颗粒体蛋白－上皮素前体(GEP)抗体用于检测和抑制肝细胞癌(HCC)的用途

摘要

本发明提供检测血清GEP水平的方法。本发明进一步提供通过检测血清GEP水平确定患者是否患有肝细胞癌(HCC)的方法。在另一个实施方案中，本发明提供用抗－GEP单克隆抗体A23治疗患者从而在体外和体内均抑制HCC生长和发展的方法。

说明书

相关申请的交叉参考

本申请为2004年4月29日提交的美国专利申请序号10/836,390的部分继续申请。本申请还要求2006年11月28日提交的美国临时专利申请号60/861,318的优先权。前述每个申请的全部内容均通过引用加入到本申请中。

发明领域

本发明涉及颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)及影响GEP在肝细胞癌(HCC)中的表达、翻译和生物活性的方法。本发明的另一方面涉及GEP的检测方法，其是诊断和治疗HCC的可能方法。

本文以括注阿拉伯数字提到了若干出版物。这些参考文献的完整引用可见于权利要求书之前的说明书结尾处。这些出版物的全部内容通过引用加入到本申请中。

发明背景

肝癌是全世界第五大常见癌症并且是第三大癌症杀手，每年大约有50万新病例和几乎同样多的死亡人数(1，2)。肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌的主要组织学类型。在亚洲发生HCC的主要风险因素是乙型肝炎病毒(HBV)感染，而在西方国家和日本丙型肝炎病毒(HCV)感染是主要的风险因素。患有肝细胞癌的HCC患者的预后一般较差，中位存活时间不足1年，因为多数肝细胞癌是不可切除的，不适于新的治疗形式，化疗有效率低。手术切除(如部分肝切除术或肝移植)对于肝细胞癌是有疗效的治疗(3-5)。然而，仅20％的患者适合手术，因为大部分患者在肝内和/或肝外转移的晚期才被诊断出来。在治疗性手术之后常见复发，第一年的复发率为约50％(6)。因此，HCC的早期检测是改善存活所必需的。开发可在无症状患者中检测出早期癌症的血清学诊断检验应是一个重要努力方向。

目前，血清甲胎蛋白(AFP)已广泛用于HCC诊断(7)。然而，用于共存肝病患者检测HCC的血清AFP截取值还没有达成一致，所述值的范围为10-500ng/ml(8-10)。血清AFP检验在以常规的500ng/ml较高截取点使用时，在共存肝病患者中检测HCC的存在情况方面显示出约50％的灵敏度和90％以上的特异性(9)。在以10-19ng/ml之间的较低截取值使用时，血清AFP检验的灵敏度为45％-100％，特异性为70％-95％(10)。因此，为了更好地诊断HCC，迫切需要鉴定具有更好的灵敏度和特异性的新生物标记。

颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)(核苷酸序列SEQ ID No.1和氨基酸序列SEQ ID No.2)是自分泌生长因子，属于非典型性生长因子家族。在我们较早前的cDNA微阵列研究中报道了HCC组织中的GEPmRNA水平明显升高(11)。本发明人已在不同患者中进一步证实了该观察结果，并证实GEP蛋白在HCC组织中被上调，但在它们的邻接非肿瘤肝组织(肝炎和硬化肝)和正常肝中没有被上调(12)。在我们的较早前的研究中，功能性研究表明，GEP控制HCC细胞增殖速率、侵袭和转移(12)。由于GEP在HCC中特有地过表达且是重要的生长因子，所以本发明人推测，GEP在HCC肿瘤组织中的上调应当还导致HCC患者的血清GEP蛋白水平升高。就本发明人了解，不存在检测血清GEP的测定试剂盒，因此，迄今尚未研究血清GEP水平是否具有诊断意义。

GEP在HCC中的显著升高及其增强癌细胞增殖的功能使GEP成为引人注目的抗体治疗标靶。实际上，靶向癌症治疗相比于化疗药物的优势在于限制了非特异性毒性并且提高了疗效，化疗药物的主要缺点是缺乏选择性、具有严重的副作用、疗效有限和出现/选择产生耐药性(13)。随着杂交瘤技术在人源化和鼠-人嵌合单克隆抗体生产方面的进步，可使用单克隆抗体实现靶向癌症治疗(14)。单克隆抗体(mAb)治疗已在临床癌症治疗中被证实是有效的，例如用于B细胞淋巴瘤的抗-CD20mAB(利妥昔单抗(Rituximab))(15)、用于转移性乳腺癌的抗-Her2neu mAB(赫赛汀(Herceptin))(16-17)以及用于转移性结肠直肠癌的抗-EGFR和VEGF(18，19)。然而，开发包括抗体疗法在内的用于HCC的靶向治疗法是有限的，因此，迫切需要新的治疗标靶。

迄今为止还没有报道血清GEP在任何人类癌症中的诊断意义。在本研究中，本发明人已测定了HCC患者、HBV慢性携带者和健康个体中的血清GEP水平，以利用GEP作为HCC的新诊断标记。而且，本发明人还研究了新近分离的抗-GEP mAb对小鼠异种移植模型的人HCC的抗肿瘤效力。已证实抗-GEP mAb在体外和体内均能够延迟所建立的肿瘤的生长。这些结果表明了抗-GEP mAb在HCC治疗中的潜在适用性。

发明概述

本发明人已发现，相比于肝细胞癌(HCC)患者的周围正常肝组织和健康个体的正常肝组织，一种蛋白质：即颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)在HCC中丰富而且独特地表达。

本发明的一个目标是提供检测血清中的GEP基因产物的药剂和方法。本发明的又一个目标是提供用于诊断目的的灵敏检测HCC患者血清中的GEP基因产物的药剂和方法。本发明的又一个目标是提供用特异性GEP肽生产GEP单克隆和多克隆抗体的方法。本发明的又一个目标是提供生产抗-GEP单克隆抗体(例如A23)的方法。本发明的再一个目标是利用抗-GEP单克隆抗体(例如A23)抑制HCC发展。

