一株含有基因组岛KpGI－2的肺炎克雷伯菌株

摘要

本发明属于微生物动物细胞系领域，涉及一株携带有与细菌生长有关的新基因组岛KpGI－2的肺炎克雷伯临床耐药菌株HS04160。已于2008年6月25日保藏，保藏单位：CGMCC，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.2558，分类命名：肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae。本发明通过对肺炎克雷伯临床耐药菌株的筛选，得到6.4kb的基因序列并证明其属新的基因组岛，细菌活细胞计数试验证明KpGI－2中携带的基因对细菌的生长分别具有促进/抑制作用，提示该基因组岛与细菌生长相关。本发明实验显示，KpGI－2参与了肺炎克雷伯临床菌株感染的致病过程。所述的含有基因组岛KpGI－2的菌株对于肺炎克雷伯菌株的致病与耐药有着重要影响。

说明书

技术领域

本发明属于微生物动物细胞系领域，涉及肺炎克雷伯临床耐药菌株，具体涉及一株肺炎克雷伯临床耐药菌株携带有与细胞生长有关的新基因组岛。

背景技术

目前，临床治疗中。医院获得性感染病人的比例日益增高，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是导致医院感染的主要条件致病菌之一，常引起呼吸道感染、尿路感染等，并常表现为对多种抗生素耐药。治疗实践发现，不同的肺炎克雷伯临床感染菌株的感染类型、细菌耐药种类存在着很大的不同。推测这些临床感染菌株在基因水平上可能存在着明显不同，因而决定了其众多特性不同。

近年有人提出了基因组岛的概念，认为除细菌基因组的保守骨架外，还存在着一些可变基因池，这些基因可以作为一个整体在不同菌株之间水平转移，这些可移动基因被统称为基因组岛。研究显示，基因组岛存在着一些共同的特征，包括GC含量与保守骨架序列不同，常位于tRNA基因位点后，两端通常带有保守的重复序列(Direct Repeats，DR)，常携带有编码整合酶或转座酶的基因(参与基因组岛的水平转移，位点特异性重组过程)，携带的基因片段较大通常10kb-100kb以上等。基因组岛携带的基因可以是某些与致病或耐药相关的毒力因子相关基因，也可以是与抗生素抗性、代谢等相关。基因组岛的水平移动使得细菌可以在短时间内获得新基因产生新特性，对于细菌获得致病性以及适应环境具有重要意义。

研究显示，基因组岛也存在于肺炎克雷伯菌株中。有研究发现编码氟甲砜霉素(Florfenicol)耐药的基因floR位于一个43kb的基因组岛上，该基因组岛与肺炎克雷伯菌属中结合性质粒R55有高度同源性。Bach S等发现耶尔森菌属一个与铁转运蛋白的合成、调节有关的致病岛HPI同时也存在于肺炎克雷伯菌株中。研究认为，基因组岛的存在对于细菌致病或耐药基因的获得以及适应环境具有重要意义。同时基因组岛的存在也被认为是微生物在短时间获得进化的主要方式之一。

由于基因组岛插入宿主基因组时，常与tRNA相界。tRNA被认为是基因组岛的插入热点。欧竑宇等人利用tRNA content and context(tRNAcc)分析的方法确定了E.coli中基因组岛插入热点tRNA在基因组中的位置，并通过tRIP PCR(tRNA site interrogation for pathogenicity islands，prophages and othergenomic islands PCR)方法证实了tRNAcc分析结果。

发明内容

本发明的目的是通过筛选肺炎克雷伯临床耐药菌株，提供一株含有新的基因组岛KpGI-2的肺炎克雷伯临床多重耐药菌株。

本发明对51株血液、痰、尿液、伤口分泌物来源的肺炎克雷伯临床耐药菌株采用引物phe55U和phe55D进行tRIP PCR扩增，得到了一个6.4kb的基因序列，定义为基因组岛KpGI-2，将该含有新的基因组岛KpGI-2的肺炎克雷伯临床多重耐药菌株命名为HS04160。已于2008年6月25日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：CGMCC No.2558，分类命名：肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae。

本发明的携带有基因组岛的肺炎克雷伯临床耐药菌株HS04160分离于一位临床尿路感染病人同时伴有白色假丝单胞菌感染，通过细菌活细胞计数试验证明KpGI-2含有的基因与细菌的生长相关。本发明实验显示，KpGI-2与肺炎克雷伯临床菌株适应新的寄生环境并进一步导致感染具有重要意义。所述的含有基因组岛KpGI-2的菌株对于肺炎克雷伯菌株的致病与耐药有着重要影响。

