一种结核分枝杆菌MPT64抗原的模拟表位肽及其应用

摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种能模拟结核分枝杆菌MPT64抗原的表位肽，以及该表位肽在结核病血清学检测中的应用。该表位肽的氨基酸序列通式为：X

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种能模拟结核分枝杆菌MPT64抗原的表位肽，以及该表位肽在结核病血清学检测中的应用。

背景技术

结核病是WHO重点控制的传染性疾病，目前仍是严重危害人民健康的公共卫生问题。据有关资料统计，全球约有1/3的人口感染结核菌，现有结核病人约2000万，每年新发病800万～1000万人，每年约有200万人死于结核病，是其它所有传染病死亡人数的总和。我国的结核病疫情极其严峻，现有结核感染者5亿，占全球的1/4，每年有13万人死于结核病，为其它各类传染病和寄生虫病死亡人数总和的2倍。

目前结核病控制存在的最主要问题是病人发现率低，治愈率低。在诊断方面，现有的检查方法均存在着一定的局限性，难以达到快速、准确的结核病诊断。因此，加大结核分枝杆菌的基础研究，寻找快速、灵敏、简便、实用的结核病诊断新方法，提高结核病人的检出率，是目前结核病研究需要迫切解决的问题。

血清学检查是目前结核病实验室三大诊断方法之一，相对细菌学和分子生物学检查具有多种优点，其方法简单、快速，价格便宜，不需要特殊的大型检测设备，即使基层医院也能够广泛开展，对痰涂片阴性的肺结核，肺外结核和不易获得痰标本的儿童结核的诊断均具有重要价值，成为了早期发现与诊断结核病的理想选择，但是常规血清学检查仍存在着敏感性、特异性较低的缺点，限制了临床应用，主要原因是难以得到高敏感性、高特异性的抗原。

MPT64是结核分枝杆菌中重要的保护性抗原，编码这种蛋白的基因只存在于MTB毒株中而卡介苗中缺失。研究发现MPT64免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫，并可有效抵抗MTB感染，因此MPT64蛋白作为检测抗原可有效区分卡介苗接种者与结核感染者，是结核病血清学诊断的理想抗原。然而完整蛋白的血清学检测结果并不理想，敏感性、特异性不能满足临床应用要求。(见实施方案2结果)

噬菌体展示随机肽库技术是将外源多肽展示于噬菌体颗粒表面的方法，是一种高效分子进化研究的高通量筛选体系，在免疫学、细胞生物学和药物开发等多个领域中得到了非常广泛的应用。目前，随机肽库技术已作为一种非常有效的技术广泛用于各种分子(包括蛋白、多糖、糖脂等)的抗原模拟表位的研究中，在以特异的抗体为靶分子，经过多轮噬菌体筛选后，可获得各种特异性强、亲和力高的模拟特定抗原表位结构和化学特征的多肽序列。应用噬菌体展示技术筛选获得的抗原模拟表位多肽分子作为半抗原不仅可以特异地识别并结合相应抗体，从而发现患者血清中的抗体，而且这些模拟多肽可以通过基因合成的方法大量生产，为抗体的特异性检测提供快速、灵敏、简便、实用的新方法。

噬菌体展示随机肽库技术在结核抗原模拟表位方面的应用也已有报道，Barenholz等在应用噬菌体展示随机肽库技术筛选结核菌糖脂抗原脂阿拉伯糖甘露聚糖模拟短肽的实验中证实，在血清学检测中该噬菌体展示短肽具有较好的敏感性和特异性，Gevorkian等研究发现，抗原决定簇是致免疫应答的决定部位，可作为免疫诊断中抗原的替代品。但应用噬菌体展示随机肽库技术筛选结核分枝杆MPT64抗原模拟表位的研究目前国内、外尚未见报道(根据维普、PubMed等中、英文数据库检索)。

