枯草芽孢杆菌dcy－1及在生物发酵中的应用

摘要

本发明属于畜牧养殖技术领域，具体涉及一株分离的枯草芽孢杆菌菌株筛选及其在猪粪堆肥生产和生物发酵床中的应用。本发明也属于农业微生物应用技术领域和堆肥的制备技术领域。通过分离、筛选和鉴定，获得一株适用于猪粪堆肥生产和生态发酵床的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)dcy－1，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M 208122。将所述的菌株制成微生物菌剂，并成功地应用在猪粪堆肥生产和规模化养殖的生物发酵床中。本发明适用于规模化养殖猪场的畜禽粪污处理。

说明书

技术领域

本发明属于畜牧养殖技术领域，具体地说本发明涉及一株分离的枯草芽孢杆菌菌株筛选及其在猪粪堆肥生产和发酵床中的应用。该方法适用于规模化养殖猪场畜禽粪污处理，属于农业微生物应用技术领域。

背景技术

由于规模化、集约化养殖业的迅猛发展，畜禽养殖环境污染演化成为严重的社会问题，并引起社会的高度重视与关注。堆肥作为一种保持良好环境效应的产物，具有生物处理的可持续性和废弃资源的循环利用等特征，已被许多国家和地区所接受，成为处理有机固体废物的有效方法之一。堆肥化的实质是微生物在适宜条件下代谢发酵的作用。堆肥技术可以实现猪场废弃物的无害化、稳定化、减量化，因而被认为是有机固体废弃物处理与利用的有效方法，但是传统的天然堆肥不仅发酵效果不稳定，不彻底，而且有效的营养成分得不到充分发挥。微生态发酵床养猪技术是一种实现养猪生产粪尿的资源化利用和无害化处理的新方法，但是存在着微生物种类复杂，有害微生物难以控制等缺陷。因此寻找促进堆肥高温高效发酵的微生物具有很重要的现实意义。国内外学者对堆肥微生物学进行了广泛研究。堆肥微生物学研究对开发堆肥微生物资源，加速堆肥过程，缩短堆肥周期，提高堆肥质量等方面都具有重要意义。

传统培养分离微生物的方法是将定量样品接种于培养基中，在一定的温度下培养一定的时间，然后对生长的菌落计数和计算含量，并通过在显微镜下观察其形态构造，结合培养分离过程生理生化特性的观察鉴定种属分类特性。冯明谦等(冯明谦，刘德明.滚筒式高温堆肥中微生物种类数量的研究.中国环境科学.1999，19(6)490-492)研究了滚筒式高温堆肥过程中微生物种类和数量，分离鉴定了细菌5个属20株、霉菌8个属13株、放线菌1个属3株、酵母菌2个属2株。结果表明，细菌和霉菌是堆肥过程中的优势类群，其中芽孢杆菌和曲霉菌是优势种。

迄今为止尚未见到有关耐高温的枯草芽孢杆菌的筛选及其在猪粪堆肥和发酵床中的应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，针对现有猪粪堆肥发酵存在的缺陷和发酵床存在的缺陷，从猪粪堆肥中筛选出生长力旺盛的，耐高温能够加速堆肥发酵后熟进程的，缩短堆肥周期的微生物菌种及菌剂，利用该菌剂进行猪粪堆肥发酵生产和发酵床的应用，证明添加本发明的菌剂dcy-1后，猪粪堆肥提前到达高温发酵期，其堆制周期也明显缩短。同时本发明菌剂dcy-1的应用也显著提高了猪场发酵床的发酵温度，有效杀死致病微生物，间接降低猪的发病率。

本发明采用以下的技术方案实现：

从发酵堆肥的高温期采集堆肥样品，用蒸馏水稀释，破碎后用不同筛选培养基进行分离培养和鉴定，得到一株耐高温的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)dcy-1，该菌株已于2008年8月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 208122。

将本发明将分离的菌株dcy-1 16S rDNA序列用常用的细菌16S rDNA测序检测(Alfreider，A.，Peters，S.，Tebbe，C.C.，Rangger，A.，Insam，H.，2002.Microbial community dynamicsduring composting of organic matteras determined by 16S ribosomal DNA analysis.Compost.Sci.Util.10，303-312)，并将该dcy-1 16S rDNA序列提交给美国生物信息学中心(NCBI)网站，获得登录号为FJ 169903。经与GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比对，发现本发明分离的菌株dcy-1 16S rDNA序列的与已知序列的同源性达到＞98％，经鉴定，确定本发明分离的菌株为一株枯草芽孢杆菌，分类命名为Bacillus subtilis。

