一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法

摘要

本发明公开一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法，涉及利用微生物发酵工程生产黄原胶技术领域。传统的黄单胞菌生产黄原胶的发酵方法，包括斜面母种、摇瓶培养、种子罐培养、全培养基发酵培养、发酵液提取阶段；本发明将发酵培养阶段设计为基础培养基发酵培养阶段包括补料培养基A流加、料培养基B流加、pH调控环节。在严格控制发酵液光密度的情况下依次分两步流加淀粉和含有淀粉质粗农产品，逐步增加碳氮比，通过酸碱中和液控制发酵pH值，达到了将工艺发酵时间从60－75小时缩短至40－48小时，高成本的工业原料改进为低成本的初农产品替代，原料成本降低15～20％，发酵时间缩短使能源消耗降低25～30％，通过试验数据表明，原料转化率达到85～90％，黏度提高10～20％。

说明书

技术领域

本发明涉及利用微生物发酵工程生产黄原胶技术领域，尤其是涉及一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法。

背景技术

黄原胶(Xanthan gum)，又称黄胶、汉生胶，是野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)以碳水化合物为主要原料，经发酵工程生产的一种用途广泛的微生物胞外多糖。1952年由美国农业部依利诺斯州皮奥里尔北部研究所分离到甘蓝黑腐病黄单胞菌，并使甘蓝提取物转化为水溶性的酸性胞外杂多糖而得到。由于该多糖具有很高的黏度、流动触变性和稳定的理化性质，且无毒，故作为添加剂在日用化学领域具有广阔的市场前景，是目前国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体、性能最优越的生物胶，广泛应用于食品、医药、采油、纺织、陶瓷、印染、香料、化妆品及消防等领域。但是，现有技术中利用微生物发酵工程生产黄原胶的生产成本是较高的，存在诸多不足与缺陷，其一传统的黄原胶生产方法，即利用微生物发酵，用玉米淀粉或蔗糖和蛋白胨或玉米浆做发酵培养基生产黄原胶，所用原料均为多糖和蛋白质等高分子化合物，导致被微生物利用缓慢而延长发酵周期，国内文献报道其发酵时间多在60～75小时，发酵时间长自然导致对水、电、蒸汽等能源的较大消耗；而部分采用现场糖化与水解法进行降解又增加工艺成本；其二、传统的发酵法多采用间断补料或一次性在培养基中将营养成分配制完毕，导致接种量大而须三级或更多级发酵，传热不充分引起能源利用率低下，未利用原料增加发酵液黏度引起氧传递效率的降低；其三、由于黄原胶产品高黏度的特性而发酵本身是一个高耗氧的过程，导致发酵后期工艺严重缺氧，发酵时间越长产品的黏度性能会逐渐下降，例如侧链基团的脱落和缺失，对获得高品质的黄原胶产品越不利。长期以来研究人员一直致力于通过各种方法努力降低其生产成本，例如中国专利申请号为200810137040.5的专利文献公开了一种黄单胞菌多糖培养基及其制备方法，特点是利用废淀粉水做培养基。而中国专利号为ZL03124005.4的专利文献公开了一种利用甜菜糖蜜发酵生产黄原胶的生产工艺等。本研究则针对传统生产工艺中存在的上述问题对其发酵培养基及其发酵方法进行了研究与创新，提出了一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是公开一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法，以克服现有技术在发酵周期、原料成本和能源消耗上存在的不足和缺陷，达到缩短发酵周期、降低原料成本、降低能源消耗之目的。

实现本发明之目的技术解决方案如下：

一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法，包括斜面母种、摇瓶培养、种子罐培养、全培养基发酵培养、发酵液提取阶段，其特征在于：全培养基发酵培养阶段设计为基础培养基发酵培养阶段包括补料培养基A流加，补料培养基B流加、PH调控环节，具体步骤如下：

