真姬菇热激蛋白HmHSP70的氨基酸序列、基因序列及其表达载体

摘要

本发明涉及“真姬菇热激蛋白HmHSP70的氨基酸序列、基因序列及其表达载体”，属于分子生物学领域，本发明通过RACE－PCR技术获得热激蛋白完整开放读码框，据此推测出其编码的氨基酸序列，该基因在大肠杆菌中原核表达使大肠杆菌获得明显的耐热性，证明获得的基因序列为热激蛋白基因；该基因的获得为热激蛋白的研究提供了新的元素，该基因可应用于转基因工程中，使转入该基因的宿主获得耐热性。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种真姬菇热激蛋白HSP70的氨基酸序列、基因序列及其表达载体。

背景技术

真姬菇(Hypsizygus marmoreus)是一种珍稀食用菌，属于中偏低温型食用菌，在自然条件下多于秋末、春初发生。菌丝生长温度5～30℃，最适20～25℃，超过35℃或低于4℃时菌丝不再生长，在45℃以上无法存活。原基形成需10～16℃较低温度刺激。子实体生长温度以13～18℃最理想。催蕾时尤其要控制好温度。温度过高(＞25℃)或过低(＜5℃)时，应暂时停止出菇。当温度过高时，菌盖变薄且展开加快，菇体色泽变白，鲜菇品质明显下降。由于真姬菇生长温度的要求，限制了真姬菇的人工栽培。

热激蛋白(heat shock proteins，HSPs)，又称热休克蛋白，是细胞或生物体在一定时间(几小时、几分钟、甚至几秒钟)内遭受高于其正常生长温度8～12℃(一般成为亚致死温度sub-lethaltemperature)以上的温度时新合成的或含量增高的一类蛋白质(刘玲玉，孟玉强，杨学冬.热休克蛋白生物学作用的研究进展[J].阴山学刊，2007，21(1)：61～64)，从原核生物到真核生物，从动物、植物、微生物到人类整个生物界，无论培养细胞还是整个机体，热激处理后，都有HSP的表达。许多体外及体内的研究表明，HSPs在细胞中起分子伴侣的作用，作为“分子伴侣”，HSPs可以与正在合成的多肽结合，使其正确折叠；能够引导新生肽穿过细胞器膜结构，使蛋白定位于细胞的不同部位；在高温胁迫下，可以阻止热变性蛋白的聚集或阻止不可逆的蛋白变性，或有利于蛋白质在高温胁迫变性之后的复性，因此，热激蛋白在生物抗高温中的作用不言而喻。Edwards等的研究发现，许多细胞的耐热能力取决于细胞内热激蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)的合成，HSP70具有热保护作用。

热激蛋白的出现与细胞耐热潜力的发挥有关，它的出现为生物提供了一种暂时的保护机制。热激条件下，大部分生物体正常蛋白合成受到抑制，热激蛋白的合成开始出现。高温下生物体产生的热激蛋白可保护机体蛋白质免遭损伤或修复已受损伤的蛋白质，从而对生物体起到保护作用，热激蛋白的诱导形成使生物体提高耐热性。热锻炼过程中有大量热激蛋白的表达，大量的热激蛋白富集在膜组分上，具有阻止膜蛋白的变性、防止生物膜热破碎的功能。许多研究表明：HSP生成量与生物耐热性呈正相关，Lin等在1984年发现热激下黄化大豆苗中smHSP合成与其生长速度相关，推测smHSP参与幼苗获得耐热性过程。热激条件下，大部分植物热激蛋白的合成开始出现，例如无花果、大豆、黄瓜、烟草、蚕豆、番茄等，目前虽不清楚是否已检测到的每一种HSP都为产生耐热性所必需，但已证实某些HSP的确与植物体的抗热能力有关系。例如大豆HSP可阻止经热诱导的大豆幼苗溶质的渗漏，番茄及其它植物高温下在细胞质聚集形成的热激颗粒能对蛋白质的合成机器起保护作用。陈小军等将克隆到的大豆热激转录因子基因在大豆中过量表达，从而增加了几个热激因子的表达，提高了大豆的耐热性。杨金莹等(杨金莹，孙颖，孙爱清等.番茄LeHsp110/Clb基因的分子克隆及其对植物耐热性的影响[J].生物工程学报，2006，22(1)：52～57)利用农杆菌介导法，将CaMV35S驱动的反义LeHsp110PClpB的cDNA片段导入番茄，高温下转反义基因的番茄株系中LeHsp110P ClpB mRNA水平明显低于对照，转基因株系的光系统II对高温胁迫更加敏感

HSPs具有高度保守性及应激性，热应激蛋白家族是迄今为止发现的最为保守的蛋白家族之一。原核生物和真核生物的HSP70有40％～60％的同源性，而不同来源的真核生物其同源性为60％～78％。如：从大肠杆菌、酵母、果蝇和人体分离的分子量为70KDa的HSPs，如果对它们进行全氨基酸序列分析，就可发现它们具有80％以上的相似性。HSPs在进化过程中的高度保守性，说明它们具有普遍存在的重要生理功能。HSPs的另一特征是应激状态合成增加，而且HSPs增加速度很快，一般数分钟，最多30min即可达到最高水平，而其它的蛋白质合成则减少，物种及不同类型细胞产生的HSPs种类和数量是不同的，其中HSP70保守性较强，而小分子HSPs保守性较差。

目前人们对植物和动物体内热激蛋白已有较深刻的认识，关于微生物热激蛋白鲜有报道，而关于食用菌的热激蛋白尚未见报道，如果能使真姬菇过量表达热激蛋白70基因，提高真姬菇的耐受性，应对生产过程中气温的突然变化，可以解除人们栽培生产真姬菇的限制并为建立微生物热激蛋白研究平台奠定良好的基础。

发明内容

本发明针对上述领域的空白，提供一种真姬菇热激蛋白HSP70的氨基酸序列及其基因序列、引物，将该基因与表达载体连接导入大肠杆菌后使大肠杆菌耐高温的能力得到明显提高。

一种真姬菇热激蛋白HmHSP70，具有Seq ID No.6所示的氨基酸序列。

编码上述真姬菇热激蛋白HmHSP70的基因序列。

所述的基因序列，包含如Seq ID No 7所示的核苷酸序列。

所述的基因序列，具有如Seq ID NO 5所示的核苷酸序列。

所述的基因序列，具有如Seq ID NO 4所示的核苷酸序列。

根据上述基因序列设计的引物，具有如下核苷酸序列：

5’-CCCAAGCTTTCATGTTCACCGCCGCTG-3′，

5’-CCGCTCGAGGATTTGTCATGCATGTGAG-3′。

一种表达载体，包含有任一上述基因序列。

所述基因序列如Seq ID NO 5所示，所述表达载体命名为

pET32a-c(+)/HmHSP70。

转入上述的表达载体的细胞、组织或微生物。

所述基因序列的应用。

所述应用是指上述基因序列转入其他生物中使宿主获得耐热性。

本发明以真姬菇品种白真姬菇为材料，根据GeneBank中异丝绵霉(AKU02504)，光滑假丝酵母(AY077689)，葡枝根霉(AY147869)等的热激蛋白基因保守序列，使用Primer Premier5.0结合DNAMAN6.0程序设计一对简并引物P1/P2，从真姬菇基因组DNA中扩增出HmHSP70基因中间片段，经PCR鉴定后，将目的片段与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH₅感受态中，送交上海生工生物工程服务技术有限公司测序，片段长度为690bp，如Seq ID NO1所示，编码230个氨基酸；根据测序结果Seq ID NO1设计引物P3，P4，提取真姬菇菌丝体总RNA，利用PT-PCR和RACE技术相结合的方法，克隆测序出HmHSP70基因的3′末端序列，如Seq ID NO 2所示，和5′末端如Seq ID NO3所示；根据此两端序列拼接得到的如Seq ID NO4所示2308bp核苷酸序列设计引物HSPORF1/HSPORF2，以5’RACE cDNA为模板扩增HmHSP70全长基因，扩增产物为2145bp的片段，测序结果如Seq ID NO 5，分析结果显示其开放阅读框(open reading frame，ORF)共2001bp如Seq ID NO 7所示，编码667个氨基酸如Seq ID NO6所示。运用生物信息学方法进一步分析真姬菇HmHSP70基因的核酸序列和氨基酸序列，序列分析表明该基因属于HSP70基因家族，多序列比对的进化树结果表明，如图12所示，HmHSP70蛋白氨基序列与双色蜡蘑(XP_001880175)、新型隐球菌(XP_567978)、棒曲霉(XP_001275300)、裂殖酵母(XP_002172864)的氨基酸序列同源性分别达87％、71％、67％、67％；HmHSP70蛋白分子量为72.2KDa，等电点(PI，isoelectric point)为5.63，不稳定系数为36.67，疏水性分析为可溶性蛋白。