本发明进一步提供测定HCC患者、乙型肝炎携带者和健康个体的GEP水平的方法和策略。

为实现上述目标并且按照本发明的目的，正如本文具体表达并适当描述的一样，本发明提供针对其中表现出GEP表达改变或GEP生物活性改变的HCC的药剂、组合物和治疗。

本文使用的术语“改变的表达或者表达改变”是指相比于相应的正常细胞或周围的正常外周细胞，GEP的表达增加或过表达或GEP蛋白上调。术语“表达改变”还指表达不受调节，或变成组成型的而不一定升高。本文使用的术语“改变的生物活性”是指GEP活性的改变，其可能是或不是GEP表达依赖性的。术语“改变的生物活性”还指这样的情况：其中GEP所赋予的任何生物功能(例如增殖、分化、转移)的改变导致与改变的GEP表达相同或等同的状况。

本文使用的术语“GEP”是指在HCC患者的HCC细胞提取物或正常肝细胞提取物或HCC患者细胞外液体、慢性乙型肝炎携带者的肝细胞提取物或细胞外液体、健康个体的肝细胞提取物或细胞外液体中的颗粒体蛋白-上皮素前体。

本文使用的术语“中和”是指使用抗-GEP抗体抵消GEP的活性或作用。

本文描述的“免疫组织化学”是指使用免疫组织化学方法检测所述HCC或正常肝或邻接的正常肝组织样品中的GEP存在情况。本文描述的术语“免疫组织化学”还指使用兔或小鼠抗人GEP多克隆抗体和缀合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗以及二氨基苯(DAB)和过氧化氢的显色检测方法。

本文描述的“蛋白质印迹分析”是指这样的方法：通过凝胶电泳由HCC样品分离提取蛋白；将分离的蛋白样品转移到膜上；用兔或小鼠抗人GEP抗体和缀合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗检测GEP；并用化学发光技术显色检测GEP。

本文描述的“接受者操作特征(ROC)曲线(receiver operatingcharacteristic curve)”用于检验在其范围内的GEP性能特征。曲线下面积(AUC)用作整体测试性能的指标，低于0.5的参比AUC表示没有区别能力。

本文描述的所有数据都通过SPSS(用于Windows的11.0版，SPSSInc.，Chicago，IL)分析。适宜的情况下使用卡方检验或Fisher精确检验比较分类变量。Student t-检验用于2组连续变量之间的统计学比较。通过Pearson关联分析相关性。P＜0.05时认为差异具有显著性。

本申请给出的具体实施例提供了优选实施方案的描述，尤其是抗-GEP抗体的检测用途以及中和抗-GEP抗体用于在体外和体内抑制HCC的GEP活性的用途。

附图简述

图1显示了蛋白质印迹分析的GEP抗体特异性。(A)单克隆GEP抗体A23特异性识别来自HepG2(G2)和Hep3B(3B)的细胞裂解物的、约88kDa的GEP-糖基化形式以及重组GEP-全长(FL)。相比于其邻接的非肿瘤肝组织(N)，GEP在肿瘤(T)中被显著上调(患者289和291)。(B)来自肝细胞癌细胞裂解物Hep3B(3B)、HepG2(G2)和Huh7(H7)的免疫沉淀。泳道1、3和5使用单克隆GEP抗体A23免疫沉淀。泳道2、4和6是使用小鼠IgG的模拟免疫沉淀。兔多克隆GEP抗体用于检测。泳道7、8和9是来自相同肝细胞癌细胞系的细胞裂解物。A23免疫沉淀复合物的约88kDa的GEP证实了单克隆和多克隆抗体的特异性。(C)在泳道1、2和3中分别为培养的肝细胞癌细胞Hep3B(3B)、HepG2(G2)和Huh7(H7)的上清液中的分泌性GEP的检测情况。泳道4、5和6为来自相同肝细胞癌细胞的细胞裂解物。

图2显示了GEP在人肝组织中的定位。(A)在瘤性肝细胞中检测到GEP表达(以褐色染色显现)，但在肿瘤组分中的其它细胞类型中没有检测到(400×放大倍数)。(B)邻接肿瘤的非肿瘤肝组织(400×放大倍数)揭示在非瘤性肝细胞中没有GEP信号。

图3显示了在72名健康供体、38名慢性乙型肝炎患者和107名HCC患者中的血清GEP浓度。

图4显示关于血清GEP的接受者操作特征曲线分析(粗实线)。将“灵敏度”(真阳性系数)对“1-特异性”(假阳性系数)作图。

图5显示，采用A23的体外治疗以剂量依赖性方式抑制细胞生长。经MTT测定检测细胞增殖。A)HepG2细胞和B)Hep3B细胞与PBS(对照)(■)、A23-50μg/ml(▲)或A23-100μg/ml(●)在1％FBS存在下温育5天。相比于PBS对照，差异于*P＜0.05水平时是显著的。C)通过直接ELISA检测到的A23(+)或PBS对照(-)处理后的HepG2和Hep3B培养上清液中的GEP浓度。D)Hep3B和HepG2的A23处理导致MAPK磷酸化降低。使HCC细胞系血清饥饿24小时，然后用A23-100μg/ml(泳道1-HepG2和泳道3-Hep3B)或PBS(对照)(泳道2-HepG2和泳道4-Hep3B)处理72小时。用兔多克隆GEP、抗磷酸化MAPK和抗MAPK抗体免疫印迹细胞裂解物(10μg)，抗-β肌动蛋白用作蛋白加样和转移的对照。

图6显示了Hep3B肿瘤异种移植物在裸小鼠中的生长抑制。以每周2次的方案用A23治疗所建立的Hep3B肿瘤治疗的剂量依赖性作用。以A23-50μg(▲)或A23-100μg(●)腹膜内注射A23抗体，PBS用作对照(■)。与PBS对照相比，差异于*P＜0.05和**P＜0.005的水平时是显著的。

图7显示了于A23治疗后31天的小鼠血清谱。A)A23浓度。B)GEP浓度。

图8显示了A)于A23治疗后31天的200×放大倍数的Hep3B异种移植物的组织学检查结果。B)于A23治疗后31天的200×放大倍数的非肿瘤肝脏的组织学检查结果。