(1)根据黄单胞菌可以充分快速利用单糖和水解蛋白等碳、氮源培养基，作为发酵培养基快速增殖黄单胞菌的原理，首先配制基础培养基，其基础培养基组分(g/L重量体积比)与制备为：

葡萄糖10；水解大豆蛋白胨1；尿素2，玉米浆干粉3；K₂HPO₄5，柠檬酸1，MgSO₄·7H₂O 0.3，CaCO₃3，121℃20min灭菌，灭菌后NaOH调PH至6.5～7.5，装料系数0.6；

(2)将级联放大培养后的黄单胞菌液体(菌种号CICC10258)接种至基础发酵培养基中，接种量10％(体积比)，pH值控制在6.5～7.5，温度30℃，发酵时间持续8～12小时；

补料培养基A和补料培养基B的组分(g/L重量体积比)与制备为：

a、补料培养基A

玉米淀粉120，玉米浆干粉60，柠檬酸2；

b、补料培养基B

玉米粉300，柠檬酸2；

培养温度：30℃，培养pH值6.5～7.5；

培养方式：耗氧培养；

培养基采用上述组分，均121℃，20min灭菌制备；

(3)用流加补料的方式按一定速率补加补料培养基A和补料培养基B到基础发酵培养基中，在其发酵液菌体繁殖到光密度为OD60010.0～12.0条件下将补料培养基A一次性补入发酵液中，发酵时间持续6～8小时即发酵前期；在补料培养基A按以上步补料结束后，即使用补料培养基B开始流加补料，快速流加补料16～20小时后将补料培养基B一次性补入发酵液中，同时将发酵液PH值调节到4.5～5.5培养，发酵时间持续持6～8小时即发酵末期结束发酵。

所述的一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法，其特征在于，补料流加方式按一定速率流加是指：补料培养基A的补料初始速率分别按30～60L/hr流加；补料培养基B的补料速率按40～50L/hr流加。

所述的一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法，特征在于，发酵过程中发酵液光密度总OD600控制在13.0～15.0；当总OD600在10.0～12.0时将补料培养基A一次性补加至基础发酵培养基中。

所述的一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法，特征在于，所述的发酵过程中前期发酵pH值控制在6.5～7.5的范围内，发酵末期控制在4.5～5.5范围内。

所述的一种黄单胞菌生产高黏度黄原胶的发酵方法，其特征在于发酵时间周期控制在40～48小时左右。

所述的碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米淀粉、土豆淀粉、玉米粉、木薯粉、薯干粉等一种或多种；所述氮源包括硫酸铵、氯化铵、尿素、水解大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆干粉等一种或多种。

与现有技术相比，本发明产生的优点及其有益效果是：其关键技术是将级联放大的黄单胞菌接入含单糖和水解蛋白等能被微生物快速利用的碳氮源培养基中，在严格控制发酵液光密度的情况下依次分两步流加淀粉和含有淀粉质粗农产品，逐步增加碳氮比，通过酸碱中和液控制发酵pH值，达到了将工艺发酵时间从60-75小时缩短至40-48小时、发酵时间缩短30％左右；将高成本的工业原料改进为低成本的初农产品替代，原料成本降低15～20％，发酵时间缩短后节约电能、工艺调整后节约消毒蒸汽致使能源消耗降低25～30％，通过试验的数据表明，原料转化率达到85～90％，黏度提高10～20％。