将获得的HmHSP70基因序列，如Seq ID NO 5所示核苷酸序列与骨架载体pET32a-c(+)连接构建得到原核表达载体pET32a-c(+)/HmHSP70，转入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导进行异源表达，提取表达蛋白经SDS-PAGE电泳分析，结果显示得到蛋白分子量约为92KDa的融合蛋白，与预期结果吻合。

转基因大肠杆菌经高温(50℃)热激处理后，通过对大肠杆菌活力的测定和大肠杆菌可溶性蛋白SDS-PAGE电泳检测，结果均表明，HmHSP70蛋白的异源表达可提高大肠杆菌耐高温的能力，如图11所示，且对大肠杆菌中其它蛋白有较好的保护作用。

由于密码子的兼并性，在不改变氨基酸序列的情况下，将本发明获得的如Seq ID NO 5、Seq ID NO7所示的核苷酸序列作适当的调整可以获得编码热激蛋白HmHSP70氨基酸序列的其他核苷酸序列，将这些调整后的核苷酸序列转入宿主，仍然可以使宿主获得耐热性，因此，基于本发明获得核苷酸序列Seq ID NO5、7调整后获得的能编码如Seq ID NO6所示的氨基酸序列的核苷酸系列也属于本发明的保护范围。

综上所述，本发明获得了真姬菇热激蛋白HmHSP70基因的完整开放读码框及热激蛋白的氨基酸序列，将含有该读码框的核苷酸序列转入适合的宿主体内，可使宿主表达热激蛋白并使宿主细胞获得耐热性，实验证明转基因大肠杆菌过量表达该热激蛋白后获得了耐热性，推测该基因转入其它生物中可是宿主获得耐热性。

附图说明：

图1.pMD^TM18-T vector质粒图谱；

图2.pET32a-c(+)质粒图谱；

图3.HmHSP70基因中间片段PCR产物分析；

泳道1-3：PCR产物  泳道M：Marker

图4重组pMD18-T质粒电泳图

泳道1-3为重组载体，泳道4为无插入片段对照

图5.重组pMD18-T质粒PCR鉴定电泳图；

泳道1-3为重组载体，泳道4为无插入片段对照

图6A.3′RACE产物电泳检测；

图6B.5′RACE产物电泳检测；

图7.扩展全长HmHSP70基因PCR产物检测；

图8.酶切pET-32a-c(+)/HmHSP70检测.

图9.pET-32a/HmHSP70重组表达蛋白产物的SDS-PAGE电泳图

M：蛋白质Marker；泳道1：IPTG诱导pET-32a/HmHSP70转化的菌液

泳道2：未经诱导的pET-32a/HmHSP70转化的菌液；泳道3：IPTG诱导的pET-32a转化的菌液

图10.高温(50℃)条件下转HmHSP70基因的大肠杆菌存活率比较

图11.热激条件下大肠杆菌表达目的蛋白SDS-PAGE分析

泳道从左到右因此为Marker，50℃处理0，30，60，90，120，150，180min的HmHSP70基因的大肠杆菌表达的蛋白。

图12.热激条件下非转基因大肠杆菌表达蛋白SDS-PAGE分析

泳道从左到右因此为Marker，50℃处理0，30，60，90，120，150，180min的对照大肠杆菌表达的蛋白。

图13.热激蛋白HSP70系统进化树分析。

具体实施方式

所用材料及试剂

1.1.1试验材料

1.1.1.1真姬菇菌株

真姬菇菌株白真姬菇，可在市场中买到，公众也可在青岛农业大学山东省农业应用真菌实验室得到)

1.1.1.2大肠杆菌菌株

大肠杆菌(E.coli)菌株DH_5α，为常用菌株，可在市场买到。

1.1.1.3克隆载体

本试验采用T载体：pMD^TM18-T Vector，购自大连TaKaRa公司，全长2692bp，携带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和LacZ基因，重组体可通过蓝白斑和氨苄抗性双重筛选鉴定，质粒如图1所示。

本试验采用表达载体：pET32a-c(+)，为常用载体，可在生物公司购买到，全长5900bp，携带有卡那霉素(Kan)抗性基因。质粒如图2所示。

1.1.2试验培养基

1.1.2.1 PDA固体培养基

马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然。

1.1.2.2 LB固体培养基

蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。

1.1.2.3 LB液体培养基

蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。

1.1.3试剂

总RNA提取试剂盒：Trizol试剂SK1311；

DNA回收试剂盒：EZ-10Spin Column DNA Gel Extraction Kit BS353；

Marker：GeneRuler^TM DNA Ladder Mix，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；

反转录试剂盒：RNAPCRKit(AMV)Ver3.0；

Taq^TM聚合酶：TaKaRa Taq^TM，购自大连TAKARA宝生物公司；

RACE试剂盒：SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit 634914，购自Clontech公司；

KOD-Plus酶，购自TOYOBO公司。

1.1.4仪器

PCR仪，核酸蛋白检测仪，凝胶成像系统，超低温冰箱，低温高速离心机，电泳仪，制冰机，恒温振荡培养箱，恒温培养箱，超净工作台，自动高压蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅，微量移液器，超纯水仪。

1.1.5常用溶液的配制，参照《分子克隆》第三版。

1.1.5.1DNA提取用试剂

提取缓冲液：2.5％CTAB(100mM Tris，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0，1.4M NaCl)

1.1.5.2 RNA提取用试剂

0.1％DEPC水：DEPC与去离子水1％(V/V)的比例混合，37℃放置2h轻摇后，121℃高压灭菌30min；

75％乙醇(V/V)：取75mL无水乙醇加0.1％DEPC水定容至100mL，4℃储存备用。

1.1.5.3 50×TAE(Tris-乙酸)

Tris                        24.2g

冰乙酸                      5.71mL

0.5mol·L^-1EDTA(pH8.0)      10mL

加去离子水定容至100mL，使用时用去离子水作50倍稀释，即为工作液。

1.1.5.4 TE Buffer(8.0)

Tris-碱                     1.21g

EDTA-Na₂                    0.37g

加去离子水800mL，用盐酸调pH值至8.0，用去离子水定容至1L，高压灭菌。

1.1.5.5氨苄青霉素储存液：

将1g氨苄青霉素溶解于10mL去离子水中，终浓度100mg·mL^-1，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。

1.1.5.6 X-gal：

50mg X-Gal溶于1mL二甲基甲酰胺，终浓度为50mg·mL^-1，分装，-20℃避光保存。

1.1.5.7 IPTG：

将IPTG配制成24mg·mL^-1(100mM)的水溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃储存备用。

1.1.5.8质粒DNA提取液

溶液I：

20mmol·L^-1葡萄糖                25mL

1mol·L^-1Tris-Cl(pH8.0)          2.5mL

250mmol·L^-1EDTA(pH8.0)          4mL

加去离子水定容至100mL，121℃高压灭菌15min，4℃贮存。

溶液II：

10mol·L^-1NaOH                    200μL

10％SDS(W/V)                      1mL

临用前加去离子水定容至10mL

溶液III：

乙酸钾(5mol·L^-1)                 60mL

冰乙酸                            11.5mL

加去离子水定容至100mL，4℃贮存。

1.1.6菌种培养及保存

1.1.6.1白真姬菇的培养及保存

真姬菇菌种白真姬菇在PDA固体培养基中25℃培养至满管，菌株保存在4℃。

1.1.6.2大肠杆菌的培养及保存

E.coli DH_5α在LB培养基中37℃培养过夜，菌株在含15％甘油的LB培养基中于-70℃保存。含有转化质粒的E.coliDH_5α菌株在含有100μg·mL^-1氨苄青霉素、15％甘油的LB培养基中于-40℃保存。