图9为A23在Hep3B肿瘤中的增殖和凋亡作用的分析。A)通过Ki-67染色评价异种移植肿瘤细胞的增殖。B)通过TUNEL测定评价肿瘤细胞的凋亡。

图10显示了A23对Hep3B异种移植物的作用。用所示的针对磷酸化-p44/42MAPK(Thr202/Tyr04)和磷酸化-AKT(Ser473)抗体的磷酸化特异性抗体免疫印迹总的异种移植细胞裂解物(20μg)。总MAPK和AKT用作加样对照。还显示了抗-GEP印迹，并显示了作为加样对照的代表性的β-肌动蛋白再探测印迹。异种移植物得自PBS对照处理小鼠(泳道1)、50μg A23治疗小鼠(泳道2)和100μg A23治疗小鼠(泳道3)。

优选实施方案的详述

下面详细描述本发明的当前优选的实施方案，其与后面的实施例和附图一起用于解释本发明的原理。

本发明人由早前的cDNA微阵列分析(11)鉴定出GEP为潜在的HCC肿瘤标记。本发明人已进一步验证了在不同的患者样品组中的观测结果，并证实GEP蛋白在HCC组织中被上调(12)。另外，本发明人还证实，GEP水平正调节癌细胞增殖和肿瘤侵袭(12)。由于GEP为分泌性自分泌生长因子，所以本发明人认为，HCC肿瘤组织中的GEP上调还会导致患者的血清GEP蛋白水平升高，其因此可用作肝细胞癌的有用的诊断标记。

在本研究中，本发明人报告了GEP特异性单克隆和多克隆抗体的制备。使用新近分离的单克隆抗体表明GEP蛋白水平在HCC肿瘤组织中被上调，这与先前的观测结果一致(11，12)。由免疫组织化学研究可知，GEP蛋白在瘤性肝细胞中表达，但在其它肿瘤组分中不表达。本发明人随后由HCC细胞系条件培养基进行免疫印迹，评价HCC细胞是否会分泌GEP蛋白。本发明人已证实，由培养物上清液可检测到GEP，提示GEP可能为HCC患者血清中可检测到的分泌性蛋白。

为检测GEP血清蛋白，使用新近分离的抗体已建立了特异性GEPELISA。针对GEP的C-末端的单克隆抗体用作捕获抗体，针对GEP的中心部分的多克隆抗体用作检测抗体。利用这两种抗体组合针对GEP全长蛋白的两种不同表位增强了测定的特异性，这由免疫沉淀实验得到证实(图1B)。

尽管如此，由于HCC的异质性(20)，在所有的HCC组织中是否会表达一种肿瘤标记值得怀疑。然而，组合使用两种或三种标记将增强检测的灵敏度。在本研究中，本发明人证实，血清GEP水平与HCC患者的血清AFP水平没有关联。任何一种标记的HCC诊断灵敏度仅为58.0％(仅AFP)至60.7％(仅GEP)，但通过组合使用这两种标记，灵敏度增加至87.9％。

HCC伴有的高死亡率部分原因在于其早期没有症状。治疗性切除仅为20％的HCC患者的治疗选择。因此，HCC的早期检测是改善存活的重要因素。在本研究中，血清GEP在早期HCC患者中也是可检测到的(56.6％)，提示该标记对改善患者存活很重要的早期诊断应当是有用的。因此，血清GEP测定将提高HCC的早期检测，使得可以得到更好的治疗选择和存活结果。

本发明人先前已表明，使用反义方法下调GEP可显著降低HCC在无胸腺裸小鼠模型中的致瘤性(12)。此观测结果提示，GEP是引人注目的癌症治疗标靶。然而，基因传递模式和感染/转柒效力仍是成功的癌症基因疗法的主要障碍。相比于基因疗法，使用GEP抗体是对靶向癌症疗法更实用的且可行的方案。由于GEP是分泌性自分泌生长因子，因此本发明人认为，通过GEP特异性抗体A23中和胞外GEP可以阻碍GEP的增殖功能。与反义方法的靶向不同的是，诸如赫赛汀和抗VEGF的抗体靶向疗法具有较高效力和较低毒性，使靶向疗法在癌症患者中的变得切实可行。

为了研究抗GEP抗体如A23的抑制作用，在1％FBS存在下，将它们添加到HepG2和Hep3B细胞的培养上清液。与未处理对照相比，癌细胞的增殖被mAb A23以剂量依赖性方式显著抑制(图5A和5B)。培养上清液中的GEP浓度通过夹心ELISA检测。Hep3B的培养上清液中的GEP浓度高于HepG2(图5C)。在A23处理72小时后，培养上清液中的GEP浓度在两种细胞系中均降低(图5C)。该结果表明，加入A23能有效中和分泌到培养上清液中的GEP。还已表明，GEP在胞外调节的激酶信号转导途径中刺激p44/42有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化。为研究抗-GEP处理的增殖抑制是否与p44/42MAPK的磷酸化相关，在用A23处理后对培养的细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。如图5D所示，在培养上清液中加入抗-GEP A23达72小时，在HepG2和Hep3B这两种细胞系中均显著降低MAPK的磷酸化，提示细胞增殖的下降依赖于p44/42MAPK的磷酸化下降。

在动物研究中，用植入裸小鼠的Hep3B肿瘤证实抗-GEP mAbA23的抗肿瘤作用。一旦肿瘤的大小达到约0.3cm³，就开始50μg和100μg/注射的抗体治疗。每周2次给予9剂治疗，并监测肿瘤的大小。在治疗5周后，对于50μg和100μg治疗，用抗-GEP A23治疗的小鼠的中值肿瘤体积分别为1.57cm³(范围1.44-2.53cm³)和1.21cm³(范围0.79-1.97cm³)，而对照小鼠的中值肿瘤体积为2.20cm³(范围1.65-3.04cm³)。通过t-检验进行方差分析证实，治疗动物和未治疗动物之间的差异具有统计学显著性(P＜0.05)(图6)。该实验表明，在用A23治疗的个体中产生剂量依赖性的Hep3B肿瘤生长抑制。而且，该模型模拟了临床上大部分HCC患者在晚期才被诊断并且已经不能手术的情形。由于抗体治疗的肿瘤体积显著下降表明，使用抗-GEP抗体中和GEP即便在所建立的肿瘤中也可显著延迟肿瘤增殖。本研究证实，抗-GEP疗法对稳定所述疾病和/或延迟肿瘤发展是切实可行的。