附图说明

图1是本发明所述的传统发酵法各工艺步骤示意框图。

图2是本发明所述的改进后的发酵法各工艺步骤示意框图。

图3是本发明所述的改进后的二次发酵法产品应用性能对比图表。

具体实施方式

结合附图与实施例对本发明做进一步的具体说明。从图1可知，传统的发酵法包括斜面母种、摇瓶培养、种子罐培养、二级种子培养、全培养基发酵培养、发酵液提取阶段。从图2可知，本发明所述的改进后的发酵法各工艺步骤是针对图1传统的发酵法中全培养基发酵培养阶段，本发明进行了创新设计，将该阶段设置为基础培养基发酵培养阶段包括补料培养基A流加、补料培养基B流加、PH调控等各技术环节步骤。具体步骤包括：首先配制基础发酵培养基开始发酵，其基础发酵培养基组分(g/L重量体积比)为，葡萄糖10；水解大豆蛋白胨1；尿素2，玉米浆干粉3；K₂HPO₄5，柠檬酸1，MgSO₄·7H₂O 0.3，CaCO₃3，灭菌后NaOH调PH至6.5～7.5，装料系数0.6；其次，将级联放大培养后的菌种号为CICC10258的黄单胞菌液体接种至基础发酵培养基中，接种量10％(体积比)，pH值控制在6.5～7.5，温度30℃，发酵时间持续8～12小时；其三，补料培养基A和补料培养基B的组分是重要的，通过试验证明玉米淀粉与玉米浆干粉的原料转化率分别为88％与87％，因此选用了玉米淀粉与玉米浆干粉等作为补料培养基的原料组分，其制备如下：

a、补料培养基A(g/L重量体积比)

玉米淀粉120，玉米浆干粉60，柠檬酸2；

b、补料培养基B

玉米粉300，柠檬酸2；

培养温度：30℃，培养pH值6.5～7.5；

培养方式：耗氧培养。

其四、把握好每步骤流加补料方式。需先按一定速率流加后再一次性补加；一定速率流加是指：补料培养基A的补料初始速率分别按30L/hr，40L/hr，50L/hr，60L/hr流加，补料培养基B补料速率40L/hr不变；补料培养基B的补料速率分别按30L/hr，40L/hr，50L/hr，60L/hr流加，补料培养基A补料速率50L/hr不变。用流加的方法按一定速率补加补料培养基A和补料培养基B到基础发酵培养基中，在其发酵液菌体繁殖到光密度为OD60010.0～12.0条件下将补料培养基A一次性补入发酵液中，发酵时间持续6～8小时；在补料培养基A按以上步补料结束后，即使用补料培养基B开始流加补料，快速流加补料16～20小时后将补料培养基B一次性补入发酵液中，同时将发酵液PH值调节到4.5～5.5培养，发酵时间持续持6～8小时后结束发酵，整个周期40～48小时。其五，发酵过程中发酵液光密度总OD600控制在13.0～15.0也是重要的；当总OD600在10.0～12.0时将补料培养基A一次性补加至基础发酵培养基中。其六发酵过程中，发酵前期pH值控制在6.5～7.5的范围内，发酵末期控制在4.5～5.5范围内。发酵时间周期控制在40～48小时左右。发酵结果如下表：(表1)

  批  次  培养时间  移种  OD600  补料更换  OD600  原料  转化率  6r/min黏度  (mPa·S)  产胶  得率  1  44  4.23  10.82  89.7％  33100  5.38％  2  40  4.18  10.88  87.0％  34300  5.22％  3  44  4.21  10.75  88.6％  33400  5.32％

图3是本发明所述的改进后的二次发酵法产品应用性能对比图表，可以证明本发明产生的有益效果。

所述的基础发酵培养基所需的的碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米淀粉、土豆淀粉、玉米粉、木薯粉、薯干粉等一种或多种可以选择使用。基础发酵培养基所需的氮源包括硫酸铵、氯化铵、尿素、水解大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆干粉等一种或多种可以选择使用。酸碱PH调节剂包括NaOH、碳酸钙、氧化钙、硫酸、磷酸等一种或多种可以选择使用。从下面表2可知本发明所述方法与单纯用淀粉或蔗糖发酵法相比，原料成本降低15～20％，能耗降低25～30％，黏度提高10～20％左右。

不同原料对黄原胶产量的影响                    (表2)