发明内容

根据上述技术领域的研究进展，本发明提供一种能模拟结核分枝杆MPT64抗原表位的短肽，还公开了该短肽在结核病血清学检测中的应用。

一种结核分枝杆菌MPT64抗原的模拟表位肽，其氨基酸序列通式为：X₁DSMLX₂X₃，其中D代表天冬氨酸，S代表丝氨酸，M代表甲硫氨酸，L代表亮氨酸，X₁～X₃代表任意氨基酸。

上述结核分枝杆菌MPT64抗原的模拟表位肽，优选后特征在于X₁为S，X₂为L或S，X₃为W代表的色氨酸。

上述结核分枝杆菌MPT64抗原模拟表位肽在结核病血清学检测中作为检测试剂的应用。

本发明的发明人以结核分枝杆菌MPT64抗原的多抗兔血清为靶蛋白，从噬菌体展示的随机线形七肽库(New England Biolabs公司)中筛选到与之结合的短肽。所筛选到的短肽其氨基酸序列为X₁DSMLX₂X₃。

本发明的短肽可通过本发明技术领域中的常规技术如化学合成等方法制备。

附图说明

图1：SDS-PAGE检测MPT64蛋白及抗MPT64多抗的纯化结果。其中：0.低分子量蛋白Marker；1.纯化MPT64蛋白；2.纯化兔抗MPT64抗体

图2：单噬菌体的ELISA检测结果

图3：单噬菌体的竞争ELISA检测结果

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：结核分枝杆菌MPT64抗原模拟表位的筛选及序列分析

实验材料

1.噬菌体随机肽库试剂盒

噬菌体表面衣壳蛋白III展示的线形7肽库(Ph.D.-7TMPhage Display Peptide LibraryKit)试剂盒购自美国New England Biolabs公司。肽库的滴度为2×10¹¹pfu/ml。受体菌E.coli ER2738基因型为F’lacIqΔ(lacZ)M15proA+B+zzf::Tn 10(TetR)/fhuA2 supE thiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5(rk-m k- McrBC-)。DNA全自动测序引物(-96IIIsequencing primer)：5’-CCCTCATAGTTAGCGTA ACG-3’

2.结核分枝杆菌MPT64重组蛋白及抗MPT64的兔多抗血清

结核分枝杆菌MPT64重组蛋白及抗MPT64的兔多抗血清均由上海市肺科医院制备并保存。

3.化学试剂

BSA购自美国Sigma公司；HRP标记的抗M13噬菌体单抗购自瑞典Pharmacia公司；溴化氰活化琼脂糖凝胶(瑞典Amersharm公司)；酵母提取物、胰蛋白胨、Tween-20、EDTA和PEG-8000购自国药集团。

4.相关试剂的配制

LB培养基：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g和NaCl 5g溶解于蒸馏水并定容至1L，高压灭菌；

项层琼脂糖：LB培养基+1g/L MgCl2·6H2O+7g/L琼脂糖，高压灭菌；

底层LB平板：LB培养基+15g/L琼脂粉，高压灭菌，铺平板；

PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5mol/L NaCl。高压灭菌，室温贮存。

TBS缓冲液：50mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，150mmol/L NaCl。高压灭菌，室温贮存。

碘化钠缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA，4mol/L NaI。室温避光贮存。

5.主要仪器

ROTINA38台式冷冻高速离心机(德国Hettich公司)；Thermo MK3酶标仪(美国THERMO公司)；HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；蛋白电泳槽(BIO-RAD公司)；全自动高压灭菌器(日本Hirayama公司)；全自动凝胶成像分析仪(英国Syngene公司)；超纯水分离系统(英国USF Elga公司)；

1.1兔血清MPT64抗体的亲和纯化

交联：取一定量溴化氰活化琼脂糖凝胶柱料，按柱料说明书交联蛋白MPT64制成抗体纯化柱；

平衡：将MPT64亲合层析柱用0.02M PH7.4磷酸缓冲液清洗8-10柱体积，使柱平衡；

上样：待纯化的兔抗MPT64血清缓冲液对倍稀释后，2ml上样，弃掉前两滴，收集流出液，反复上样2-3次，并在柱上保留数分钟；

洗脱：先用3-5个柱体积的平衡液洗柱，洗掉非特异结合的部分，然后用0.1MGly-HClPH2.8的洗脱缓冲液洗脱2-5个体积，在每个收集管中预先加入1M NaHCO3中和液，使收集液近中性；

