA CT-3′，其中GGA TCC为BamH I酶切位点，用于替换质粒GFP-Bgl II上的Bgl II酶切位点；下游引物：5′-TAG AAT ACT CAAGCT ATG CAT CCA AC-3′。(c)以步骤(3)中得到质粒GFP-Bgl II为模板，用EppendorfPCR仪扩增出1275bp长度的GFP-BamH I序列。(d)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TM TaqDNA Polymerase，补双蒸水至50μl。(e)加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。(f)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃70s循环35次；72℃延伸10min。(g)用Biospin胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段GFP-BamHI后，与pGEM-T载体16℃过夜连接。(h)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的固体培养基上培养16小时。(i)然后从中挑取单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5mlLB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。(j)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒T-GFP。(k)质粒T-GFP经BamH I+Not I双酶切及Not I单酶切在37℃反应2小时，电泳鉴定表明质粒T-GFP构建正确。(1)将经酶切鉴定的T-GFP质粒送往联合基因上海联众基因研究院测序，测序结果表明GFP-HSP70-13’UTR序列以逆时针方向插入到PGEM-T载体中。此步骤得到的质粒T-GFP含有BamHI、Xho I、Not I、SphI酶切位点。具体克隆过程见图2。

实施例2：

质粒T-HSP702构建：

(1)根据嗜热四膜虫基因组数据库(Tetrahymena Genome Database，http://www.ciliate.org/)提供的全基因组序列，用软件Primer Premier 5.0设计HSP70-2基因启动子引物。所用引物如下：上游引物：5′-GCG GCCGCA ATT GTT CTT GCT TGT TTT GG-3′，其中GCG GCC GC为Not I酶切位点；下游引物：5′GGA TCC AGC TTT TTA TTT TCC AGA CAT-3′，其中GGA TCC为BamH I酶切位点。

(2)以嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila SB210)基因组DNA为模板，用EppendorfPCR仪扩增出1132bp长度的HSP70-2基因启动子序列。

(3)PCR反应体系组分：5μl 10×Buffer(含MgCl₂)，1μl dNTP(10mM)，1μl上游引物(10μM)，1μl下游引物(10μM)，1μl DNA，0.5μl TITANIUM^TMTaq DNA Polymerase，补双蒸水至50μl。加样过程在冰上操作，加完后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪中。

(4)PCR反应条件：94℃变性5min；94℃30s，50℃30s，72℃70s循环35次；72℃延伸10min。

(5)将PCR产物用1.2％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，用Biospin胶回收试剂盒回收纯化目的DNA片段。

(6)pGEM-T载体与第(5)步中回收DNA按1∶5比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(7)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(8)挑取单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(9)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒T-HSP702。

(10)质粒T-HSP702经BamHI+Not I双酶切及BamHI+SphI双酶切在37℃反应2小时，电泳鉴定表明质粒T-HSP702构建正确。

(11)将经酶切鉴定的T-HSP702质粒送往联合基因上海联众基因研究院测序，启动子序列部分与四膜虫基因组数据库提供的序列一致，测序结果表明HSP702启动子序列以逆时针方向插入到pGEM-T载体中。

实施例3：

质粒HSP702-GFP构建：

(1)将实施例2中质粒T-HSP702经BamH I+SphI在37℃酶切2小时，酶切产物用1.2％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收4.1kb DNA片段。

(2)将实施例1中质粒T-GFP经BamH I+SphI在37℃酶切2小时，酶切产物用1.2％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收1.2kb DNA小片段。

(3)将步骤(1)中回收的4.1kb大片段与步骤(2)中回收的1.2kb小片段按1∶5的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(4)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(5)挑取单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(6)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒HSP702-GFP。质粒HSP702-GFP经BamHI+SphI双酶切及Not I单酶切，在37℃反应2小时，电泳鉴定表明质粒HSP702-GFP构建正确。将质粒HSP702-GFP送往联合基因上海联众基因研究院测序，测序结果表明HSP70-2基因启动子、添加酶切位点的DNA序列、GFP-HSP70-13’UTR序列与实施例1、2所得结果一致，详细见SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。此步骤得到的质粒HSP702-GFP含有BamH I、Xho I、Not I、SphI酶切位点。具体克隆过程见图3。

实施例4：

质粒HSP702-GFP-pD5H8构建：

(1)将实施例3中质粒HSP702-GFP经Not I单酶切10小时，酶切产物用0.8％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收2.3kb小片段，见图5中的泳道“1”所示DNA条带位置。

(2)将质粒pD5H8经Not I单酶切10小时，酶切产物用0.8％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，经电泳分离后，在紫外灯下用刀片切下目的带，然后用Biospin胶回收试剂盒回收13.8kb大片段，见图5中的泳道“2”所示DNA条带位置。

(3)用热敏磷酸酶对步骤(2)中的13.8kb大片段回收产物进行去磷酸化处理，反应在含1×热敏磷酸酶缓冲液的50μl体系中进行，37℃作用30min，然后65℃5min热失活。