  原料成分  移种  OD600  补料更换  OD600  培养时间  6r/min黏度(mPa·S)  产胶率％  原料转化率  牛肉蛋白胨  4.15  10.86  44  29300  4.91  81.8  水解大豆蛋白胨  4.37  11.73  43  32200  5.20  86.7  黄豆饼粉  4.12  10.62  46  33400  5.13  85.5  玉米浆干粉  4.02  10.54  50  33900  5.09  84.8  葡萄糖  4.30  11.53  48  29700  4.96  82.7  蔗糖  4.21  10.91  46  29200  4.97  82.8  玉米淀粉  3.88  10.27  48  28800  4.88  81.3

实施例1

本发明采用二级发酵法

摇瓶培养：配制摇瓶培养基3L，摇瓶培养基组分(g/L体积重量比)：

葡萄糖15；水解大豆蛋白胨20；NaCl 10；

PH调节到7.0，分装6份，灭菌，超净台上各接1ml甘油管工作种子，30℃，16小时培养；

种子罐培养：种子培养基组分(g/L体积重量比)：

葡萄糖15；水解大豆蛋白胨20；NaCl 10；

配制种子培养基600L于1000L发酵罐中，PH调节到7.0，灭菌，接入摇瓶种子液，搅拌150~250转/min，通气0.3vvm，30℃，8~10小时培养，总OD到4.03移种；

发酵培养：基础发酵培养基组分(g/L体积重量比)：

葡萄糖10；水解大豆蛋白胨1；尿素2；玉米浆干粉3；K2HPO45；柠檬酸1；MgSO4·7H2O 0.3；CaCO33；121℃、20min灭菌，灭菌后NaOH调pH至6.5～7.5，配制基础发酵培养基6吨于10吨发酵罐中。

补料培养基A组分(g/L体积重量比)：

玉米淀粉120，玉米浆干粉60，柠檬酸2；

补料培养基B组分(g/L体积重量比)：

玉米粉300，柠檬酸2；

培养温度：30℃，培养pH值6.5～7.5；

培养方式：耗氧培养。

培养基采用上述组分，均121℃，20min灭菌制备；

配制补料培养基A1吨于2个600L补料罐中，5％泡敌于50L泡敌罐中，酸碱罐空消，灭菌，种子液移种至灭菌发酵液中，100～150转/min，通气0.3～0.6vvm，PH调节至6.5，30℃培养；同时按30L/小时开始补料，每隔4小时补料速率加倍，并取样检测OD600，发酵过程总OD控制在13.0～15.0；当总OD在10.0时，将剩余补料培养基A一次补入发酵液中，

配制补料培养基B1吨，灭菌待用；在上步补料结束后开始按40L/小时再补料，补料时间16～20小时后将剩余补料一次性加入发酵液中，同时将PH控制在4.5到发酵结束，发酵时间周期控制在44小时左右。

实施例2

除变更单因素外，培养基其它成分维持不变，均121℃，20min灭菌制备；

摇瓶培养：配制摇瓶培养基3L，pH调节到7.0，分装6份，灭菌，超净台上各接1ml甘油管工作种子，30℃，16hr培养；

种子培养：配制种子培养基600L于1000L发酵罐中，pH调节到7.0，灭菌，接入摇瓶种子液，搅拌150~250转/min，通气0.3vvm，30℃，8~10hr培养，总0D到4.21移种；

发酵培养：配制发酵培养基6吨于10吨发酵罐中，配制补料培养基A1吨于2个600L补料罐中，5％泡敌于50L泡敌罐中，酸碱罐空消，灭菌，种子液移种至灭菌发酵培养液中，100～150转/min，通气0.3～0.6vvm，pH调节至6.9，30℃培养；同时按40L/hr开始补料，每隔4hr补料速率加倍，并取样检测OD600，发酵过程总OD控制在13.0~15.0；当总OD在10.93时，将剩余补料培养基A一次补入发酵液中，并配制补料培养基B1吨，灭菌待用；在上步补料结束后开始按40L/hr补料，补料时间16~20hr后将剩余补料一次性加入发酵液中，同时将pH控制在4.9到发酵结束，发酵时间周期控制在40小时左右。