SDS-PAGE电泳鉴定：将收集液超滤浓缩，电泳鉴定纯度。

纯化鉴定：SDS-PAGE检测MPT64抗体纯化结果，见图1，经分光光度计计算，抗MPT64抗体纯化后的浓度为0.85g/L，纯化后的纯度在90％以上。

1.2纯化的抗MPT64多抗对七肽库进筛选

包被：抗MPT64多抗以100μg/ml包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜；

封闭：移动孔中的包被液，然后用5mg/ml BSA封闭包被孔300μl/孔，4℃封闭2h；

洗涤：移动封闭液，用TBST(0.1％Tween-20)洗6遍；

结合：用TBST稀释原代噬菌体库，每孔加入100μl，室温轻轻摇动孵育60min；

清洗：移动未结合的噬菌体肽库，按照上述清洗方法，用TBST洗10遍；

非特异性洗脱：用100μl/孔洗脱缓冲液(1mg/ml BSA、0.2mol/L Glycine-HCl，pH 2.2)室温轻摇10～15min洗脱。

中和：吸出洗脱液，加入含有15μl Tris-HCl(1mol/L，pH 9.1)中和缓冲液的离心管中，使洗脱液近中性；

滴度测定和噬菌体的扩增：取出10μl中和液用LB培养基按10-1～10-4稀释，进行噬菌体滴度的测定，剩余的扩增、纯化后重复步骤a-h进行下一轮筛选。

注：为了得到高亲和力的特异性结合噬菌体，在下一轮次中增加洗涤液TBST中Tween-20的浓度(可从0.1％增加到0.5％)。

1.3噬菌体的扩增和纯化

挑取宿主菌ER2738单菌落，接种于LB培养基中，37℃剧烈振动培养过夜。

过夜菌按1∶100接种于20ml LB培养基中，加入待扩增的噬菌体，37℃振摇培养4.5h；

将菌液转移至50ml离心管中，4℃、10000r/m离心10min；上清转移至另一离心管中，再次离心，将上清的80％转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀，4℃沉淀过夜。然后4℃、10000r/m离心15min，弃上清；

沉淀重悬于1ml TBS中，然后移至1.5ml离心管中，4℃、10000r/m离心5min，使残余细胞沉淀。

上清移至另一1.5ml离心管中，再加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀后于4℃沉淀1h。然后4℃、10000r/m离心10min；

