利用反式白藜芦醇苷水解制备反式白藜芦醇的方法

摘要

本发明涉及反式白藜芦醇苷水解制备反式白藜芦醇的方法，解决了现有酶法处理所需时间较长、单纯的酸水解的反式白藜芦醇苷转化率很低的问题。本发明水解转化体系的配方为90％纯度的反式白藜芦醇苷∶甲醇∶12％盐酸溶液为4∶2∶2；按上述配方，将90％纯度的反式白藜芦醇苷溶解于甲醇中，充分溶解后，加入12％盐酸溶液；在温度55－75℃条件下，水解反应1－3h；水解体系经过硅胶板的薄层层析，并取得刮下物；将刮下物用3ml甲醇溶解，并超声清洗震荡，分离，冻干上清液即得白色粉末状的反式白藜芦醇。与现有的酶法技术相比，转化率高为45％，水解时间短为1－3小时。本发明方法操作简单；由于甲醇是可以再回收利用的，因此生产成本低，易于实现工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及反式白藜芦醇苷水解制备反式白藜芦醇的方法。

背景技术

白藜芦醇及其衍生物具有多种药理作用，可用于抗癌，抗高血压以及心血管疾病发生等，在临床应用上有很高的价值。它主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹、松树、买麻藤、朝鲜槐等12科、31个属的72种植物中。

虎杖(polygonum cuspidtum Sieb.et Zucc.)为蓼科蓼属多年生草本植物。虎杖的干燥根茎中主要含有蒽醌类、二苯乙烯类、水溶性多糖和鞣质等成份，白藜芦醇苷和白藜芦醇是主要的二苯乙烯类物质，其中白藜芦醇苷的含量远远高于白藜芦醇，王磊^[1]对来自全国不同地区的虎杖商品药材中反式白藜芦醇苷的含量测定结果表明，反式白藜芦醇苷可以达到1.4-3.6％，平均2.23％；俸灵林^[2]研究发现白藜芦醇的含量仅为0.29～0.78％。

如何将反式白藜芦醇苷水解转化为具有更高生物活性的反式白藜芦醇进而提高原料中反式白藜芦醇的含量是提高虎杖原料利用率的关键因子。

目前，常用的反式白藜芦醇苷转化方法主要有酶法和微生物发酵法。已经有采用酶法或微生物法的专利报道^[3]，如中国专利CN99115156.9，CN02139911.5，CN03147908.1，CN200610031850.3，CN200610200633.2。酶法处理中经常使用的是纤维素酶，主要通过破坏材料的细胞壁，或水解β-D-葡萄糖苷键，使白藜芦醇苷转变成白藜芦醇，从而提高白藜芦醇的提取率。如，李梦青^[4]等用纤维素酶酶解后提取，白藜芦醇的提取率比直接提取法提高了近2倍，由0.56％提高到1.50％，而白藜芦醇苷的提取率有所降低。向海艳^[5]等比较了直接醇提和酶法醇提，发现与直接醇提工艺相比，酶法醇提的提取率提高了近5倍，白藜芦醇的得率达到1.2％。蒋胜铎等^[6]采用微生物转化技术处理虎杖原料，有效促进白藜芦醇苷水解转化为白藜芦醇。通过对发酵时间、发酵原料含水量、发酵温度、发酵pH值的优选，确定了最佳的微生物酶促转化条件，使原料中的白藜芦醇含量提高了15倍，达到1.75％。酶法处理的缺点是所需时间较长。有关酸水解的报道较少，如CN200510019788.1。

本发明实验的前期工作表明，单纯的酸水解的白藜芦醇苷转化率很低(图1中甲醇为0的处理)，不具备开发前景。

发明内容

为了解决酶法处理所需时间较长、单纯的酸水解的反式白藜芦醇苷转化率很低的问题，本发明提供一种转化率高、水解时间短的利用反式白藜芦醇苷水解制备反式白藜芦醇的方法。

具体的技术解决方案如下：

利用反式白藜芦醇苷水解制备反式白藜芦醇的方法包括下述步骤，

水解转化体系的配方如下：

90％纯度的反式白藜芦醇苷：甲醇：12％盐酸溶液为4：2：2；

所述90％纯度的反式白藜芦醇苷单位为毫克或克，甲醇单位为毫升或升，12％盐酸溶液单位为毫升或升；

水解操作步骤如下：

按上述配方，将90％纯度的反式白藜芦醇苷溶解于甲醇中，充分溶解后，加入12％盐酸溶液；在温度55-75℃条件下，水解反应1-3h，得水解体系；

将水解体系经过硅胶板的薄层层析纯化，薄层层析纯化所用展开剂为：甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝5：4：1，并在365nm紫外灯下将与白藜芦醇纯品的迁移率Rf值相同的斑点刮下得刮下物；