实施例3

除变更单因素外，培养基其它成分维持不变，均121℃，20min灭菌制备；

摇瓶培养：配制摇瓶培养基3L，pH调节到7.0，分装6份，灭菌，超净台上各接1ml甘油管工作种子，30℃，16hr培养；

种子培养：配制种子培养基600L于1000L发酵罐中，pH调节到7.0，灭菌，接入摇瓶种子液，搅拌150~250转/min，通气0.3vvm，30℃，8~10hr培养，总OD到4.18移种；

发酵培养：配制发酵培养基6吨于10吨发酵罐中，配制补料培养基A1吨于2个600L补料罐中，5％泡敌于50L泡敌罐中，酸碱罐空消，灭菌，种子液移种至灭菌发酵培养液中，100~150转/min，通气0.3~0.6vvm，pH调节至7.2，30℃培养；同时按50L/hr开始补料，每隔4hr补料速率加倍，并取样检测OD600，发酵过程总OD控制在13.0～15.0；当总OD在11.54时，将剩余补料培养基A一次补入发酵液中，并配制补料培养基B1吨，灭菌待用；在上步补料结束后开始按40L/hr补料，补料时间16～20hr后将剩余补料一次性加入发酵液中，同时将pH控制在5.2到发酵结束，发酵时间周期控制在45小时左右。

实施例4

除变更单因素外，培养基其它成分维持不变，均121℃，20min灭菌制备；

摇瓶培养：配制摇瓶培养基3L，pH调节到7.0，分装6份，灭菌，超净台上各接1ml甘油管工作种子，30℃，16hr培养；

种子培养：配制种子培养基600L于1000L发酵罐中，pH调节到7.0，灭菌，接入摇瓶种子液，搅拌150~250转/min，通气0.3vvm，30℃，8~10hr培养，总OD到4.33移种；

发酵培养：配制发酵培养基6吨于10吨发酵罐中，配制补料培养基A1吨于2个600L补料罐中，5％泡敌于50L泡敌罐中，酸碱罐空消，灭菌，种子液移种至灭菌发酵培养液中，100~150转/min，通气0.3~0.6vvm，pH调节至7.5，30℃培养；同时按60L/hr开始补料，每隔4hr补料速率加倍，并取样检测OD600，发酵过程总OD控制在13.0～15.0；当总OD在12.0时，将剩余补料培养基A一次补入发酵液中，并配制补料培养基B1吨，灭菌待用；在上步补料结束后开始按40L/hr补料，补料时间16～20hr后将剩余补料一次性加入发酵液中，同时将pH控制在5.5到发酵结束，发酵时间周期控制在48小时左右。

最佳实施例：

各培养基按权利要求书中的比例配制并灭菌；

摇瓶培养：配制摇瓶培养基3L，pH调节到7.0，分装6份，灭菌，超净台上各接1ml甘油管工作种子，30℃，16h培养；

种子培养：配制种子培养基600L于1000L发酵罐中，pH调节到7.0，灭菌，接入摇瓶种子液，搅拌150～250转/min，通气0.3vvm，30℃，10h培养，总OD到4.2移种；

发酵培养：配制发酵培养基6吨于10吨发酵罐中，配制1)补料培养基1吨于2个600L补料罐中，5％泡敌于50L泡敌罐中，酸碱罐空消，灭菌，种子液移种至灭菌发酵液中，100～150转/min，通气0.3～0.6vvm，pH调节至7±0.5，30℃培养；同时按40L/h开始补加补料培养基A，每隔4h补料速率加倍，并取样检测OD600，发酵过程总OD控制在13.0～15.0；当总OD在10.80时，将剩余补料培养基A一次补入发酵液中，并配制补料培养基B1吨，灭菌待用；在上步补料结束后开始按50L/hr补料，补料时间16hr后将剩余补料一次性加入发酵液中，同时将pH控制在5.0±0.2，8hr后结束发酵。发酵过程数据如下：