沉淀重悬于含0.02％NaN3的100μl TBS中，4℃、10000r/m离心1min。取上清，4℃贮存备用。

1.4噬菌体滴度的测定

挑取宿主菌ER2738单菌落，接种于LB培养中，37℃剧烈摇至对数生长期(OD600≈0.5)；

37℃预温LB平板；

顶层琼脂在微波炉中融化后分装到无菌试管，每管3ml，保温于50℃水浴锅中；

用LB培养基将洗脱的噬菌体按10倍梯度系列稀释；

取10μl不同梯度的噬菌体稀释液分别加入200μl对数生长期的ER2738菌液中，涡旋混匀，室温孵育5min；

将上述混合液加入3ml顶层琼脂中迅速涡旋后，立即在37℃预热的LB平板上铺板，放置冷却后，培养箱中37℃倒置培养过夜；

计算噬菌斑数：在平板中选100个噬菌斑左右者进行计数，乘以稀释倍数即得每10μl原液所含噬菌体的个数，通常以pfu/μl或pfu/ml表示。

一般情况下，淘洗下来的噬菌体以10¹-10⁴倍稀释，扩增后的噬菌体以10⁸-10¹¹倍稀释。

1.5噬菌体单链DNA的制备、序列测定

将ER2738过夜菌按1∶100接种于LB培养基中，1ml/管分装于培养试管中，挑取噬菌斑加入其中，37℃振摇培养4.5-5h；

将500μl扩增后的噬菌体液体，10000r/m离心10min，取上清重复离心一次；

上清移至另一离心管中，加入200μlPEG/NaCl，混匀，室温放置10min；

10000r/m离心10min，弃上清，再短暂离心，吸尽上清；

用100μl碘化物缓冲液充分重悬沉淀，加入250μl乙醇，室温培养10min。4℃、10000r/m离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，用30μl TE溶解沉淀，送公司进行测序并翻译为氨基酸序列：(用M13反向-96位远端引物测序)

采用DNASTAR软件对短肽序列与MPT64氨基酸序列进行比较，发现16个单噬菌体展示短肽的核心序列均为DSML，是MPT64蛋白第224-227位氨基酸。

1.6噬菌体克隆与抗体结合活性的ELISA检测

包被：抗MPT64多抗以100μg/ml包被96孔酶标板，另设只加入包被液的空白对照，100μl/孔，4℃包被过夜；

封闭：移动孔中的包被液，然后用5mg/ml BSA封闭包被孔和空白对照孔300μl/孔，4℃封闭2h；

洗涤：移动封闭液，用TBST(0.1％Tween-20)洗6遍；

结合：用TBST稀释各单噬菌体及第1轮淘选后噬菌体(阴性对照)至滴度为10⁸pfu/μl，100μ/孔分别加入至包被孔和空白对照孔中，37℃1h；

洗涤：移动结合液，TBST洗板6次；

酶标抗体结合：在各反应孔中加入1∶5000稀释的HRP标记的抗M13噬菌体抗体，100μl/孔，37℃1h；

洗涤：移动反应液，TBST洗板6次；

显色：加入TMB底物显色，2mol/L H2SO4终止反应；

读数：分光光度计读OD₄₅₀。结果见图2。

1.7噬菌体克隆与MPT64蛋白的竞争ELISA检测

包被：抗MPT64多抗以100μg/ml包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜；

封闭：移动孔中的包被液，然后用5mg/ml BSA封闭包被孔300μl/孔，4℃封闭2h；

洗涤：移动封闭液，用TBST(0.1％Tween-20)洗6遍；

结合：将50μl MPT64蛋白(浓度分别稀释为1×10^-3、2×10^-3、4×10^-3、6×10^-3g/L、8×10^-3g/L)与50μl阳性单噬菌体(滴度稀释为10⁸pfu/μl)混合，加入至包被孔中，37℃1h；

洗涤：移动结合液，TBST洗板6次；

酶标抗体结合：在各反应孔中加入1∶5000稀释的HRP标记的抗M13噬菌体抗体，100μl/孔，37℃1h；

洗涤：移动反应液，TBST洗板6次；

显色：加入TMB底物显色，2mol/L H2SO4终止反应；

读数：分光光度计读D₄₅₀。结果见图3。

实施例2：阳性单噬菌体及MPT64蛋白对血清标本的检测

实验材料

血清标本：38份活动性肺结核患者(痰标本结核分枝杆菌培养均为阳性)和38份有卡介苗接种史的健康人血清标本均为上海市肺科医院血清标本库保存。

主要试剂：HRP标记的羊抗人IgG抗体购自美国Sigma公司

相关试剂的配制

包被液：17.5mmol/LNa2CO3、32.5mmol/L NaHCO3、15mmol/LMgCl2·6H2O，pH 9.6

PBS缓冲液：0.02mol/L Na2HPO4，0.02mol/L NaH2PO4.

