结核分枝杆菌分泌蛋白64抗原模拟表位的筛选研究

摘要

目的:应用噬菌体展示随机七肽文库筛选鉴定结核分枝杆菌MPT64蛋白的抗原模拟表位，为研究结核分枝杆菌特异性抗原表位提供思路，并为下一步开发新的结核抗体检测试剂提供依据。
　　 方法:以抗结核分枝杆菌MPT64蛋白的多克隆抗体为靶分子，应用噬菌体展示随机七肽库进行筛选，经4轮生物淘选后，随机选取40个单噬菌体进行测序，间接ELISA以及竞争ELISA实验，鉴定出阳性克隆。选取32份活动性肺结核患者和31份有卡介苗接种史健康人的血清标本，采用间接ELISA法对获得的阳性单噬菌体进行初步验证。合成阳性噬菌体展示的多肽，并将其进行血清标本的验证。
　　 结果:通过4轮生物淘选，能与靶分子特异性结合的噬菌体得到明显富集。随机选取的40个单噬菌体(M1-M40)进行测序分析，获得8种序列，其中M2单噬菌体展示肽的第2-5位氨基酸序列(DSML)与MPT64蛋白的第224-227位氨基酸序列完全一致。8种序列中各取1个克隆间接ELISA检测，发现两个具有较高亲和性的单噬菌体(M2，M6)，竞争ELISA实验检测，发现MPT64蛋白能够阻断两个单噬菌体与抗体的结合。间接ELISA检测发现，两种单噬菌体对结核患者血清标本检出的A450值明显高于对健康人的检出值。单噬菌体M2与MPT64蛋白检测血清相比，T检验P＜0.05，具有统计学意义。合成的M2模拟短肽检测血清标本的敏感性和特异性均较高，T检验P＜0.05，具有统计学意义。
　　 结论:利用噬菌体展示随机肽库技术淘选获得了2个MPT64蛋白的模拟表位，且分析M2单噬菌体展示肽的DSML序列极有可能是MPT64蛋白的一个线性表位，为研究MPT64蛋白的抗原表位提供了有效方法。且两个阳性单噬菌体对结核患者与健康人血清的检出值具有显著性差异，合成的M2模拟短肽检测血清标本的敏感性和特异性均较高，初步表明其可以作为新型结核病血清学诊断的候选试剂。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章引言

第二章材料与仪器设备

第三章方法

3.1随机肽库淘选及阳性克隆鉴定

3.1.1随机肽库的生物淘选

3.1.2噬菌体滴度的测定

3.1.3噬菌体单克隆DNA序列的测定

3.1.4噬菌体单克隆与靶分子结合能力的测定

3.1.5 MPT64蛋白竞争抑制阳性单克隆的结合试验

3.2阳性单噬菌体检测血清抗体试验

3.3模拟短肽检测血清抗体试验

3.3.1合成M2模拟短肽

3.3.2模拟短肽检测血清条件的摸索

3.3.3模拟短肽检测血清抗体

第四章结果与分析

4.1随机肽库淘选和克隆鉴定

4.2阳性单噬菌体检测血清抗体

4.3模拟短肽检测血清抗体

讨论

初步结论

存在的问题和解决途径

参考文献

综述 噬菌体展示技术在结核病研究中的应用

简历

致谢