实施例1：克隆真姬菇HmHSP70基因中间片段

步骤1.白真姬菇的母种(孢子)接种到PDA平板上，25℃培养至满皿，收集菌丝。采用CTAB法提取基因组DNA，参照上官舟剑等的方法(上官舟建，谢宝贵，罗联忠等.真姬菇三个选育菌株的RAPD分析[J].中国食用菌，2004，3(23)：12～14)，并保存备用。

步骤1.设计简并引物

登录GenBank/DDBJ/EMBL数据库，根据登录的异丝绵霉(AKU02504)，光滑假丝酵母(AY077689)，葡枝根霉(AY147869)等的热激蛋白基因保守序列，使用Primer Premier5.0结合DNAMAN6.0程序设计一对简并引物：

P1：5’-GCTGTHRTYACHGTYCCAGCTTAYTTC-3’

P2：5’-RGCDACRGCYTCRTCNGGRTTRAT-3’

以上引物由上海生工生物工程公司合成，引物使用前由无菌双蒸水稀释到20μmol·L^-1。

步骤3.真姬菇HmHSP70基因中间片段的PCR扩增

以真姬菇基因组DNA为模板，采用简并引物P1，P2进行PCR扩增，获得真姬菇HmHSP70基因中间片段。

PCR体系为：

ddH₂0                            37.5μL

PCR buffer                       5.0μL

dNTP                             4.0μL

P₁                               1.0μL

P₂                               1.0μL

DNA模板                          1.0μL

Taq酶                            0.5μL

                                           

Total                            50.0μL

PCR程序：

94℃5min 94℃1min 56℃1min 72℃1min 共30个循环 72℃10min 4℃forever

扩增结束后，取2μL PCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，观察结果，如图3所示，产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，在700bp处有一条带于预期结果基本吻合，初步判断为目的条带，回收约700bp的目的基因片段，用上海生工DNA凝胶回收试剂盒EZ-10Spin Column DNA GelExtraction Kit进行回收纯化。操作如说明书

步骤4.

回收的PCR产物，与T载体pMD^TM18-T构建重组质粒，按T载体使用说明操作。

步骤5.重组质粒的转化

5.1CaCl₂法制备大肠杆菌DH_5α感受态细胞，也可以直接在生物公司购买到。

1)从LB平板上挑取E.coli单克隆，接种于50mL LB液体培养基中，37℃，200rpm摇菌过夜。

2)按1∶100的比例将1mL菌液转入100mL的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm摇菌至对数生长期(OD600＝0.3～0.5)

3)无菌条件下，将菌液转入无菌冰冷的100mL的大离心管中，冰浴10min，使菌液冷至0℃。

4)4℃，4000rpm离心10min，弃去上清，回收菌体。

5)以10mL 4℃预冷的0.1mol·L^-1的CaCl₂重悬菌体，动作要轻，操作在冰上进行。

6)4℃，4000rpm离心10min，弃去上清，回收菌体。

7)每50mL初始培养物用2mL冰冷的0.1mol·L^-1的CaCl₂重悬菌体。

8)以每份200μL分装至无菌的1.5mL小离心管中，如不马上用可加入终浓度为10％的甘油，置-20℃或-70℃保存备用。

注意：整个操作过程动作要轻，要在冰上进行，保持低温。

5.2.质粒向大肠杆菌中的转化(热激法)

1)取制备的E.coli感受态，每管中加入1μL质粒DNA(约50ng)或10μL的连接产物。

2)用枪轻轻混匀，或用手轻弹管壁混匀，置于冰浴30min。

3)取出，置于42℃水浴，热激90s。

4)快速将管移至冰浴，冷却1～2min，每管中加入600μL LB培养基，轻轻混匀。

5)置于37℃，120rpm轻摇1h左右，使细菌复苏。

6)用弯头玻棒将菌液均匀涂布于含Amp，X-gal和IPTG的LB琼脂平板上，干燥5～10min后，37℃过夜培养至长出单克隆菌落，然后于4℃冰箱放置3～4h，蓝白斑颜色更加明显。观察菌落的生长状况，进行蓝白斑筛选。

7)用灭菌牙签挑取数个白色单菌落分别接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养16h，提取质粒进行PCR检测；采用碱裂解法提取重组质粒DNA，对挑取的白斑菌落扩繁产物采用碱裂解法提取重组质粒DNA，电泳检测，如图4所示。

5.3重组质粒的PCR鉴定

将重组质粒作100倍稀释，取1μL做为模板，在PCR薄壁管中依次加入下列试剂：

ddH₂037.5μL

PCR buffer                5.0μL

dNTP                      4.0μL

P₁                        1.0μL

P₂                        1.0μL

DNA模板                   1.0μL

Taq酶                     0.5μL

Total                     50.0μL

设灭菌的双蒸水为对照。

按以下设置程序扩增：

94℃5min 94℃1min 56℃1min 72℃1min 共30个循环 72℃10min 4℃forever

结束后取2μL PCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，观察结果如图5所示，在约700bp处有一条带，将PCR鉴定为阳性的菌落进行测序。测序结果如Seq IDNo 1所示。

实施例2.克隆真姬菇HmHSP70基因两端片段。

步骤1.设计特异性引物

根据测序结果Seq ID No 1，使用Primer Premier5.0结合DNAMAN6.0程序设计真姬菇HmHSP70基因两端片段的特异性引物：

P₃：5’-CAACGACAGGCTACTAAGGATGCTGG-3’

P₄：5’-ACACGGGGCACACGAGTCATACC-3’

以上引物由上海生工生物工程服务技术有限公司合成，引物使用前由无菌双蒸水稀释到20μmol·L^-1。

步骤2提取真姬菇总RNA

采用Trizol法提取真姬菇总RNA。操作如下。

1、RNA提取前的准备

RNA提取前要对RNA提取所用的枪头、EP管、研钵、药匙和研棒进行处理。实验中用到的一切器具都用DEPC处理水(ddH₂O中含DEPC 0.1％～0.3％，v/v)处理。

用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理水处理RNA提取所用的枪头和EP管的方法：

1)用DEPC处理水在烧杯或广口瓶中浸泡枪头和EP管，DEPC易挥发且有毒，用一次性PE薄膜手套封口，用橡皮筋扎紧，置37℃温箱内12小时以上，倒去DEPC处理水(DEPC处理水回收后可重复使用)。

2)枪头和EP管仍留在烧杯或广口瓶中，一次性PE薄膜手套改换成洁净的牛皮纸，橡皮筋扎紧并进行高压蒸汽灭菌后，倒置烧杯或广口瓶于80℃烤箱中烤干。EP管及玻璃器皿可同样处理。

3)研钵、药匙和杵处理：250℃烘烤3h以上。

4)将DEPC处理水小心倒入废液瓶中，高压蒸汽灭菌。

材料预处理：将长满皿的菌丝，放入42℃恒温培养箱中，热激处理2h，刮取菌丝备用。

2.RNA提取

1)在液氮中将菌丝体研磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5mL EP管中。每100mg组织加入1.0mL的Trizol。用枪头反复抽吸混匀。注意：如果组织量很少，在样品中加入800μL的Trizol。

2)用1mL针筒，6#针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌的1.5mLEP管中。

3)加入200μL氯仿∶异戊醇(24∶1)或氯仿，剧烈振荡混匀30s。

4)12000rpm，4℃，离心5min。

5)将上清液转移到RNase-free 1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，室温下放置5min。(注意：不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染。)

6)12000rpm，4℃，离心5min。

7)小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。

8)用70％乙醇洗涤两次，每次700μL，12000rpm，4℃，离心2min。

9)尽可能彻底的吸走上清，防止RNA沉淀丢失。

10)真空离心干燥3～5min，或放在室温完全挥发。

11)沉淀用30～50μL DEPC处理水溶解。如发现沉淀难溶，68℃处理10min。

3.提取RNA的分析和定量

1)测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量。按1OD＝40μg RNA计算RNA的产率：OD_260/280在1.8～2.0视为抽提的RNA的纯度很高。