将刮下物用3ml甲醇溶解，并在超声波清洗器中震荡30分钟，6000rpm离心10分钟，收集的上清液冻干即得白色粉末状的反式白藜芦醇；在4毫升水解体系中能得到1.2mg白色粉末状的反式白藜芦醇。

虎杖水解制备反式白藜芦醇的方法包括下述步骤，

水解转化体系的配方如下：

20目虎杖干粉：甲醇：12％盐酸溶液为1：10：10；

所述20目虎杖干粉单位为克，甲醇单位为毫升，12％盐酸溶液单位为毫升；

水解操作步骤如下：

按上述配方，将20目虎杖干粉溶解于甲醇中，充分溶解后，加入12％盐酸溶液；在温度55-75℃条件下，水解反应1-3h，得水解体系；

将水解体系经过硅胶板的薄层层析纯化，薄层层析纯化所用展开剂为：甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝5：4：1，并在365nm紫外灯下将与白藜芦醇纯品的迁移率Rf值相同的斑点刮下得刮下物；

将刮下物用3ml甲醇溶解，并在超声波清洗器中震荡30分钟，6000rpm离心10分钟，收集的上清液冻干即得白色粉末状的反式白藜芦醇；在20毫升的水解体系中可以得到17.6毫克的白色粉末状的反式白藜芦醇。

本发明方法中的甲醇也是虎杖中白藜芦醇及其苷的提取溶剂，因此本方法可以与常规的虎杖白藜芦醇及其苷的提取方法合而为一，在提取的过程中促进白藜芦醇苷的转化，从而提高了虎杖中白藜芦醇的提取率。

本发明与现有的酶法技术相比，具有转化率高为45％，水解时间短为1-3小时的优点。本发明方法操作简单；由于甲醇是可以再回收利用的，因此生产成本低，易于实现工业化生产。

附图说明

图1为甲醇浓度对反式白藜芦醇苷酸解的影响图，

图2为底物浓度对反式白藜芦醇苷酸解的影响图，

图3为酸浓度对反式白藜芦醇苷酸解的影响图，

图4为温度对反式白藜芦醇苷酸解的影响图，

图5为酸解产物的高效液相色谱图，

图6为图5中酸解产物(1)的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地说明。

实施例1：

原料：

原料A：反式白藜芦醇苷(单位为毫克或克，纯度为90％)，

原料C：纯甲醇(单位为毫升或升)，

原料D：盐酸(12％)(单位为毫升或升)；

水解转化体系的最适配方为A：C：D＝4：2：2；

水解转化体系的配制：

首先称取原料A，并溶解在原料C溶液中，充分溶解后，再添加原料D溶液。

反应条件：将水解转化体系，置于55-65℃下3h或75℃1h；得水解体系；

反应完毕后，水解体系经过硅胶板的薄层层析纯化，薄层层析纯化所用展开剂为：甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝5：4：1，并在紫外灯(365nm)下将与白藜芦醇纯品的迁移率(Rf值)相同的斑点刮下得刮下物；将刮下物用3ml甲醇溶解，并超声波清洗器中震荡30分钟，6000rpm离心10分钟，收集的上清液冻干即可，在4毫升水解体系中能得到1.2mg白色粉末状的反式白藜芦醇，即转化率为45％。

技术说明如下：

1、底物A或B浓度，水解转化体系中的最适反式白藜芦醇苷浓度为1mg/ml，小于此浓度则反式白藜芦醇得率低，而高于此浓度得率并不增加(图2)。

2、药品C甲醇浓度，水解转化体系中的最适甲醇浓度范围为50-75％。低于此浓度范围则反式白藜芦醇得率低，在水解5小时，含75％甲醇浓度中的反式白藜芦醇得率是纯酸溶液中的9倍(图1)。