当腹膜内注射抗-GEP mAb A23时，检测抗体效价，以便评价在小鼠血液循环中存在的实际抗体量。通过直接ELISA检测小鼠血清中的抗-GEP mAb A23的抗体效价。正如所料，对照组中的A23水平是检测不到的，但在治疗组中仍较高。对于100μg治疗组，A23的中值水平为74.61μg/ml(范围为4.50μg/ml至145.48μg/ml)。对于50μg治疗组，A23的中值水平为8.87μg/ml(范围为1.35-16.24μg/ml)(图7A)。为了研究A23在血清GEP清除中的有效性，通过夹心ELISA检测小鼠血清中的GEP浓度。对于PBS对照组，血清GEP水平是最高的，GEP的中值水平为21.46ng/ml(范围为8.33-137.50ng/ml)。然而，在A23治疗后，血清GEP水平被显著降低(P＜0.05)。在100μg治疗后，几乎检测不到血清GEP水平(中值＝0ng/ml，范围为0-2.5ng/ml)。在50μg治疗后，GEP的中值水平降低至7.08ng/ml(范围为0-10.83ng/ml)(图7B)。

在治疗结束时的异种移植物的组织学检查表明，接受A23的动物的肿瘤与接受对照疗法的动物的肿瘤相比具有显著差异。在100μgA23治疗组中，发现大块坏死区域，相比于对照组，细胞稀少区域明显更多(图8A)。治疗组和对照组的非肿瘤肝脏没有明显组织学差异(图8B)。

使用Ki-67抗体进行异种移植物的免疫组织学检查，在100μgA23治疗小鼠中的Ki-67阳性细胞相比于对照组显著下降(图9A)。然而，在治疗组和对照组中由TUNEL测定得到的阳性细胞数没有差异(图9B)。这些结果表明，A23治疗的肿瘤体积下降主要由增殖下降引起的，而不是由凋亡增加引起的。

为研究抗-GEP抗体对小鼠异种移植物中的肿瘤细胞增殖的作用机制，检测了关键增殖基因MAPK和AKT的磷酸化水平。MAPK和AKT这二者在Ser473处的磷酸化在抗-GEP治疗后被显著降低，提示抗-GEP抗体治疗经MAPK和AKT途径延迟肿瘤细胞增殖(图10)。这些观测结果表明，抗-GEP在体外和体内均延迟肿瘤细胞增殖。其以剂量依赖性方式抑制p44/42MAPK磷酸化和AKT磷酸化。

总之，本发明人已证明，GEP是HBV相关性HCC的新血清标记。AFP和GEP组合提高处于早期和晚期肿瘤的HCC诊断灵敏度。这种简单且可靠的免疫测定对检测血清GEP浓度的可用性可以提供一种有价值的工具，以进一步评价血清GEP对HCC管理的临床可用性。而且，本发明人已表明，抗-GEP抗体能够抑制所建立的HCC肿瘤的生长。这些结果表明GEP是HCC治疗标靶，并表明了抗-GEP抗体治疗HCC的潜在用途。

实施例1

患者样本

研究方案由香港大学伦理审查委员会(the Institutional ReviewBoard of The University of Hong Kong)批准，并获得患者和对照个体签署的同意书。在1999年3月至2004年10月之间，由107名被诊断为原发性HCC的患者、38名慢性乙型肝炎患者(只有那些在2年以上的随访期内没有恶性疾病征兆的患者才被纳入本研究)和72名乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性的健康供体获得血样。血清HBsAg在96名(89.7％)HCC患者中为阳性，因此对照组包括慢性乙型肝炎患者和健康志愿者。将血清样品冷冻于-70℃直至使用。由HCC患者收集肿瘤和邻接的非肿瘤肝组织，在液氮中急冻，并储存于-70℃直至使用。对平行切片进行福尔马林固定，并石蜡包埋，用于组织学检查和免疫组织化学研究。前瞻性收集包括所有患者和对照受试者的血清AFP水平在内的临床和病理学数据。

实施例2

细胞系

将人HCC细胞系Hep3B、HepG2和Huh7(美国组织培养物保藏中心((American Tissue Culture Collection)，Manassas，VA)和日本健康科学研究资源库((Japan Health Science Research Resources Bank)，Osaka，Japan))保持在补加10％胎牛血清(Gibco BRL，Carlsbad，CA)的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)中。

实施例3

建立抗体

通过用33μg缀合匙孔血蓝蛋白(KLH)的定制GEP特异性肽SEQ ID No：3连同弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich，Dorset，UK)皮下免疫接种BALB/c小鼠以产生GEP-特异性抗体。对于随后的加强免疫，每周2次腹膜内注射在弗氏不完全佐剂中的相同量的抗原。在每次加强免疫后，使用针对肽抗原的ELISA监测针对免疫抗原的血清抗体活性。对于显示出针对所述抗原的高血清抗体效价的小鼠，给予最后1次静脉内注射抗原的加强免疫，3天后采集脾脏。

抗-GEP单克隆抗体A23的产生

由其血清中显示出高抗体效价的小鼠采集脾脏。按照最初来源于Kohler和Milstein(21)的标准方案进行脾细胞与非生产性骨髓瘤细胞系NS0的融合。NS0保持在补加10％胎牛血清(Gibco BRL，Carlsbad，CA)的DMEM中。简而言之，由小鼠脾脏收集淋巴细胞，并使用聚乙二醇1500(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)与NS0融合。通过铺板入含HAT和20％FBS的DMEM培养基中选择杂交瘤。通过ELISA选择分泌抗体的杂交瘤，随后通过有限稀释亚克隆，使用小鼠MonoAB ID试剂盒(HRP)(Zymed Laboratories，Inc.，San Francisco，CA)测定单克隆抗体的同种型。

开发针对GEP的多克隆抗体

用100μg缀合匙孔血蓝蛋白(KLH)的GEP特异性肽SEQ IDNo：4(Zymed Laboratories，Inc.，San Francisco，CA)使用标准方案(22)免疫接种新西兰白兔。使用固定化抗原柱亲和纯化兔抗血清，对1×PBS透析，并浓缩至1mg/ml。