2)进行琼脂糖凝胶电泳，确定RNA的完整性和污染情况。在琼脂糖凝胶上可以清晰地看到28SrRNA和18S rRNA。如28S rRNA的量约为18S rRNA的两倍，说明RNA完整性较好。

步骤3反转录合成cDNA第一链

1)在两个一经DEPC处理水处理的0.2mL PCR薄壁管A、B中加入下列试剂：

A管：5’RACE-cDNA第一链反应管：①2μL总RNA，②1μL 5’-RACE CDS Primer，③1μL SMARTII A oligonucleotide。(②、③(为试剂盒SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit 634914中所带成分))

B管：3’RACE-cDNA第一链反应管：①2μL总RNA，②1μL 3’-RACE CDS Primer，②(为试剂盒SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit 634914中所带成分)

2)用无菌的RNase Free ddH₂O补至终体积为5μL。

3)混匀后，短暂离心。

4)在预热的PCR仪上，70℃温育2min。(使用有热盖的PCR仪，以避免由于蒸发作用而减少反应液的体积)。

5)迅速在冰上冷却2min。

6)短暂离心使成分聚集管底。

7)在0.5mL EP管中再加入下列试剂(试剂除①-④为试剂盒SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit 634914所带)：

①2μL 5X First-Strand Buffer

②1μL DTT(20mM)

③1μL dNTP Mix(10mM)

④1μL 反转录酶：PrimeScriptTM Reverse Transcriptase(总体积为10μL)

8)小心混合管内组分，稍加离心。

9)在预热的PCR仪上，42℃温育90min。

10)用90μL Tricine-EDTA缓冲液稀释。(Tricine-EDTA为试剂盒SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit 634914中所带)

11)在预热的PCR仪上，72℃加热7min，以灭活反转录酶。

12)得到A管的3′RACE cDNA与B管的5′RACE cDNA，于-20℃贮存。

步骤4RACE-PCR反应

为所有的PCR反应和1个额外的反应准备足够的主混合液Master Mix，每个50μL PCR反应用41.5μL，分别为如下成分，均为为Clontech公司的试剂盒Advantage^TM2PCR Kit中所带：

PCR-Grade Water                   34.5μL

10×Advantage 2PCR Buffer         2.5μL

dNTP Mixture(10mM)                1.0μL

50×Advantage 2 polymerase Mix    1.0μL

                                            

总体积                            41.5μL

I.3’RACE扩增基因的3’末端：

按下表进行PCR反应的准备，按顺序在0.2mL灭菌的PCR薄壁管中加入各种成分，轻柔混合。

表13’RACE-PCR反应成分

4)3’RACE PCR反应程序为：

94℃5min，94℃30S  68℃30S 72℃2min共5个循环；94℃30S  66℃30S 72℃2min共5个循环；94℃30S 64℃30S 72℃2min共27个循环；72℃10min；4℃保存

扩增结束后取2μL PCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，EB染色后凝胶成像系统拍照，观察结果，如图6A所示。

II、5’RACE扩增基因5’末端

5’RACE PCR反应体系如表3：

表15’RACE-PCR反应成分

5’RACE PCR反应程序为：

94℃5min，94℃30S  68℃30S 72℃2min共5个循环；94℃30S  66℃30S 72℃2min共5个循环；94℃30S 64℃30S 72℃2min共27个循环；72℃10min；4℃保存

扩增结束后取2μL PCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，EB染色后凝胶成像系统拍照，观察结果，如图6BB所示。

步骤5扩增产物的回收、克隆

对3’RACE的PCR产物和5’RACE的PCR产物进行回收纯化，将回收纯化的目的片段连入pMD18-T载体后，导入大肠杆菌DH_5α进行蓝白斑筛选，克隆测序步骤同实施例1的步骤5，测序结果3′末端，如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，5′末端，如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。

实施例3.真姬菇HmHSP70基因完整读码框的扩增

步骤1设计全长基因特异性引物扩增全长基因

利用DNAMAN软件对3’RACE和5’RACE产物测序结果进行分析，拼接成HSP70全序列，剔除RACE反应加入的接头序列，根据5’端和3’端的重叠序列，HSP70基因的全长拼接得到一条2308bp的序列，如SEQ ID NO4所示；应用NCBI的ORF finder软件对全长cDNA序列进行可读框架分析，结果发现其可读框架(ORF)位于34～2034位核苷酸之间，全长2001bp，如SEQ ID NO 7，编码667个氨基酸，如SEQIDNO6所示。

根据SEQ ID NO4，使用Primer Premier5.0结合DNAMAN6.0程序设计全长特异引物扩增基因完整的读码框。

引物设计序列为：

HSPORF1：5’-CCCAAGCTTTCATGTTCACCGCCGCTG-3’

HSPORF2：5’-CCGCTCGAGGATTTGTCATGCATGTGAG-3’

HSPORF1引物划线处为HindIII的酶切位点，HSPORF2引物划线处为XhoI的酶切位点，引物用无菌双蒸水稀释至20μM。

以实施例2步骤3得到的5’RACE-cDNA为模板，采用TOYOBO公司的KOD-Plus高保真酶进行PCR扩增，PCR体系如下：

ddH₂0                            33.5μL

10×PCR buffer                       5.0μL

dNTP(2mM)                            5.0μL

MgSO₄(25mM)                          2.0μL

HSPORF1                              1.0μL

HSPORF2                              1.0μL

5’RACE-cDNA                         1.5μL

KOD-Plus                             1.0μL

Total                                50.0μL

PCR程序如下：

94℃2min，94℃15S  58℃15S 68℃150s共30个循环；68℃7min；4℃保存

扩增结束后取2μL PCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，EB染色后凝胶成像系统拍照，观察结果，PCR扩增出一条2200bp左右的条带与预期结果相吻合，如图7所示。

将剩余48μL产物进行回收、纯化，操作同实施例1步骤3。

步骤2.构建表达载体

将上一步回收纯化的产物和质粒pET32a-c(+)分别用限制性内切酶HindIII和XhoI进行双酶切。37℃酶切2h。反应体系如下：

HindIII                1.0μL

XhoI                   1.0μL

DNA                    4.0μL

10×H Buffer           2.0μL

ddH₂O                  12.0μL

Total                  20.0μL

将PCR酶切产物和质粒酶切产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，切胶回收纯化。

将回收纯化的PCR酶切产物和质粒酶切产物用TaKaRa公司的T4DNA Ligase进行连接，构建重组表达载体pET-32a-c(+)/HmHSP70，体系步骤如下。

16℃连接过夜。反应体系如下：

10×T4DNA Ligase Buffer        2.5μL

DNA片段                        5.0μL

载体DNA                        3.0μL

T4DNALigase                    1.0μL

dH₂O                           13.5μL

Total                          25.0μL

将构建好的质粒，导入感受态的大肠杆菌DH_5α，克隆筛选阳性克隆，酶切鉴定如图8所示，测序步骤同实施例1步骤5，测序结果如SEQ ID NO5所示，该cDNA片段全长2145bp，含有完整开放性读码框长2001bp，与拼接结果吻合，编码的氨基酸序列全长667个氨基酸残基如SEQ ID NO6，分子量为72.2KD。

步骤3.生物信息学分析

通过Blastn对获得的基因序列进行比对，发现该序列与HSP70基因相似度最大，初步鉴定为此基因为真姬菇HmHSP70蛋白基因，

该基因序列编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO6与GeneBank中已登陆生物的HSP70的序列，采用Blast进行蛋白质同源性检索及DNAMAN亲缘关系分析，发现所得氨基酸序列与双色蜡蘑(XP 001880175)、新型隐球菌(XP 567978)、棒曲霉(XP 001275300)、裂殖酵母(XP 002172864)的氨基酸序列同源性分别达87％、71％、67％、67％。