下面提供本发明所做的研究试验实施例数据：

1、不同补料培养基对黄原胶产量的影响试验

除补料培养基外，其余培养基中碳源采用葡萄糖，氮源采用水解大豆蛋白胨，其余成分维持不变，在补料培养基A成分改变时，补料培养基B不变，反之亦然，发酵工艺方法同上；

1)补料培养基A碳源分别采用蔗糖、玉米淀粉、玉米粉，氮源采用玉米浆干粉，补料培养基B用蔗糖作为碳源；

2)补料培养基B碳源分别采用蔗糖、玉米淀粉、玉米粉；补料培养基A碳源用玉米淀粉，氮源用玉米浆干粉。

发酵结果如下表：

试验1)

  原料成分  移种  OD600  补料更  换  OD600  培养时间  6r/min黏度  (mPa·S)  产胶率  ％  原料转化率  ％  蔗糖  4.38  11.64  42  32800  5.33  88.8  玉米淀粉  4.23  10.41  48  31600  4.82  80.3  玉米粉  4.42  9.96  58  29800  4.61  76.8

试验2)：

  原料成分  移种  OD600  补料更换  OD600  培养时  间  6r/min黏度  (mPa·S)  产胶率  ％  原料转化率  ％  蔗糖  4.27  11.64  42  34700  5.42  90.3  玉米淀粉  4.31  10.93  45  33900  5.28  88.0  玉米粉  4.52  11.50  46  33600  5.22  87.0

2、不同补料速率对黄原胶产量的影响试验

实验设计：发酵工艺方法不变，培养基配方按权利要求书中所述配方；

1)补料培养基A的补料初始速率分别按30L/hr，40L/hr，50L/hr，60L/hr，补料培养基B补料速率40L/hr不变；

2)补料培养基B的补料速率分别按30L/hr，40L/hr，50L/hr，60L/hr，补料培养基A补料速率50L/hr不变；

发酵结果如下：

试验1)：

  补料速率  移种  OD600  补料更换  OD600  培养时间  6r/min黏度  (mPa·S)  产胶率  ％  原料转化率  ％  30L/hr  4.03  10.69  46  30700  4.97  82.8  40L/hr  4.21  10.93  46  33500  5.16  86.0  50L/hr  4.18  11.50  46  33100  5.23  87.2  60L/hr  4.33  10.35  46  34400  5.12  85.3

试验2)：

  补料速率  移种  OD600  补料更换  时OD600  培养时  间  6r/min黏度  (mPa·S)  产胶率  ％  原料转化率  ％  30L/hr  4.03  10.69  46  31400  5.08  84.6  40L/hr  4.21  11.53  46  33800  5.13  85.5  50L/hr  4.18  10.77  46  34200  5.26  87.7  60L/hr  4.33  11.25  46  34500  5.19  86.5

3、补料更换菌体浓度对黄原胶产量的影响

实验设计：发酵工艺方法不变，培养基配方按权利要求书中所述配方；

补料培养基A更换为B时的发酵液总OD600分别为9.0、10.5、11.5、

13.0进行发酵实验；

发酵结果如下：

  补料更换时  OD600 移种OD600  培养时  间  6r/min黏度  (mPa·S)  产胶率  ％  原料转化率  ％  9.52  4.28  46  31400  5.07  84.5  10.48  4.13  46  34200  5.23  87.2  11.54  4.22  46  33900  5.17  86.2  13.03  4.36  46  29800  4.98  83.0

4、本发明与其它厂家生产的黄原胶性能对比情况

A：本发明所述方法生产的黄原胶，B、C：国内其它两个厂家生产地黄原胶；将三种黄原胶按相同比例与其他成分复配进行检测，数据如下：