单克隆抗体的产生和检验

为产生GEP单克隆抗体，使用在GEP羧基末端的16个氨基酸的合成肽SEQ ID NO：3作为免疫原，以产生抗体。然后针对全长重组GEP和Hep3B细胞裂解物对克隆进行另一轮ELISA筛选。然后对这些克隆的上清液进行蛋白质印迹分析，并通过有限稀释亚克隆。克隆A23被鉴定为识别得自GEP重组蛋白(FL)、HCC培养细胞裂解物(Hep3B和HepG2)和患者组织裂解物的88-Kda的GEP糖基化形式的唯一抗体(图1A)。为增加夹心ELISA对全长GEP的特异性，本发明人定制了另一种特异性识别GEP的中心部分SEQ ID NO：4的GEP特异性多克隆抗体。

为测定多克隆GEP抗体和单克隆GEP抗体的特异性，进行免疫沉淀。单克隆GEP抗体和多克隆GEP抗体识别得自培养裂解物的88-kDa的糖基化GEP(图1B)。

为确定GEP是否为分泌性蛋白，使用GEP单克隆抗体检验HCC细胞系的条件培养基中的GEP。如图1C所示，在HCC细胞的上清液中可检测到88-kDa的糖基化GEP。

通过对肿瘤组织石蜡切片进行免疫组织化学揭示GEP定位。发现蛋白信号一律与瘤性肝细胞相关，但与肿瘤组织中的内皮细胞或成纤维细胞不相关，而在非肿瘤组织中的肝细胞没有显示出信号(图2)。

实施例4

蛋白质提取、蛋白质印迹和免疫沉淀

对HCC细胞系、HCC和邻近的非肿瘤肝组织进行蛋白印迹分析。通过在含有1mM PMSF的缓冲液A(8M尿素，50mM Tris-HCl pH8.0)中匀浆急冻的患者样品提取总蛋白。通过10％SDS-PAGE凝胶继之以蛋白质印迹分离总共10μg蛋白提取物。用5％脱脂乳的PBS/0.1％Tween 20溶液封闭印迹，并用适宜的单克隆抗体探测。多克隆山羊抗β-肌动蛋白抗体以1∶1000稀释度使用(DAKO，Glostrup，Denmark)。缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠和抗山羊二抗分别以1∶3000稀释度使用(AP biotech，Chalfont St，Giles，UK)。按照生产商的说明(APbiotech，Chalfont St.Giles，UK)进行ECL。用500μg细胞裂解物进行免疫沉淀，并与1μg纯化的单克隆抗体温育。在SDS-PAGE上分离免疫复合物，并用多克隆抗-GEP抗体免疫印迹。

实施例5

免疫组织化学

对石蜡包埋的HCC和邻接的非肿瘤肝脏组织进行免疫组织化学研究。方案先前已描述，并有修改(12)。通过微波进行抗原修复，切片浸没在柠檬酸盐缓冲液中，接着浸没在内源过氧化物酶封闭试剂和生物素封闭试剂(DAKO，Glostrup，Denmark)中。适宜的单克隆抗体以2μg/ml使用。通过缀合HRP的抗小鼠二抗检测信号，并用二氨基联苯胺(DAB)作为色原显色。用苏木精反染色组织切片。

实施例6

测定受试者血清中的GEP水平

以每孔0.5μg抗-GEP mAb A23的50μl PBS溶液包被96孔ELISA板(Nalge Nunc International，Rochester，NY)。用300μl封闭缓冲液(1×PBS，1％BSA，5％蔗糖，0.05％NaN₃)封闭板1小时，然后加入50μl 1∶5稀释的血清样品，并于室温温育2小时。在用0.05％Tween 20的1×PBS溶液洗涤未结合的物质后，使用亲和纯化的抗-GEP兔多克隆抗体(1∶2000，1mg/ml)，接着使用TMB(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)作为底物与缀合辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG(ZymedLaboratories，Inc，San Francisco，CA.)温育，从而检测结合的GEP。为定量存在于血清中的GEP，平行进行以含10％胎牛血清的PBS稀释的纯化GEP的校准曲线。每个样品都以一式四份检测3次。GEP夹心ELISA的动态范围为469pg/ml至30ng/ml。将合并的患者血清样品纳入每个测定，用于调整板与板之间的偏差。测定之内和之间的偏差分别为2.9％(范围1.1-5.5％)和5.0％(范围1.3-10.8％)。

通过特异性ELISA检测107名HCC患者、72名健康个体和38名慢性乙型肝炎患者的血清GEP蛋白水平(图3)。健康受试者的中值和平均血清GEP水平分别为4.59ng/ml和5.63ng/ml(范围0-20.46ng/ml)。慢性乙型肝炎患者的血清GEP的中值和平均浓度分别为6.03ng/ml和6.85ng/ml(范围0.17-28.36ng/ml)。HCC患者的中值水平和平均血清GEP水平分别为10.53ng/ml和16.09ng/ml(范围0-113.59ng/ml)。在HCC患者中检测的血清GEP水平显著高于健康对照(P＜0.001)和慢性乙型肝炎患者(P＜0.001)的该水平。还建立了GEP的ROC曲线(图4)，表明AUC为0.74(95％CI 0.67-0.81，P＜0.001)。为辨别HCC与包括慢性乙型肝炎携带者和健康个体在内的对照，使用Youden指数确定类别预测的最佳截取值。最佳截取值为9.07ng/ml，其分别达到了60.7％的灵敏度和82.5％的特异性。

实施例7

用血清AFP和GEP的组合筛选诊断HCC

还检测了同一组样品的血清AFP水平，并与血清GEP数据相比较。在使用血清AFP水平进行HCC诊断时，使用100ng/ml的截取值，其被视为相对高的和特异性的(表1和2)。还检验了20ng/ml的较低血清AFP截取值，与血清GEP比较的数据在补充表1和2中提供。通过血清AFP(58.0％，62/107，截取值为100ng/ml)和血清GEP(60.7％，65/107，截取值9.07ng/ml)进行HCC诊断的灵敏度相当(表1)。在HCC患者中，GEP和AFP血清水平之间没有关联(r＝-0.113；P＝0.243)。大部分HCC患者(87.9％，94/107)表现出血清GEP(＞9.07ng/ml)或AFP(＞100ng/ml)升高。重要之处在于，同时使用这两个标记将HCC诊断的灵敏度由58.0％(仅AFP升高)增加至87.9％(AFP或GEP或这二者的升高)。