Protparam分析结果显示，该蛋白分子量为72.214KDa，理论等电点为5.63，不稳定系数为36.67，为稳定蛋白质。二级结构预测显示它含有α-螺旋(Alpha helix)27.0％，自由卷曲(Random coil)49.9％，伸展片段(Extended strand)23.1％。疏水性性分析表明该蛋白多数氨基酸为水溶性氨基酸，推断该蛋白为可溶性蛋白质。Prosite功能位点分析表明，该蛋白含有HSP70蛋白的特征功能序列，为HSP70家族蛋白，由上述分析结果推断，我们所获得的真姬菇基因序列HmHSP70为HSP70家族一员。

实施例4真姬菇HmHSP70基因原核表达

材料与试剂

大肠杆菌(E.coli)菌株BL21(DE3)，可在生物公司购买到。

表达载体：pET32a-c(+)，可在生物公司购买到。全长5900bp，携带有卡那霉素抗性基因。SDS-PAGE电泳所用试剂：

1、30％丙烯酰胺单体贮存液(T＝30％)：丙烯酰胺(Acr)29.0g，亚甲基双丙烯酰胺(Bis)1.0g。先用80mL双蒸水搅拌溶解，直至溶液变成透明，再用双蒸水定容至100mL。0.45μm滤膜去杂质，于棕色瓶4℃保存。

2、1.5M Tris-HCl(pH8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存备用。

3、1.0M Tris-HCl(pH6.8)：Tris 12.11g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存备用。

4、10％过硫酸铵(AP)：1gAP加ddH₂O至10mL。

5、5×SDS-PAGE Loading Buffer：

1M Tris-HCl(pH6.8)        1.25mL

SDS                       0.5g

BPB                       25mg

甘油                      2.5mL

加去离子水溶解后定容至5mL，小份分装后(500μL)于室温保存。使用前将25μL的2-ME(β-巯基乙醇)加到每小份中。加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右。

6、10×Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)

Tris                      30g

甘氨酸                    94g

SDS                       10g

加ddH₂O，1mol·L^-1盐酸调节pH值至8.3，定容至1000mL。

7、考马斯亮兰染色液：

考马斯亮兰R250            1g

异丙醇                    250mL

冰醋酸                    100mL

ddH₂O                     650mL

滤纸滤去颗粒后，室温保存。

8、考马斯亮兰脱色液

冰醋酸                100mL

乙醇                  50mL

ddH₂O                 850mL

9、5％浓缩胶和12％分离胶配方

表45％浓缩胶和12％分离胶配方

步骤1.CaCl₂法制作大肠杆菌BL21感受态，操作同实施例1

步骤2.对实施例3步骤2中鉴定为含有重组质粒的大肠杆菌DH5α，提取质粒，操作同实施例1。

步骤3.

将提取出来的pET-32a-c(+)/HmHsp70重组表达载体转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，转化步骤同实施例1步骤5中的转化。

步骤4.挑取生长良好的阳性单菌落接种到5mL含有Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取1mL活化后的培养液加到100mL含有Amp的LB液体培养基中。37℃剧烈振荡培养2.5～3h，待OD600达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度1mM，37℃进行诱导。同时将空载体pET-32a-c(+)转化BL21(DE3)作为对照。

步骤4提取原核表达蛋白质进行SDS-PAGE电泳

4.1.蛋白质样品制备

将1mL步骤4获得的菌液于4℃8000rpm离心5min，收集菌体沉淀。在菌体沉淀中加入100μL的1×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热3min，4℃8000rpm离心1min，收集上清液，冰上放置。

4.2、SDS-PAGE凝胶电泳

参数为：表4所列15ml 12％分离胶，3mL 5％浓缩胶；浓缩胶电压80V，分离胶电压100V电泳。电泳结果如图9所示，于90KD处出现一条特异性条带，与预期大小相符，而对照组相应位置无此条带。

步骤6真姬菇HmHSP70蛋白耐热功能的研究

将步骤4中经IPTG诱导后的细菌分成六份进行50℃高温处理，分别处理0、30、60、90、120、180分钟，分别取50μL涂布到固体LB培养基上，通过菌落计数测定大肠杆菌的存活能力。提取每个处理的表达蛋白质进行SDS-PAGE分析。

分析结果显示：处理60min后，转基因大肠杆菌有21.7％的存活率，而对照大肠杆菌存活率仅为11％，180min后，对照全部死亡，而转基因大肠杆菌仍然有1％的存活率，如图10所示，说明HmHSP70基因可以提高大肠杆菌忍受高温的能力。

含有重组质粒的大肠杆菌细胞中有过量表达的特异蛋白质带，随高温(50℃)处理时间的延长，大肠杆菌内蛋白质分解，含重组子的大肠杆菌的目的蛋白降解较少，如图11所示，而对照降解较快较多，如图12所示，表明HmHSP70蛋白对细胞有保护作用。