本发明细胞株与肺炎克雷伯MGH78578(GenBank accession number：CP000647)基因组DNA 3.72Mb处相对应地phe tRNA位点携带有一个新的与细胞分裂、增殖有关的基因组岛，具有序列1的结构。

所述的基因组岛KpGI-2长度为6.4kb，携带的基因与细胞生长相关。

本发明所述的含有KpGI-2肺炎克雷伯临床耐药菌株HS04160，通过下述方法识别鉴定得到：

1)采用tRIP PCR扩增肺炎克雷伯临床耐药菌株基因组岛；

2)将得到的6.4kb的PCR产物进行酶切、克隆，测序；

3)根据测序结果设计引物PCR扩增6.4kb基因片段上下游的未知序列；

4)将得到的序列结果拼接，进行序列分析确认，命名为KpGI-2；

5)将KpGI-2及其携带的基因分别克隆后进行细菌活细胞计数试验，确定其功能与细菌生长有关。

本发明采用tRNAcc分析确定肺炎克雷伯基因组岛插入热点phe55tRNA上下游的保守序列，设计了特异性的引物，采用tRIP PCR扩增，在一株肺炎克雷伯临床多重耐药菌株HS04160中得到了一个长为6.4kb的基因片段。

经分析确定该6.4kb的序列的GC含量为38.03％，与肺炎克雷伯菌属基因组GC含量(57.5％)存在着明显不同，因此确定该序列是外源性序列，该所述序列上存在着一个与沙门氏菌属(Salmonella enterica)同源的不完整的整合酶序列，位于phe55 tRNA之后。所述整合酶序列可能是由于基因组岛在不同菌株间水平移动发生同源重组过程中发生了改变，所以表现为不完整的整合酶序列；同时在这个序列上还存在着一个长为163bp的DR序列，所述DR与肺炎克雷伯MGH78578 phe tRNA位点上12.6kb的基因组岛中的DR序列完全一致。通过分析表明，所述的6.4kb的序列符合基因组岛的典型特征，故，定义其为新的基因组岛，命名为KpGI-2。

本发明采用Glimmer 3.02，GeneMark等生物信息学分析方法对上述基因组岛携带的基因进行了分析，结果显示，该基因组岛中存在着5个Orf：其中Orf 1是部分与沙门氏菌属同源的不完整整合酶基因，Orf 4与ATP依赖的RNA解旋酶具有同源性，在Orf 4中存在着两个蛋白保守结构域，分别为DEXDc和HELICc；DEXDc结构域中含有与ATP结合的位点；HELICc属于超螺旋蛋白家族C端结构域，该蛋白家族主要是参与利用三磷酸核苷酸提供能量解开DNA螺旋；Orf 5中包含了一个保守结构域，属于与细胞有丝分裂相关的Fic(Filamentation induced bycAMP，Fic)蛋白家族，该Fic蛋白家族可以通过叶酸代谢来调节细胞的分裂、增殖。

表1是KpGI-2基因注释表，其中列出了Orf在KpGI-2中的坐标位置，片段长度以及该Orf的同源性分析。

表1

已有研究发现含有fic基因的E.coli在cAMP作用后，细菌分裂受到抑制，细菌菌体由于不能正常分裂而有丝化现象，最终细胞生长受到抑制。另有研究证明毒素(Doc)/抗毒素(PhD)系统由fic基因进化而来。Doc/PhD是沉溺系统的一种，两个分子分别对细胞的增长起抑制/促进作用。通过二者的协同作用，使得细胞的生长处于一个平衡的状态。我们将含有KpGI-2基因组岛的基因(orf2-3，orf4，orf5)以及KpGI-2基因组岛本身分别与载体pUC19相连后克隆入宿主菌DH5α中，按照文献报道的方法进行细菌活细胞计数试验，观察这些克隆子对细菌生长的影响。结果发现KpGI-2基因组岛中的orf2和orf3基因联合对细菌的生长具有抑制作用，orf4和orf5则对细菌的生长具有促进作用。因此我们推测KpGI-2可能携带有一个与Doc/PhD类似的毒素/抗毒素分子调节系统。本发明基于现有研究发现细菌在不利的环境中会通过减慢生长速度等来减少自身的消耗维持菌体的生存，有利于细菌适应新的环境，推测含有与细菌生长相关基因的上述基因组岛参与了肺炎克雷伯临床菌株HS04160在尿路定居感染的过程。

本发明受国家863项目资助，项目编号：2006AA02Z328。

附图说明

图1是KpGI-2凝胶电泳图。

图2是KpGI-2基因序列(序列1)