实施例8

用血清AFP和GEP的组合筛选早期诊断HCC

早期诊断是能使HCC患者接受有效治疗和改善存活的关键。按照肿瘤阶段检验血清标记的性能。在早期HCC患者中，通过血清GEP(56.6％，43/76)和血清AFP(55.3％，42/76)进行检测的灵敏度是相似的(表2)。在晚期患者中，通过血清GEP进行HCC检测的灵敏度(71.0％，22/31)稍好于血清AFP(64.5％，20/31)。在84.2％(64/76)的早期患者和96.8％(30/31)的晚期HCC患者中观察到血清GEP或AFP升高。因此，在早期和晚期HCC患者中使用两个标记均应增加诊断灵敏度。

实施例9

细胞增殖测定

经由3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)测定检测细胞增殖。简而言之，如所示将5×10³个细胞接种至含有1％FBS、有或没有mAB A23的100μl DMEM培养基的96孔板。每24小时用含有0.5mg/ml MTT的100μl DMEM更换培养基，并于37℃温育3小时。以100μl MTT溶剂(0.1N HCl的异丙醇溶液)溶解晶体，吸光度以540nm的检测值减去650nm的背景吸光度作图。每个数据点代表3个独立实验的结果，每个实验以一式三份进行。

在1％FBS存在下，将抗-GEP mAb A23加至HepG2和Hep3B细胞的培养上清液中，与未处理的对照相比，癌细胞增殖受到所述mAb的显著抑制(图5A和B)。这种抑制为剂量依赖性方式(图5B)。培养上清液的GEP浓度通过夹心ELISA检测。Hep3B在培养上清液中的GEP浓度高于HepG2(图5C)。在A23处理72小时后，培养上清液中的GEP浓度在两个细胞系中均降低(图5C)。该结果表明，加入A23可有效中和分泌到培养上清液中的GEP。

实施例10

抗-GEP抗体处理对MAPK磷酸化的作用

在含有1mM PMSF的细胞裂解缓冲液(Cell Signaling TechnologyInc.，Beverly，MA)中匀浆小鼠异种移植物和Hep3B细胞以提取总蛋白。通过10％SDS-PAGE凝胶继之以蛋白质印迹分离总共10μg蛋白提取物。用5％脱脂乳的PBS/0.1％Tween 20溶液封闭印迹，并用适宜的抗体探测。多克隆山羊抗β-肌动蛋白抗体以1∶1000稀释度使用(DAKO，Glostrup，Denmark)。多克隆兔抗-GEP抗体以1∶500稀释度使用(12)。针对p44/p42MAPK和磷酸化-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)的抗体按照生产商的说明(Cell Signaling Technology，Inc.，Beverly，MA)使用。缀合HRP的抗小鼠、抗兔和抗山羊二抗分别以1∶3000稀释度使用(AP biotech，Chalfont St.Giles，UK)。按照生产商说明(AP biotech，Chalfont St.Giles，UK)进行ECL。

业已表明，GEP在胞外调节的激酶信号转导途径中刺激p44/42有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化(23)。为研究抗-GEP处理的增殖抑制是否与p44/42MAPK的磷酸化相关，在用A23处理后对培养细胞的裂解物进行蛋白质印迹分析。如图5D所示，在培养上清液中加入抗-GEP A23达72小时，在HepG2和Hep3B这两个细胞系中均显著降低MAPK的磷酸化，提示细胞增殖的降低依赖于p44/42MAPK的磷酸化降低。

实施例11

裸小鼠的HCC异种移植物和皮下异种移植物的治疗

本研究方案由香港大学关于教学和研究中活体动物的使用的委员会批准。将小鼠(n＝15)关在12小时昼夜循环的栅栏实验室中，并接受食物和水。所有的操作都在小鼠处于异氟烷气体麻醉之下时进行。没有小鼠显示出消瘦迹象或其它毒性迹象。将Hep3B细胞(2×10⁶个细胞/小鼠)皮下注射至5至6周龄的雄性无胸腺裸小鼠。用游标卡尺测量测定肿瘤的大小，按照式(a×b²)/2计算肿瘤体积，其中a和b分别为最大和最小直径(24)。在肿瘤体积达到约0.3cm³的平均肿瘤体积时开始治疗，将小鼠随机分为3组(n＝5)。在研究过程中每周2次腹膜内注射抗体。据我们初步研究，在腹膜内注射后血清A23抗体在小鼠中的半衰期时间(T_1/2)长于72小时(数据未显示)，因此，选择每周2次腹膜内注射100μg和50μg的治疗方案。第1组小鼠用100μg纯化的小鼠IgG(Zigma-Aldrich，Saint Louis，MO)或PBS治疗。在初步研究中，本发明人发现，小鼠IgG或PBS对肿瘤生长没有差异。第2组和第3组小鼠分别用50μg和100μg A23mAb治疗。

检验抗-GEP mAb A23对植入裸小鼠的Hep3B肿瘤的抗肿瘤作用。一旦肿瘤的大小达到约300mm³，就开始50μg和100μg/注射的抗体治疗。每周2次给予9剂治疗，并监测肿瘤的大小。在5周治疗后，对于50μg和100μg治疗，用抗-GEP A23治疗的小鼠的中值肿瘤体积分别为1.57cm³(范围为1.44-2.53cm³)和1.21cm³(范围为0.79-1.97cm³)，而对照小鼠的中值肿瘤体积为2.20cm³(范围1.65-3.04cm³)。通过t-检验方差分析证实，治疗动物和未治疗动物之间的差异为统计学显著性差异(P＜0.05)(图6)。用A23治疗产生剂量依赖性的Hep3B肿瘤生长抑制。

实施例12

定量A23治疗后小鼠血清中的GEP

收集小鼠血清，使用ELISA检测抗体浓度和血清GEP浓度。

当腹膜内注射抗-GEP mAb A23时，检测抗体效价，以便评价小鼠血液循环中存在的实际抗体量。小鼠血清中的抗-GEP mAb A23的抗体效价通过直接ELISA检测。正如所料，对照组的A23水平检测不到，但治疗组中仍然较高。对于100μg治疗组，A23的中值水平为74.61μg/ml(范围为4.50μg/ml至145.48μg/ml)。对于50μg治疗组，A23的中值水平为8.87μg/ml(范围为1.35-16.24μg/ml)(图7A)。