酶工作液：3％BSA，PBS缓冲液

仪器设备

ROTINA38台式冷冻高速离心机(德国Hettich公司)；Thermo MK3酶标仪(美国THERMO公司)；HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；全自动高压灭菌器(日本Hirayama公司)；全自动凝胶成像分析仪(英国Syngene公司)；超纯水分离系统(英国USF Elga公司)

2.1阳性单噬菌体的制备：同1.4

2.2噬菌体滴度测定：同1.5

2.3血清标本的ELISA检测

包被：阳性单噬菌体用包被液稀释至1×10⁸pfu/μl，100μl/孔包被96孔酶标板，另取MPT64蛋白，浓度稀释至50μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃包被过夜；

封闭：移去孔中的包被液，PBST(0.05％Tween-20)洗板3次，用1.5％脱脂奶粉封闭包被孔300μl/孔，37℃封闭1h；

洗涤：移动封闭液，用PBST洗3遍；

结合：用PBST稀释活动性肺结核患者或有卡介苗接种史健康人血清至1∶400，100μ/孔，37℃2h；

洗涤：移动结合液，PBST洗板3次；

酶标抗体结合：在各反应孔中加入用酶工作液1∶10000稀释的HRP标记的羊抗人IgG抗体，100μl/孔，37℃1h；

洗涤：移动反应液，PBST洗板6次；

显色：加入TMB底物显色，2mol/L H2SO4终止反应；

读数：分光光度计读OD₄₅₀；

结果判定：以健康人血清检测值的平均值为阴性对照，检测结果与阴性对照比值≥2.1，判定为阳性。比较阳性单噬菌体M2、M6与MPT64蛋白对血清标本的检出率。结果见表1、2。

表1  阳性单噬菌体检测血清ELISA结果分析

表2  MPT64蛋白ELISA检测血清结果分析

实施例3抗原模拟表位肽在血清学检测中应用

实验材料

血清标本：51份活动性肺结核患者(痰标本结核分枝杆菌培养均为阳性)和36份有卡介苗接种史的健康人血清标本均为上海市肺科医院血清标本库保存。

3.1短肽合成：根据单噬菌体的血清学检测结果，选择检测结果较好的单噬菌体M2展示的短肽(命名为MP2)，短肽序列为SDSMLLW，委托公司进行体外合成。

3.2短肽溶解：取一部分短肽干粉，准确称量后，用超纯水溶解为10mg/ml的溶液，4℃保存。

3.3包被浓度判断：将短肽浓度倍比稀释至0.5μg/ml～32μg/ml(0.5，1，2，4，8，16，32)，分别包被96孔酶标板，4℃包被过夜，ELISA检测与血清中抗体结合活性。结果取4μg/ml作为最佳包被浓度。

3.4血清学检测

短肽用包被液稀释至4μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃包被过夜，ELISA检测过程及结果判定方法同2.3。结果见表3。短肽对血清标本的检出具有较高敏感性和特异性。

表3  MP2短肽ELISA检测血清结果统计分析

实施例4抗原模拟表位肽在血清学检测中应用

实验材料

血清标本：51份活动性肺结核患者(痰标本结核分枝杆菌培养均为阳性)和36份有卡介苗接种史的健康人血清标本均为上海市肺科医院血清标本库保存。

4.1短肽合成：根据单噬菌体的血清学检测结果，选择检测结果较好的单噬菌体M6展示的短肽(命名为MP6)，短肽序列为SDSMLSW，委托公司进行体外合成。

4.2短肽溶解：取一部分短肽干粉，准确称量后，用超纯水溶解为10mg/ml的溶液，4℃保存。

4.3包被浓度判断：将短肽浓度倍比稀释至0.5μg/ml～32μg/ml(0.5，1，2，4，8，16，32)，分别包被96孔酶标板，4℃包被过夜，ELISA检测与血清中抗体结合活性。结果取4μg/ml作为最佳包被浓度。

4.4血清学检测

短肽用包被液稀释至4μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃包被过夜，ELISA检测过程及结果判定方法同2.3。结果见表4。MP6短肽对血清标本的检出具有较高敏感性和特异性，略低于MP2短肽。

表4  MP6短肽ELISA检测血清结果统计分析