上述实验结果进一步证明本发明获得的完整基因开发读码框为真姬菇HmHSP70基因的开放读码框，其在大肠杆菌中表达的蛋白能使大肠杆菌获得耐热性。

附录：序列表

<110>青岛农业大学

<120>真姬菇热激蛋白HmHSP70的氨基酸序列、基因序列及其表达载体

<130>P09241/QDN

<160>13

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>691

<212>DNA

<213>HmHSP70基因中间序列

<400>1

1    GCTGTAGTCA CCGTCCCAGC TTACTTCAAT GACGCACAAC GACAGGCTAC

51   TAAGGATGCT GGCCAGATTG CTGGCCTCGA CGTCCTTCGA GTAATCAACG

101  AGCCCACGGC GGCCGCCCTT GCTTATGGCC TTGATCGTGC GGACTCGTCC

151  GTCATTGCCG TTTACGATCT TGGAGGAGGC ACATTCGATA TATCCATTCT

201  TGAGATGCAG AAGGGTGTGT TTGAGGTCAA GTCAACGAAT GGTGACACCC

251  ATCTTGGTGG CGAGGATTTC GATGTCGTCC TGGTCGAGTT TATCTTGGCC

301  GAGTTCAAGA AGGAGAGCGG TGTCGACCTC AAAGGTGACC GAATGGCCAT

351  CCAGCGAGTC CGCGAGGCTG CTGAGAAGGC CAAGATCGAA TTGTCTTCGA

401  CTACTCAAAC GGAAGTTAAC TTGCCCTTCA TAACTGCCGA CGCTTCCGGA

451  CCCAAGCACA TCAACATCAA GCTCATGCGG TCACAATTCG AAGGACTTGT

501  TGGTCCCCTT ATTCAACGCA CCATTGAACC TTGCAAGAAG GCTCTCAGTG

551  ATGCTGGTGT TAAAGCCAGT GAGATTGATG AGGTCATCCT TGTTGGCGGT

601  ATGACTCGTG TGCCCCGTGT TGTGGAGACG GTGAAGACCA TCTTCGGCCG

651  TGAACCCAGC AAAGGTATTA ATCCTGAGGA AGCTGTGGCT

<210>2

<211>1716

<212>DNA

<213>HmHSP70基因3′端序列

<400>2

1    CGACAGGCTA CTAAGGATGC TGGCCAGATT GCTGGCCTCG ACGTCCTTCG

51   AGTAATCAAC GAGCCCACGG CGGCCGCCCT TGCTTATGGT CTTGATCGTG

101  CGGACTCGTC CGTCATTGCC GTTTACGATC TTGGAGGAGG CACATTCGAT

151  ATATCCATTC TTGAGATGCA GAAGGGTGTG TTTGAGGTCA AGTCAACGAA

201  TGGTGACACC CATCTTGGTG GCGAGGATTT CGATGTCGTC CTGGTCGAGT

251  TTATCTTGGC CGAGTTCAAG AAGGAGAGCG GTGTCGACCT CAAAGGTGAC

301  CGAATGGCCA TCCAGCGAGT CCGCGAGGCT GCTGAGAAGG CCAAGATCGA

351  ATTGTCTTCG ACTACTCAAA CGGAAGTTAA CTTGCCCTTC ATAACTGCCG

401  ACGCTTCCGG ACCCAAGCAC ATCAACATCA AGCTCATGCG GTCACAATTC

451  GAAGGACTTG TTGGTCCCCT TATTCAACGC ACCATTGAAC CTTGCAAGAA

501  GGCTCTCAGT GATGCTGGTG TTAAAGCCAG TGAGATTGAT GAGGTCATCC

551  TTGTTGGCGG TATGACTCGT GTGCCCCGTG TTGTGGAGAC GGTGAAGACC

601  ATCTTCGGCC GTGAACCCAG CAAAGGTGTC AACCCTGATG AGGCTGTCGC

651  CATTGGTGCG TCCATTCAAG GTGGTGTTTT GGCTGGCAAT GTTACGGACA

701  TCCTACTCCT CGATGTTACT CCCCTATCCC TCGGTATCGA GACACTCGGT

751  GGTATCATGA CCAAACTCAT CAGCCGCAAC ACCACTATCC CTACGAAGAA

801  GTCTCAGACT TTCTCAACTG CTGCTGACGG CCAGACCGCG ATTGAAGTCA

851  AGATATACCA GGGAGAGCGT GAGCTCGTTC GTGACAACAA ACTTCTCGGC

901  AACTTCAACC TTGTTGGCAT TCCTCCCGCA CCCAAAGGTG TTCCGCAGAT

951  CGAAATCACC TTTGACATCG ATGCTGACGG TATTGTCAAT GTCTCGGCTA

1001 AGGACAAGGC TACCGGCAAG GACCAATCCA TGACCATTGC TTCTTCATCT

1051 GGGCTCAGTG ACAAGGACAT CGAGAAGATG GTTTCGGACG CCGAGGCATA

1101 TGCTGAGGAT GATAAGGCTC GCAGGAATCT CATCGAAGAG GCTAACAAGG

1151 CCGACTCTGT CTGCGCTGAT ACCGAGAAGG CTATGGCTGA ATTCAAGGAC

1201 CAACTCGACG CCACTGAGAA GGACAAGGTC GCCAAGCTCG TCACAGAACT

1251 CCGGGAACTC GCTGTTAAGG GCCAGGCTTC AGAGACGACC ATTACCGCCG

1301 AGGATATTCG GGAAAAGATC AACGAGACAC AGCAGGCATC ATTGGGACTT

1351 TTCCAAAAGG TTTATGAGAA GCGCAGCCAA GAGAACCAGA CTCAAGAGCA

1401 GCCCTCCGAG TCTGAGGAGA AGAAGGAGGA GAAGAAGGAC TAAAGCCTTA

1451 ATTGACTTTC CCTTCGTTCC TTGCTTATCT CCTGCCGTCG CCCTCCCACC

1501 AATGTACCTC GCTTTTCGCC TCGTGCATAT TCTGCCACGA TACCATATCC

1551 TGGTCGGCCC ACCACGCTCA CATGCATGAC AAATCCCTTT CAAAAGTAGA

1601 GCCTGCCACG TCACGATTTA CTTACATCTT ACCTTAGCAT ATTTGTTAGT

1651 CGCAACGCCC CCCCCCTCAA TCATTATCGA CGTGTAACAA AAAAAAAAAA

1701 AAAAAAAAAA AAAAAA

<210>3

<211>1174

<212>DNA

<213>HmHSP70基因5′端序列

<400>3

1    ACGCGGGGAC CTTTCTCTCT ATTCCCTACC ATCATGTTCA CCGCCGCTGG

51   TTCTCTACGG AAGTCCGTTG TACGGTTCCC CAAGGGCCTT CCGCGCTCAC

101  TCATTGCGCG GAATATGAAC TCAAAAGTTA ACGGCCCAGT CATTGGTATT

151  GACTTGGGTA CGACGAACTC ATGCGTGTCC GTCATGGAGG GCAAGACATC

201  TCGGGTCATC GAGAACGCTG AGGGTGCACG GACAACACCC TCCGTCGTCG

251  CTTTCACAAA GCATGGTGAA CGTCTTGTCG GACTTCCTGC CAAACGGCAA

301  GCGGTCGTGA ACTCGGCCAA TACCGTGTTT GCATTCAAGC GGTTAATTGG

351  TCGGAAGTTC ACGGATAAGG AGGTAAAGGA AGACATGAAA CACTGGCCGT

401  TCACCGTCGT TGCCAAGCCC GATGGGAGAC CAGCCGTGGA GGTCGACAAC

451  GGTGGAAAGC GTCAACAATT TTCGGCGGAG GAACTATCTT CTATGGTTCT

501  GGCAAAAATG CGTGAGACGG CAGAGCAATA CCTGAACAAG AAAGTCAACC

551  ACGCTGTCAT CACCGTTCCT GCATACTTCA ATGACGCACA ACGACAGGCT

601  ACTAAGGATG CTGGCCAGAT TGCTGGCCTC GACGTCCTTC GAGTAATCAA

651  CGAGCCCACG GCGGCCGCCC TTGCTTATGG TCTTGATCGT GCGGACTCGT

701  CCGTCATTGC CGTTTACGAT CTTGGAGGAG GCACATTCGA TATATCCATT

751  CTTGAGATGC AGAAGGGTGT GTTTGAGGTC AAGTCAACGA ATGGTGACAC

801  CCATCGTGGT GGCGAGGATT TCGATGTCGT CCTGGTCGAG TTTATCTTGG

851  CCCGAGTTCA AGAAGGAGAG CGGTGTCGAC CTCAAAGGTG ACCGAATGGG

901  CCATCCAGCG AGTCCGCGAG GCTGCTGAGA AGGCCAAGAT CGAATTGTCT

951  TCGACTACTC AAACGGAAGT TAACTTGCCC TTCATAACTG CCGACGCTTC

1001 CGGACYCAAG CACATCAACA TCAAGCTCAT GCGGTCACAA TTCGAAGGAC

1051 TTGTTGGTCC CCTTATTCAA CGCACCATTG AACCTTGCAA GAAGGCTCTC

1101 AGTGATGCTG GTGTTAAAGC CAGTGAGATT GATGAGGTCA TCCTTGTTGG

1151 CGGTATGACT CGTGTGCCCC GTGT

<210>4

<211>2308

<212>DNA

<213>拼接序列