为了检验A23在血清GEP清除中的有效性，通过夹心ELISA检测小鼠血清的GEP浓度。对于PBS对照组，血清GEP水平是最高的，GEP的中值水平为21.46ng/ml(范围为8.33-137.50ng/ml)。然而，在A23治疗后，血清GEP水平被显著降低(P＜0.05)。在100μg治疗后，几乎检测不到血清GEP水平(中值＝0ng/ml，范围为0-2.5ng/ml)。在50μg治疗后，GEP的中值水平降低至7.08ng/ml(范围为0-10.83ng/ml)(图7B)。

实施例13

安乐死和组织处理

至第5周末使小鼠安乐死。收集异种移植物和肝组织，在液氮中急冻，并储存于-70℃直至使用。对平行切片进行福尔马林固定，并石蜡包埋，用于组织学检查和免疫组织化学研究。

A23治疗后的异种移植物的组织学检查

治疗结束时的异种移植物的组织学检查表明，给予A23的动物的肿瘤相比于接受对照治疗的动物的肿瘤有显著差异。在100μg A23治疗组中，发现大块坏死区域，相比于对照组有显著更多的细胞稀少区域(图8A)。治疗组和对照组的非肿瘤肝脏没有明显组织学差异(图8B)。

使用Ki-67抗体进行异种移植物的免疫组织学检查，在100μgA23治疗小鼠中的Ki-67阳性细胞相比于对照组显著下降(图9A)。然而，在治疗组和对照组中由TUNEL测定得到的阳性细胞数没有差异(图9B)。这些结果表明，A23治疗的肿瘤体积下降主要是由增殖下降引起的，而不是由凋亡增加引起的。

实施例14

体内抗-GEP抗体治疗的作用

为研究A23作用于细胞增殖的机制，使用得自治疗后的小鼠肿瘤异种移植物的总蛋白裂解物检查关键增殖蛋白MAPK和AKT的磷酸化水平。按照生产商的说明(Cell Signaling Technology，Inc.，Beverly，MA)使用针对p44/p42MAPK、磷酸化-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)、AKT和磷酸化-AKT(ser473)的抗体。MAPK和AKT在Ser473处的磷酸化在抗-GEP治疗下被降低(图10)，提示抗-GEP抗体治疗在小鼠肿瘤异种移植物中经由MAPK和AKT途径延迟肿瘤细胞增殖。

实施例15

抗-GEP抗体的开发

用位于SEQ ID No.5、6、7、8、9、10、11、12或13及其周围的GEP特异性肽序列免疫接种BALB/c小鼠或新西兰白兔产生GEP特异性抗体(图11)。使用抗-GEP单克隆抗体或抗-GEP多克隆抗体检测血清GEP水平或抑制肿瘤生长。

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表1.颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)和甲胎蛋白(AFP)在肝细胞癌患者(n＝107)中的诊断灵敏度

表2.颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)和甲胎蛋白(AFP)在不同肿瘤阶段的肝细胞癌患者中的诊断灵敏度

早期

晚期

补充表1.颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)和甲胎蛋白(AFP)在肝细胞癌患者(n＝107)中的诊断灵敏度

补充表2.颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)和甲胎蛋白(AFP)在不同肿瘤阶段的肝细胞癌患者中的诊断灵敏度