KpGI-2全长6360bp，下划线部分序列为phe tRNA序列，阴影部分序列为163bp的DR序列，该序列与MGH 78578基因组3.72Mb处的phe tRNA位点基因组岛的DR序列完全一致。

图3KpGI-2基因注释图

图中按照比例标出了Orf的位置，Orf中的保守结构域用紫红色斜方格标出。

图4细菌生长图

含有KpGI-2及其携带的基因分别进行克隆。KpGI-2连入pUC19后构成克隆体pUCKp，orf2-3连入pUC19中后构成克隆体pUC2-3，orf4连入pUC19中后构成克隆体pUC4，orf5连入pUC19后构成克隆体pUC5。将这些克隆子分别转化入DH5α中。这些含有不同克隆子的菌株在含有5mM cAMP或者不含有cAMP的条件下进行培养，按照文献报道方法进行活细胞计数试验。最后计算不同时间点细菌的总数与0h的比值(结果取lg值)得到细菌在不同时间点的增长率。A没有cAMP作用下，在指定的时间点含有不同克隆体的细菌生长情况。B在5mM cAMP作用下，在指定时间点含有不同克隆体的细菌生长情况。从图中可以看到，含有orf2-3的克隆子在5mM cAMP作用下，细胞生长受到了明显抑制。而含有orf4或者orf5的克隆子在5mM cAMP作用6h后，明显促进了细胞的生长。

具体实施方式

实施例1基因组岛KpGI-2的发现与分析过程：

1)tRIP PCR筛选肺炎克雷伯临床耐药菌株中的基因组岛：根据tRNAcc分析确定了在肺炎克雷伯菌属中基因组岛的插入热点为phe55 tRNA位点，同时分析确定了在这个位点的上下游存在的保守序列。根据保守序列设计引物phe55U：5′-CGTGCTTTTAGCGCAATGT-3′；phe55D：5′-GACATAACCATTTACCCACTCGT-3′。tRIP PCR扩增条件为：94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 5min，共30个循环。比较基因组学方法分析表明，采用此对引物扩增基因组岛，在没有基因组岛插入的情况下，tRIP PCR扩增将得到一个0.5kb的片段。我们的tRIP PCR结果发现在一株肺炎克雷伯临床耐药菌株HS04160中扩增得到一个6.4kb的基因片段，怀疑为基因组岛插入。

2)6.4kb基因序列分段测序：将6.4kb的PCR产物回收纯化后，采用EcoRI和Bgl II酶切，得到了大小不等的片段，将这些片段与经过EcoR I和BamH I双酶切的pUC19载体用T4连接酶连接。将连接产物采用钙转法转化入DH5α感受态细菌中。于含有IPTG和氨苄抗生素的平板上培养过夜。挑选白色菌落进行酶切鉴定后测序。根据测序结果再次设计引物，EGxiao-1：5′-AGGTATATTTGCCGCAGATA-3′；EGxiao-2：5′-TATCTGCGGCAAATATACCT-3′。采用引物phe55U和EGxiao-2，EGxiao-1和phe55D分别扩增6.4kb基因序列的上下游未知片段，再次测序。将三次测序结果进行拼接，得到了一个6.4kb的基因片段。

3)基因序列分析：采用Blastn，Blastp，Blastx，tBlastn，tBlastx等方法对其进行基因分析。通过NCBI确定了其Orfs，并采用Glimmer 3.02，GeneMark对其Orf序列进行分析。确定了其中的Orf以及其中的保守结构域。

4)KpGI-2克隆：将6.4kb的KpGI-2的PCR产物两端联入限制性内切酶位点Sph I和SacI克隆到pUC19中，转化入DH5α中。挑选单克隆进行测序验证连接正确。

5)细菌活细胞生长试验：按照文章报道的方法进行活细胞生长试验。将含有KpGI-2及其基因分别进行克隆后转入宿主菌DH5α中。30℃培养过夜后，取20μl菌液用新鲜培养基(含有或者不含有5mM cAMP)稀释100倍后于37℃培养。在指定的时间点，分别取50μl菌液用LB稀释后铺板，于37℃孵育培养过夜后计算平板上的菌落数，计算细菌总数。计算指定时间点得到的细菌总数与0h的细菌总数的比值，将比值取lg值，得到细菌的生长图。

序列表-华山交大

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学附属华山医院，上海交通大学

<120>一株含有基因组岛KpGI-2的肺炎克雷伯菌株

<130>12

<160>1

<170>Patentln version 3.5

<210>1

<211>6360

<212>DNA

<213>Klebsiella pneumoniae

<400>1

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60

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序列表-华山交大

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