<400>4

1    ACGCGGGGAC CTTTCTCTCT ATTCCCTACC ATCATGTTCA CCGCCGCTGG

51   TTCTCTACGG AAGTCCGTTG TACGGTTCCC CAAGGGCCTT CCGCGCTCAC

101  TCATTGCGCG GAATATGAAC TCAAAAGTTA ACGGCCCAGT CATTGGTATT

151  GACTTGGGTA CGACGAACTC ATGCGTGTCC GTCATGGAGG GCAAGACATC

201  TCGGGTCATC GAGAACGCTG AGGGTGCACG GACAACACCC TCCGTCGTCG

251  CTTTCACAAA GCATGGTGAA CGTCTTGTCG GACTTCCTGC CAAACGGCAA

301  GCGGTCGTGA ACTCGGCCAA TACCGTGTTT GCATTCAAGC GGTTAATTGG

351  TCGGAAGTTC ACGGATAAGG AGGTAAAAGGA AGACATGAAA CACTGGCCGT

401  TCACCGTCGT TGCCAAGCCC GATGGGAGAC CAGCCGTGGA GGTCGACAAC

451  GGTGGAAAGC GTCAACAATT TTCGGCGGAG GAACTATCTT CTATGGTTCT

501  GGCAAAAATG CGTGAGACGG CAGAGCAATA CCTGAACAAG AAAGTCAACC

551  ACGCTGTCAT CACCGTTCCT GCATACTTCA ATGACGCACA ACGACAGGCT

601  ACTAAGGATG CTGGCCAGAT TGCTGGCCTC GACGTCCTTC GAGTAATCAA

651  CGAGCCCACG GCGGCCGCCC TTGCTTATGG TCTTGATCGT GCGGACTCGT

701  CCGTCATTGC CGTTTACGAT CTTGGAGGAG GCACATTCGA TATATCCATT

751  CTTGAGATGC AGAAGGGTGT GTTTGAGGTC AAGTCAACGA ATGGTGACAC

801  CCATCGTGGT GGCGAGGATT TCGATGTCGT CCTGGTCGAG TTTATCTTGG

851  CCGAGTTCAA GAAGGAGAGC GGTGTCGACC TCAAAGGTGA CCGAATGGCC

901  ATCCAGCGAG TCCGCGAGGC TGCTGAGAAG GCCAAGATCG AATTGTCTTC

951  GACTACTCAA ACGGAAGTTA ACTTGCCCTT CATAACTGCC GACGCTTCCG

1001 GACCCAAGCA CATCAACATC AAGCTCATGC GGTCACAATT CGAAGGACTT

1051 GTTGGTCCCC TTATTCAACG CACCATTGAA CCTTGCAAGA AGGCTCTCAG

1101 TGATGCTGGT GTTAAAGCCA GTGAGATTGA TGAGGTCATC CTTGTTGGCG

1151 GTATGACTCG TGTGCCCCGT GTTGTGGAGA CGGTGAAGAC CATCTTCGGC

1201 CGTGAACCCA GCAAAGGTGT CAACCCTGAT GAGGCTGTCG CCATTGGTGC

1251 GTCCATTCAA GGTGGTGTTT TGGCTGGCAA TGTTACGGAC ATCCTACTCC

1301 TCGATGTTAC TCCCCTATCC CTCGGTATCG AGACACTCGG TGGTATCATG

1351 ACCAAACTCA TCAGCCGCAA CACCACTATC CCTACGAAGA AGTCTCAGAC

1401 TTTCTCAACT GCTGCTGACG GCCAGACCGC GATTGAAGTC AAGATATACC

1451 AGGGAGAGCG TGAGCTCGTT CGTGACAACA AACTTCTCGG CAACTTCAAC

1501 CTTGTTGGCA TTCCTCCCGC ACCCAAAGGT GTTCCGCAGA TCGAAATCAC

1551 CTTTGACATC GATGCTGACG GTATTGTCAA TGTCTCGGCT AAGGACAAGG

1601 CTACCGGCAA GGACCAATCC ATGACCATTG CTTCTTCATC TGGGCTCAGT

1651 GACAAGGACA TCGAGAAGAT GGTTTCGGAC GCCGAGGCAT ATGCTGAGGA

1701 TGATAAGGCT CGCAGGAATC TCATCGAAGA GGCTAACAAG GCCGACTCTG

1751 TCTGCGCTGA TACCGAGAAG GCTATGGCTG AATTCAAGGA CCAACTCGAC

1801 GCCACTGAGA AGGACAAGGT CGCCAAGCTC GTCACAGAAC TCCGGGAACT

1851 CGCTGTTAAG GGCCAGGCTT CAGAGACGAC CATTACCGCC GAGGATATTC

1901 GGGAAAAGAT CAACGAGACA CAGCAGGCAT CATTGGGACT TTTCCAAAAG

1951 GTTTATGAGA AGCGCAGCCA AGAGAACCAG ACTCAAGAGC AGCCCTCCGA

2001 GTCTGAGGAG AAGAAGGAGG AGAAGAAGGA CTAAAGCCTT AATTGACTTT

2051 CCCTTCGTTC CTTGCTTATC TCCTGCCGTC GCCCTCCCAC CAATGTACCT

2101 CGCTTTTCGC CTCGTGCATA TTCTGCCACG ATACCATATC CTGGTCGGCC

2151 CACCACGCTC ACATGCATGA CAAATCCCTT TCAAAAGTAG AGCCTGCCAC

2201 GTCACGATTT ACTTACATCT TACCTTAGCA TATTTGTTAG TCGCAACGCC

2251 CCCCCCCTCA ATCATTATCG ACGTGTAACA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

2301 AAAAAAAA

<210>5

<211>2145

<212>DNA

<213>HmHSP70基因全长序列

<400>5

1    TCATGTTCAC CGCCGCTGGT TCTCTACGGA AGTCCGTTGT ACGGTTCCCC

51   AAGGGCCTTC CGCGCTCACT CATTGCGCGG AATATGAACT CAAAAGTTAA

101  CGGCCCAGTC ATTGGTATTG ACTTGGGTAC GACGAACTCA TGCGTGTCCG

151  TCATGGAGGG CAAGACATCT CGGGTCATCG AGAACGCTGA GGGTGCACGG

201  ACAACACCCT CCGTCGTCGC TTTCACAAAG CATGGTGAAC GTCTTGTCGG

251  ACTTCCTGCC AAACGGCAAG CGGTCGTGAA CTCGGCCAAT ACCGTGTTTG

301  CATTCAAGCG GTTAATTGGT CGGAAGTTCA CGGATAAGGA GGTAAAGGAA

351  GACATGAAAC ACTGGCCGTT CACCGTCGTT GCCAAGCCCG ATGGGAGACC

401  AGCCGTGGAG GTCGACAACG GTGGAAAGCG TCAACAATTT TCGGCGGAGG

451  AACTATCTTC TATGGTTCTG GCAAAAATGC GTGAGACGGC AGAGCAATAC

501  CTGAACAAGA AAGTCAACCA CGCTGTCATC ACCGTTCCTG CATACTTCAA

551  TGACGCACAA CGACAGGCTA CTAAGGATGC TGGCCAGATT GCTGGCCTCG

601  ACGTCCTTCG AGTAATCAAC GAGCCCACGG CGGCCGCCCT TGCTTATGGT

651  CTTGATCGTG CGGACTCGTC CGTCATTGCC GTTTACGATC TTGGAGGAGG

701  CACATTCGAT ATATCCATTC TTGAGATGCA GAAGGGTGTG TTTGAGGTCA

751  AGTCAACGAA TGGTGACACC CATCTTGGTG GCGAGGATTT CGATGTCGTC

801  CTGGTCGAGT TTATCTTGGC CGAGTTCAAG AAGGAGAGCG GTGTCGACCT

851  CAAAGGTGAC CGAATGGCCA TCCAGCGAGT CCGCGAGGCT GCTGAGAAGG

901  CCAAGATCGA ATTGTCTTCG ACTACTCAAA CGGAAGTTAA CTTGCCCTTC

951  ATAACTGCCG ACGCTTCCGG ACCCAAGCAC ATCAACATCA AGCTCATGCG

1001 GTCACAATTC GAAGGACTTG TTGGTCCCCT TATTCAACGC ACCATTGAAC

1051 CTTGCAAGAA GGCTCTCAGT GATGCTGGTG TTAAAGCCAG TGAGATTGAT

1101G AGGTCATCC TTGTTGGCGG TATGACTCGT GTGCCCCGTG TTGTGGAGAC

1151 GGTGAAGACC ATCTTCGGCC GTGAACCCAG CAAAGGTGTC AACCCTGATG

1201 AGGCTGTCGC CATTGGTGCG TCCATTCAAG GTGGTGTTTT GGCTGGCAAT

1251 GTTACGGACA TCCTACTCCT CGATGTTACT CCCCTATCCC TCGGTATCGA

1301 GACACTCGGT GGTATCATGA CCAAACTCAT CAGCCGCAAC ACCACTATCC

1351 CTACGAAGAA GTCTCAGACT TTCTCAACTG CTGCTGACGG CCAGACCGCG

1401 ATTGAAGTCA AGATATACCA GGGAGAGCGT GAGCTCGTTC GTGACAACAA

1451 ACTTCTCGGC AACTTCAACC TTGTTGGCAT TCCTCCCGCA CCCAAAGGTG

1501 TTCCGCAGAT CGAAATCACC TTTGACATCG ATGCTGACGG TATTGTCAAT