3、药品D盐酸浓度，水解转化体系中的最适盐酸浓度范围为4-8％。如果超过8％，如为10％，将缩短反应时间为2h，但得率低；低于8％，则要延长反式白藜芦醇苷的水解时间(图3)。

4、水解转化体系中的最适温度影响转化率，高温促进水解，而低温则延缓水解，如45℃，需要6小时以上；如75℃，1小时内达到最高(图4)。

5、水解转化的时间，可以根据酸、醇和温度加以调控，见图1，3，4。

6.利用高效液相色谱对经过薄层层析(TLC)纯化后的水解产物的定性试验显示(图5)，反式白藜芦醇苷经过水解后的产物有两个，其中斑点1经过质谱确定为反式白藜芦醇(图6)；由于缺乏标准品，另一个斑点尚未定性，不排除存在顺式白藜芦醇的可能性。

7、正交试验、方差分析及多重比较分析提示(表1)，反式白藜芦醇苷粗品的最优水解转化体系是：反式白藜芦醇苷粗品用甲醇溶解后，按1mg/ml的底物浓度，配制含6％盐酸浓度和50％甲醇浓度的水解溶液，在温度65℃下，水解5h。

结合正交试验和单因子试验，表1和图4，从降低成本角度考虑，最优水解转化体系中的温度和时间可以设为65℃和3h或75℃和1h。

8、正交试验、方差分析及多重比较分析提示(表2)，虎杖干粉的最优水解转化体系是，虎杖干粉用甲醇溶解后，按1：20的料液比浓度，配制含6％盐酸浓度和50％甲醇浓度的水解溶液，在温度55℃下，水解3h。

9、转化率的计算公式：水解后白藜芦醇的摩尔数/水解前白藜芦醇苷的摩尔数*100％。

10、得率的计算公式为：水解后白藜芦醇的毫克量/水解前虎杖干粉的毫克量*100％。

实施例2：

原料：

原料B：虎杖干粉(取24目下，单位为克)

原料C：纯甲醇(单位为毫升或升)

原料D：盐酸(12％)(单位为毫升或升)；

水解转化体系的最适配方为B：C：D＝1：10：10；

按上述配方，将20目虎杖干粉溶解于甲醇中，充分溶解后，加入12％盐酸溶液；在温度55-75℃条件下，水解反应1-3h，得水解体系；

反应完毕后，水解体系经过硅胶板的薄层层析纯化，薄层层析纯化所用展开剂为：甲苯：乙酸乙酯：甲酸＝5：4：1，并在365nm紫外灯下将与白藜芦醇纯品的迁移率Rf值相同的斑点刮下得刮下物；

将刮下物用3ml甲醇溶解，并在超声波清洗器中震荡30分钟，6000rpm离心10分钟，收集的上清液冻干即得白色粉末状的反式白藜芦醇；在20毫升的水解体系中可以得到17.6毫克的白色粉末状的反式白藜芦醇，即得率是1.76％。

虎杖干粉中的反式白藜芦醇产率最高可以达为1.76％。

表1反式白藜芦醇苷水解的正交实验结果表(4ml反应体系中)

表2.虎杖粉水解的正交实验结果表(20ml反应体系中)

参考文献

[1]王磊，黄澜，张勉，等.虎杖商品药材中白藜芦醇苷的含量测定[J].中国中药杂志，2002，27(5)：344-347。

[2]俸灵林，郑昕，包文芳，等.RP-HPLC法同时测定虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量[J].天然产物研究与开发，2004，16(6)：534-538。

[3]曾超珍，刘志祥，吴耀辉，等.虎杖白藜芦醇的提取工艺及检测方法的研究进展[J].时珍国医国药，2007，18(12)：2992-2993。

[4]李梦青，聂媛，张洁，等.酶解法提取虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素[J].精细化工，2008，25(5)：467-470。

[5]向海艳，周春山，陈龙胜，等.酶法提取虎杖中白藜芦醇新工艺研究[J].林产化学与工业，2004，24(4)：77-80。

[6]蒋胜铎，周晓勤，邬定才.虎杖中白藜芦醇提取技术研究[J].湖南林业科技2008，35(3)：8-10。