(4)将步骤(1)中回收的2.3kb小片段与步骤(3)中经去磷酸化酶处理后的13.8kb大片段按5∶1的比例混合，加T4连接酶16℃过夜连接。

(5)连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16小时。

(6)挑取单个菌落转入含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(7)用质粒DNA小量提取试剂盒提取构建的新质粒HSP702-GFP-pD5H8。

(8)质粒HSP702-GFP-pD5H8经Not I单酶切，在37℃反应2小时，酶切产物用0.8％(质量比)琼脂糖凝胶进行电泳，电泳鉴定得到图5中的泳道“3”所示DNA条带位置所示，表明质粒HSP702-GFP-pD5H8构建正确。具体克隆过程见图4。

实施例5：

表达质粒HSP702-GFP-pD5H8的提取及转染进入四膜虫：

(1)将含有质粒HSP702-GFP-pD5H8的菌液转接到含有50μg/ml氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，在转速为200rpm的摇床上，37℃培养16小时。

(2)用E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid Mini Kit(Omega公司产品)去内毒素质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒HSP702-GFP-pD5H8，最后用200μl 10mMpH7.5的Hepes缓冲液(Sigma公司产品)洗脱回收柱上的质粒。提取的质粒HSP702-GFP-pD5H8用Biophotometer分光光度计(Eppendorf公司产品)测定DNA浓度，确认提取的质粒DNA浓度大于或等于0.4μg/ml，若低于该浓度，则需用3M醋酸钠加无水乙醇进行共沉淀来富集DNA，提高质粒DNA浓度(具体操作过程参考：J.萨姆布鲁克与D.W.拉塞尔著的《分子克隆实验指南》，黄培堂等译。2002年8月第三版，北京：科学出版社：1688-1689。)。

(3)四膜虫的培养。将不同交配型的野生型嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)B2086与CU428株系分别转接到50ml SPP培养基中，在转速为50rpm的摇床上，30℃培养，直至细胞密度长到3×10⁵个/ml。SPP培养基配方为：1％(质量比)Proteose peptore(Difco公司产品)，0.1％(质量比)yeast extract(Oxoid公司产品)，0.2％(质量比)glucose(分析纯，广州化学试剂厂产品)，0.003％Ferric citrate(Sigma公司产品)。计数细胞用鲁哥氏液(将6克的碘化钾溶于20毫升水中，待完全溶解后加入4克碘，摇荡，待碘完全溶解后，加入80毫升水)固定；在0.1ml10×10格玻璃计数框(本领域的普通技术人员均可制备)内计数，计算细胞密度。

(4)四膜虫的清洗。将50ml四膜虫转到50ml离心管(CellStar公司产品)内，用水平转子离心机(Eppendorf公司产品，本发明中所有四膜虫细胞的离心均用此离心机)1500rpm在30℃离心2min。离心结束后，用5ml移液器(Eppendorf公司产品)小心移去上清液体，然后加入10mM pH7.530℃温育的Tris缓冲液(上海三浦化工有限公司产品)清洗四膜虫2次。

(5)四膜虫的饥饿处理。清洗后向离心管中加入35ml10mM pH7.530℃温育的Tris缓冲液，轻缓振荡开沉淀四膜虫，然后将管内液体及四膜虫全部转移到无菌锥形瓶中，并于30℃恒温水浴静置2小时后计数，最后用10mM pH7.530℃温育的Tris缓冲液调整四膜虫密度至3×10⁵个/ml。

(6)不同交配型的四膜虫配对。将第(5)步中不同交配型的野生型嗜热四膜虫B2086与CU428按1∶1四膜虫细胞数目在2L容量的灭菌锥形瓶内混合，使瓶内液体在80～100ml之间。2L锥形瓶置于30℃水浴摇床160rpm振荡18小时后停止。停止振荡4小时后，用5ml移液管吸取0.5ml四膜虫，计算配对效率。若配对效率在80％以上，有利于提高后续的电穿孔实验效率。停止振荡10小时后，取15ml混合的配对四膜虫于50ml离心管中，1500rpm在30℃离心2min。用5ml移液器小心移去上清液体，然后加入10mM pH7.530℃温育的Hepes缓冲液(Sigma公司产品)清洗四膜虫一次。再次于1500rpm在30℃离心2min，弃去上清液，富集四膜虫至125μl。

(7)质粒HSP702-GFP-pD5H8通过电穿孔法进入四膜虫。将富集的125μl四膜虫与50μg相同体积的30℃温育的质粒HSP702-GFP-pD5H8在灭菌离心管中混匀，并迅速转移到30℃温育的0.2cm电击杯(Bio-Rad公司产品)中，然后立即放入电穿孔仪(Bio-Rad公司产品)进行电击，电击参数为：300V，25μF，50Ω，电击后的电击杯于室温静置1min。