1551 GTCTCGGCTA AGGACAAGGC TACCGGCAAG GACCAATCCA TGACCATTGC

1601 TTCTTCATCT GGGCTCAGTG ACAAGGACAT CGAGAAGATG GTTTCGGACG

1651 CCGAGGCATA TGCTGAGGAT GATAAGGCTC GCAGGAATCT CATCGAAGAG

1701 GCTAACAAGG CCGACTCTGT CTGCGCTGAT ACCGAGAAGG CTATGGCTGA

1751 ATTCAAGGAC CAACTCGACG CCACTGAGAA GGACAAGGTC GCCAAGCTCG

1801 TCACAGAACT CCGGGAACTC GCTGTTAAGG GCCAGGCTTC AGAGACGACC

1851 ATTACCGCCG AGGATATTCG GGAAAAGATC AACGAGACAC AGCAGGCATC

1901 ATTGGGACTT TTCCAAAAGG TCTATGAGAA GCGCAGCCAA GAGAACCAGA

1951 CTCAAGAGCA GCCCTCCGAG TCTGAGGAGA AGAAGGAGGA GAAGAAGGAC

2001 TAAAGCCTTA ATTGACTTTC CCTTCGTTCC TTGCTTATCT CCTGCCGTCG

2051 CCCTCCCACC AATGTACCTC GCTTTTCGCC TCGTGCATAT TCTGCCACGA

2101 TACCATATCC TGGTCGGCCC ACCACGCTCA CATGCATGAC AAATC

<210>6

<211>667

<212>protein

<213>热激蛋白HmHSP70的氨基酸序列

<400>6

1   MFTAAGSLRK SVVRFPKGLP RSLIARNMNS KVNGPVIGID LGTTNSCVSV

51  MEGKTSRVIE NAEGARTTPS VVAFTKHGER LVGLPAKRQA VVNSANTVFA

101 FKRLIGRKFT DKEVKEDMKH WPFTVVAKPD GRPAVEVDNG GKRQQFSAEE

151 LSSMVLAKMR ETAEQYLNKK VNHAVITVPA YFNDAQRQAT KDAGQIAGLD

201 VLRVINEPTA AALAYGLDRA DSSVIAVYDL GGGTFDISIL EMQKGVFEVK

251 STNGDTHRGG EDFDVVLVEF ILAEFKKESG VDLKGDRMAI QRVREAAEKA

301 KIELSSTTQT EVNLPFITAD ASGPKHINIK LMRSQFEGLV GPLIQRTIEP

351 CKKALSDAGV KASEIDEVIL VGGMTRVPRV VETVKTIFGR EPSKGVNPDE

401 AVAIGASIQG GVLAGNVTDI LLLDVTPLSL GIETLGGIMT KLISRNTTIP

451 TKKSQTFSTA ADGQTAIEVK IYQGERELVR DNKLLGNFNL VGIPPAPKGV

501 PQIEITFDID ADGIVNVSAK DKATGKDQSM TIASSSGLSD KDIEKMVSDA

551 EAYAEDDKAR RNLIEEANKA DSVCADTEKA MAEFKDQLDA TEKDKVAKLV

601 TELRELAVKG QASETTITAE DIREKINETQ QASLGLFQKV YEKRSQENQT

651 QEQPSESEEK KEEKKD*

<210>7

<211>2001

<212>DNA

<213>HmHSP70基因完整读码框

<400>7

1   ATGTTCACCG CCGCTGGTTC TCTACGGAAG TCCGTTGTAC GGTTCCCCAA

51  GGGCCTTCCG CGCTCACTCA TTGCGCGGAA TATGAACTCA AAAGTTAACG

101 GCCCAGTCAT TGGTATTGAC TTGGGTACGA CGAACTCATG CGTGTCCGTC

151 ATGGAGGGCA AGACATCTCG GGTCATCGAG AACGCTGAGG GTGCACGGAC

201 AACACCCTCC GTCGTCGCTT TCACAAAGCA TGGTGAACGT CTTGTCGGAC

251 TTCCTGCCAA ACGGCAAGCG GTCGTGAACT CGGCCAATAC CGTGTTTGCA

301 TTCAAGCGGT TAATTGGTCG GAAGTTCACG GATAAGGAGG TAAAGGAAGA

351 CATGAAACAC TGGCCGTTCA CCGTCGTTGC CAAGCCCGAT GGGAGACCAG

401 CCGTGGAGGT CGACAACGGT GGAAAGCGTC AACAATTTTC GGCGGAGGAA

451 CTATCTTCTA TGGTTCTGGC AAAAATGCGT GAGACGGCAG AGCAATACCT

501 GAACAAGAAA GTCAACCACG CTGTCATCAC CGTTCCTGCA TACTTCAATG

551 ACGCACAACG ACAGGCTACT AAGGATGCTG GCCAGATTGC TGGCCTCGAC

601 GTCCTTCGAG TAATCAACGA GCCCACGGCG GCCGCCCTTG CTTATGGTCT

651 TGATCGTGCG GACTCGTCCG TCATTGCCGT TTACGATCTT GGAGGAGGCA

701 CATTCGATAT ATCCATTCTT GAGATGCAGA AGGGTGTGTT TGAGGTCAAG

751 TCAACGAATG GTGACACCCA TCGTGGTGGC GAGGATTTCG ATGTCGTCCT

801  GGTCGAGTTT ATCTTGGCCG AGTTCAAGAA GGAGAGCGGT GTCGACCTCA

851  AAGGTGACCG AATGGCCATC CAGCGAGTCC GCGAGGCTGC TGAGAAGGCC

901  AAGATCGAAT TGTCTTCGAC TACTCAAACG GAAGTTAACT TGCCCTTCAT

951  AACTGCCGAC GCTTCCGGAC CCAAGCACAT CAACATCAAG CTCATGCGGT

1001 CACAATTCGA AGGACTTGTT GGTCCCCTTA TTCAACGCAC CATTGAACCT

1051 TGCAAGAAGG CTCTCAGTGA TGCTGGTGTT AAAGCCAGTG AGATTGATGA

1101 GGTCATCCTT GTTGGCGGTA TGACTCGTGT GCCCCGTGTT GTGGAGACGG

1151 TGAAGACCAT CTTCGGCCGT GAACCCAGCA AAGGTGTCAA CCCTGATGAG

1201 GCTGTCGCCA TTGGTGCGTC CATTCAAGGT GGTGTTTTGG CTGGCAATGT

1251 TACGGACATC CTACTCCTCG ATGTTACTCC CCTATCCCTC GGTATCGAGA

1301 CACTCGGTGG TATCATGACC AAACTCATCA GCCGCAACAC CACTATCCCT

1351 ACGAAGAAGT CTCAGACTTT CTCAACTGCT GCTGACGGCC AGACCGCGAT

1401 TGAAGTCAAG ATATACCAGG GAGAGCGTGA GCTCGTTCGT GACAACAAAC

1451 TTCTCGGCAA CTTCAACCTT GTTGGCATTC CTCCCGCACC CAAAGGTGTT

1501 CCGCAGATCG AAATCACCTT TGACATCGAT GCTGACGGTA TTGTCAATGT

1551 CTCGGCTAAG GACAAGGCTA CCGGCAAGGA CCAATCCATG ACCATTGCTT

1601 CTTCATCTGG GCTCAGTGAC AAGGACATCG AGAAGATGGT TTCGGACGCC

1651 GAGGCATATG CTGAGGATGA TAAGGCTCGC AGGAATCTCA TCGAAGAGGC

1701 TAACAAGGCC GACTCTGTCT GCGCTGATAC CGAGAAGGCT ATGGCTGAAT

1751 TCAAGGACCA ACTCGACGCC ACTGAGAAGG ACAAGGTCGC CAAGCTCGTC

1801 ACAGAACTCC GGGAACTCGC TGTTAAGGGC CAGGCTTCAG AGACGACCAT

1851 TACCGCCGAG GATATTCGGG AAAAGATCAA CGAGACACAG CAGGCATCAT

1901 TGGGACTTTT CCAAAAGGTT TATGAGAAGC GCAGCCAAGA GAACCAGACT

1951 CAAGAGCAGC CCTCCGAGTC TGAGGAGAAG AAGGAGGAGA AGAAGGACTA

2001 A

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>HmHSP70基因兼并上游引物

<400>8

1    GCTGTHRTYA CHGTYCCAGC TTAYTTC’

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>HmHSP70基因兼并下游引物

<400>9

RGCDACRGCY TCRTCNGGRT TRAT

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>HmHSP70基因3’RACE特异引物

<400>10

1    CAACGACAGG CTACTAAGGA TGCTGG

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>HmHSP70基因5’RACE特异引物

<400>11

1    ACACGGGGCA CACGAGTCAT ACC

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>全长HmHSP70基因上游引物

<400>12

1    CCCAAGCTTT CATGTTCACC GCCGCTG

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>全长HmHSP70基因下游引物

<400>13

1    CCGCTCGAGG ATTTGTCATG CATGTGAG