早期

晚期

序列表

SEQ ID No.1：GEP的核苷酸序列

1 ggcgagagga agcagggagg agagtgattt gagtagaaaa gaaacacagc attccaggct

61 ggccccacct ctatattgat aagtagccaa tgggagcggg tagccctgat ccctggccaa

121 tggaaactga ggtaggcggg tcatcgcgct ggggtctgta gtctgagcgc tacccggttg

181 ctgctgccca aggaccgcgg agtcggacgc aggcagacca tgtggaccct ggtgagctgg

241 gtggccttaa cagcagggct ggtggctgga acgcggtgcc cagatggtca gttctgccct

301 gtggcctgct gcctggaccc cggaggagcc agctacagct gctgccgtcc ccttctggac

361 aaatggccca caacactgag caggcatctg ggtggcccct gccaggttga tgcccactgc

421 tctgccggcc actcctgcat ctttaccgtc tcagggactt ccagttgctg ccccttccca

481 gaggccgtgg catgcgggga tggccatcac tgctgcccac ggggcttcca ctgcagtgca

541 gacgggcgat cctgcttcca aagatcaggt aacaactccg tgggtgccat ccagtgccct

601 gatagtcagt tcgaatgccc ggacttctcc acgtgctgtg ttatggtcga tggctcctgg

661 gggtgctgcc ccatgcccca ggcttcctgc tgtgaagaca gggtgcactg ctgtccgcac

721 ggtgccttct gcgacctggt tcacacccgc tgcatcacac ccacgggcac ccaccccctg

781 gcaaagaagc tccctgccca gaggactaac agggcagtgg ccttgtccag ctcggtcatg

841 tgtccggacg cacggtcccg gtgccctgat ggttctacct gctgtgagct gcccagtggg

901 aagtatggct gctgcccaat gcccaacgcc acctgctgct ccgatcacct gcactgctgc

961 ccccaagaca ctgtgtgtga cctgatccag agtaagtgcc tctccaagga gaacgctacc

1021 acggacctcc tcactaagct gcctgcgcac acagtggggg atgtgaaatg tgacatggag

1081 gtgagctgcc cagatggcta tacctgctgc cgtctacagt cgggggcctg gggctgctgc

1141 ccttttaccc aggctgtgtg ctgtgaggac cacatacact gctgtcccgc ggggtttacg

1201 tgtgacacgc agaagggtac ctgtgaacag gggccccacc aggtgccctg gatggagaag

1261 gccccagctc acctcagcct gccagaccca caagccttga agagagatgt cccctgtgat

1321 aatgtcagca gctgtccctc ctccgatacc tgctgccaac tcacgtctgg ggagtggggc

1381 tgctgtccaa tcccagaggc tgtctgctgc tcggaccacc agcactgctg cccccagggc

1441 tacacgtgtg tagctgaggg gcagtgtcag cgaggaagcg agatcgtggc tggactggag

1501 aagatgcctg cccgccgggc ttccttatcc caccccagag acatcggctg tgaccagcac

1561 accagctgcc cggtggggca gacctgctgc ccgagcctgg gtgggagctg ggcctgctgc

1621 cagttgcccc atgctgtgtg ctgcgaggat cgccagcact gctgcccggc tggctacacc

1681 tgcaacgtga aggctcgatc ctgcgagaag gaagtggtct ctgcccagcc tgccaccttc

1741 ctggcccgta gccctcacgt gggtgtgaag gacgtggagt gtggggaagg acacttctgc

1801 catgataacc agacctgctg ccgagacaac cgacagggct gggcctgctg tccctaccgc

1861 cagggcgtct gttgtgctga tcggcgccac tgctgtcctg ctggcttccg ctgcgcagcc

1921 aggggtacca agtgtttgcg cagggaggcc ccgcgctggg acgccccttt gagggaccca

1981 gccttgagac agctgctgtg agggacagta ctgaagactc tgcagccctc gggaccccac

2041 tcggagggtg ccctctgctc aggcctccct agcacctccc cctaaccaaa ttctccctgg

2101 accccattct gagctcccca tcaccatggg aggtggggcc tcaatctaag gccttccctg

2161 tcagaagggg gttgtggcaa aagccacatt acaagctgcc atcccctccc cgtttcagtg

2221 gaccctgtgg ccaggtgctt ttccctatcc acaggggtgt ttgtgtgtgt gcgcgtgtgc

2281 gtttcaataa agtttgtaca ctttcaaaaa aaaaaaaaaa aaa

SEQ ID No.2：GEP的氨基酸序列

1MWTLVSWVALTAGLVAGTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKW

PTTLSRHLGGP

61CQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADG

RSCFQRSGNNS

121VGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPH

GAFCDLVHTRCIT

181PTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKY

GCCPMPNATCC

241SDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVS

CPDGYTCCRLQ

301SGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEK

APAHLSLPDPQAL

361KRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQG

YTCVAEGQCQRGS

421EIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQ

LPHAVCCEDRQH

481CCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCH

DNQTCCRDNRQG

541WACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDP

ALRQLL

SEQ ID No.3：部分GEP的氨基酸序列

GEP氨基酸578-593

“PRWDAPLRDPALRQLL”

SEQ ID No.3a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.3GEP氨基酸578-593

CCGCGCTGGGACGCCCCTTTGAGGGACCCAGCCTTGAGACAGCTGCTG

SEQ ID No.4：部分GEP的氨基酸序列

GEP氨基酸351-365

“HLSLPDPQALKRDVP”

SEQ ID No.4a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.4GEP氨基酸351-365

CACCTCAGCCTGCCAGACCCACAAGCCTTGAAGAGAGATGTCCCC

SEQ ID No.5：部分GEP的氨基酸序列，含有SEQ ID No.3

GEP氨基酸574-593

“RREAPRW DAPLRDPALRQLL”

SEQ ID No.5a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.5GEP氨基酸574-593

CGCAGGGAGGCCCCGCGCTGGGACGCCCCTTTGAGGGACCCAGCCTTG

AGACAGCTGCTG

SEQ ID No.6：部分GEP的氨基酸序列，含有SEQ ID No.4

GEP氨基酸337-363

“QGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRD”

SEQ ID No.6a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.6 GEP氨基酸337-363

CAGGGGCCCCACCAGGTGCCCTGGATGGAGAAGGCCCCAGCTCACCTC

AGCCTGCCAGACCCACAAGCCTTGAAGAGAGAT

SEQ ID No.7：部分GEP信号肽的氨基酸序列

GEP氨基酸1-17

“MWTLVSWVALTAGLVAG”

SEQ ID No.7a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.7GEP氨基酸1-17

ATGTGGACCCTGGTGAGCTGGGTGGCCTTAACAGCAGGGCTGGTGGCTG

GA

SEQ ID No.8：部分GEP接头的氨基酸序列

GEP氨基酸18-57

“TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWP”

SEQ ID No.8a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.8GEP氨基酸18-57

ACGCGGTGCCCAGATGGTCAGTTCTGCCCTGTGGCCTGCTGCCTGGACC

CCGGAGGAGCCAGCTACAGCTGCTGCCGTCCCCTTCTGGACAAATGGCC

CACAACACTGAGCAGGCATCTG

SEQ ID No.9：部分GEP接头的氨基酸序列

GEP氨基酸114-122

“QRSGNNSVG”

SEQ ID No.9a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.9GEP氨基酸114-122

CAAAGATCAGGTAACAACTCCGTGGGT

SEQ ID No.10：部分GEP接头的氨基酸序列

GEP氨基酸180-205

“TPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSS”

SEQ ID No.10a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.10GEP氨基酸180-205

ACACCCACGGGCACCCACCCCCTGGCAAAGAAGCTCCCTGCCCAGAGGA

CTAACAGGGCAGTGGCCTTGTCCAGCTCG

SEQ ID No.11：部分GEP接头的氨基酸序列

GEP氨基酸262-280

“KENATTDLLTKLPAHTVG”

SEQ ID No.11a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.11GEP氨基酸262-280

TCCAAGGAGAACGCTACCACGGACCTCCTCACTAAGCTGCCTGCGCACA

CAGTGGGG

SEQ ID No.12：部分GEP接头的氨基酸序列

GEP氨基酸418-441

“RGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRD”

SEQ ID No.12a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.12GEP氨基酸418-441

CGAGGAAGCGAGATCGTGGCTGGACTGGAGAAGATGCCTGCCCGCCGG

GCTTCCTTATCCCACCCCAGAGAC

SEQ ID No.13：部分GEP接头的氨基酸序列

GEP氨基酸497-517

“KEVVSAQPATFLARSPHVGVK”

SEQ ID No.13a：部分GEP的核苷酸序列

含有SEQ ID No.13GEP氨基酸497-517

AAGGAAGTGGTCTCTGCCCAGCCTGCCACCTTCCTGGCCCGTAGCCCTC

ACGTGGGTGTGAAG