实施例6：

转染后四膜虫的培养及筛选：

本发明中的四膜虫培养、筛选过程必须无菌操作，四膜虫的培养、筛选环境为30℃恒温箱内。具体步骤如下：

(1)将电击杯内的四膜虫用粗口吸管轻缓转移到30℃温育的装有24ml SPP培养基的锥形瓶中，接着在30℃恒温箱静置2小时，然后均匀分装到24孔一次性培养皿(本发明中所用24孔一次性培养皿均由CellStar公司提供)中。

(2)电击16～20小时后加巴龙霉素(Sigma公司产品)，使每孔内的巴龙霉素浓度达到100μg/ml。

(3)电击后第3天，观察培养皿内细胞生长情况，取100μl生长良好的四膜虫转移至新的24孔一次性培养皿中，加900μl SPP于其内，并且将巴龙霉素浓度提高到200μg/ml。

(4)电击后第4天，取100μl含巴龙霉素浓度为200μg/ml的四膜虫至新的24孔一次性培养皿，加900μl SPP于其内，并且将巴龙霉素浓度提高到400μg/ml。

(5)电击后第5天，取100μl含巴龙霉素浓度为400μg/ml的四膜虫至新的24孔一次性培养皿，加900μl SPP于其内，并且将巴龙霉素浓度提高到600μg/ml。

(6)电击后第6天，取100μl含巴龙霉素浓度为600μg/ml的四膜虫至新的24孔一次性培养皿，加900μl SPP于其内，并且将巴龙霉素浓度提高到800μg/ml。

(7)电击后第7天，取100μl含巴龙霉素浓度为800μg/ml的四膜虫至新的24孔一次性培养皿，加900μl SPP于其内，并且将巴龙霉素浓度提高到1000μg/ml。

(8)电击后第8天，在解剖镜(Zeiss)下，从含巴龙霉素浓度为1000μg/ml的四膜虫培养液中，用微毛细吸管(Sigma-Aldrich公司产品)挑取单个四膜虫到96孔一次性培养皿(CellStar公司产品)中，每孔内含一个四膜虫细胞和1000μg/ml巴龙霉素的150μl SPP培养基，共挑取48孔四膜虫。

(9)单个四膜虫细胞挑选3天后，在解剖镜下观察96孔一次性培养皿内四膜虫长势。

(10)选取长势良好的四膜虫转移到含有2ml SPP培养基的24孔一次性培养皿中30℃恒温培养，保持培养基内巴龙霉素浓度为1000μg/ml。

(11)待四膜虫长到对数期时，用浓度为50μg/L的TBT处理24孔一次性培养皿内四膜虫1小时。

(12)用ZEISS显微镜(Zeiss Axioplan 2imaging显微成像系统)在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导的细胞进行荧光检测，若细胞发出强烈的绿色荧光，则说明相应的培养皿孔内筛选到的四膜虫转染成功，四膜虫含有质粒HSP702-GFP-pD5H8。

实施例7：

转染质粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜虫在TBT检测中的应用：

(1)取200μl转染成功的四膜虫转接至装有50ml SPP培养基的锥形瓶中在30℃培养，巴龙霉素浓度为1000μg/ml。

(2)待四膜虫密度长至3×10⁵个/ml，取2ml四膜虫于24孔一次性培养皿中，共取4孔，并在每孔内加入不同浓度的TBT(1μg/L，15μg/L，50μg/L，100μg/L)溶液，30℃处理1小时。

(3)取TBT处理后的1ml四膜虫富集至50μl，离心条件为：1500rpm、30℃、2min，然后用ZEISS显微镜在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导的四膜虫进行荧光观察，并用ZEISS显微镜配套的数码成像系统拍照记录，照片保存格式选用TIF，如图8所示。

(4)用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics公司产品)计算所拍照片上四膜虫产生绿色荧光强度的光密度值，一个四膜虫产生的绿色荧光强度计为一个光密度值。

(5)对TBT浓度与其相应处理条件下四膜虫产生的光密度值用SPSS 13.0进行相关性分析(以表1中的764个光密度值为例)，所得结果见表2，可知光密度值与TBT浓度是显著相关的，可进一步做回归分析。

(6)以不同浓度的TBT为自变量，以不同浓度的TBT处理条件下四膜虫产生的光密度值为因变量，用SPSS 13.0对表1中的764个光密度值与4个TBT浓度做线性回归分析，所得结果见图9，直线的方程及其相关特征在图9的左上角标出。此结果证明了质粒HSP702-GFP-pD5H8转染四膜虫产生的绿色荧光强度与TBT的浓度间存在着线性关系，且结果可信、重复性高，申请人在多次实验中均得到了光密度值与TBT浓度间关联度很好的线性关系，用转染质粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜虫能够快速、高通量检测一定浓度范围的TBT(1μg/L至100μg/L)。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院水生生物研究所

<120>含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体及制备方法和应用

<130>含HSP70启动子和GFP的四膜虫转基因载体及制备方法和应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2341

<212>DNA

<213>人工构建的重组DNA序列

<400>1

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c                                                                    2341