本发明的枯草芽孢杆菌菌株dcy-1的菌学特征如下：

菌体大小为(0.6-1.0)umx(1.5-2.0)um，细胞呈杆状，芽孢中生，革兰氏染色呈阳性反应，能运动。在LB琼脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落圆形、边缘波状、表面隆起、湿润、色暗、起皱折。最适生长温度为28℃，pH6-8均生长良好，最适生长pH为7.0-7.2。还原石蕊牛奶，水解酪素、淀粉，接触酶阳性，在7％的NaCl浓度中生长。

该菌株按照常规甘油管保藏方法保藏。

附图说明

图1：是本发明的技术流程图

图2：是本发明的枯草芽孢杆菌菌剂dcy-1应用堆肥试验中发酵温度的变化曲线图。

本发明效果是：

1、本发明的菌剂明显加快了猪粪堆肥的发酵速度，缩短了堆制周期，节约人力，降低了堆肥的成本。

2、本发明菌剂提高了猪场发酵床的发酵温度，有效杀死致病微生物，间接降低猪的发病率。更详细的技术步骤见《具体实施方式》。

具体实施方式

实施例1

1、微生物的分离和培养

1.1取样：称取5g猪粪堆肥样品(过孔径1mm，即18号的筛孔)置于50mL烧杯中并加入玻璃珠，用量筒加25mL蒸馏水，置于摇床震荡20min使样品充分散开，并使微生物细胞分散，静置。然后用沸水煮15min左右，以杀死其他微生物，使芽孢杆菌产生芽孢，得到含有芽孢杆菌的稀释菌液。

1.2稀释菌液制备：用1支无菌吸管吸取步骤(1)10^-1稀释菌液1mL移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让稀释菌液充分混合，即成10^-2稀释菌液；再换用1支无菌吸管吸取10^-2稀释液1mL移入装有9mL无菌水试管中，即成为10^-3稀释菌液。同理，分别制成10^-4、10^-5、10^-6稀释菌液，备用。

1.3菌种的纯化培养：通过稀释平板划线分离法分离，制备平板(蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、NaCl 5g/L，琼脂粉15g/L，补充蒸馏水至1L，调pH值至7.0)，将制备好的平板于121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后将步骤1.2所稀释的菌液接种到灭菌后的平板上划线培养，培养温度30℃，培养时间12h。

1.4挑选生长旺盛的菌种在牛肉膏蛋白胨培养基(配方同上述步骤1.3，但不加琼脂)中扩大培养，得到纯的芽孢菌液。

2、菌株的16s RNA鉴定

2.1、芽孢杆菌染色体DNA的提取和纯化

2.1.1 收集菌体：取1.5mL上述一中步骤1.4的芽孢菌液，在12000rpm下离心1min。

2.1.2 倒出培养液，加入1mL TES溶液(称取242g Tris碱溶于750mL双蒸水中，加入57.1mLHAC、100mL0.5M EDTA(pH8.0)，加水定容至1000mL)洗涤。

2.1.3 12000rpm离心1min收集菌体，倒出培养液，加入300ul TES并混合均匀。

2.1.4 加溶菌酶(购自上海生工生物工程技术有限公司)至终浓度为150ug/mL，37℃水浴1h～2h。

2.1.5 加入1/10体积的10％十二烷基磺酸钠(SDS)(约50ul)，混匀，65℃水浴10min(观察菌液此时应为透明)。

2.1.6 加入5M NaCl溶液到终浓度为1M(约100ul)。

2.1.7 加入等体积的苯酚/氯仿，振荡，混匀(有些菌较粘稠，此时为鼻涕状，用枪头缓慢吸打，直至不粘稠为止)。

2.1.8 12000rpm离心8min，取上清液400ul缓慢转入另一离心管。

2.1.9 加200ul氯仿混匀，12000转离心5min，取上清液300ul转入另一离心管。

2.1.10 加入约250ul异丙醇，置倒数次，室温下放置至少15min。

2.1.11 12000rpm离心5min(注意：离心管在离心机孔中的方向以便知道DNA沉淀在离心管壁内那个部位)。

2.1.12 小心吸出全部液体，加入500ul 70％的乙醇洗涤总DNA(浸泡即可，切勿打散DNA)。

2.1.13 尽量吸干离心管中管壁的液体，打开管盖放其自然干燥。

2.1.14 加入100ul去离子水或低浓度TE(10mmol/LTris·Cl(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0))，121℃高压蒸汽灭菌，溶解总DNA。

2.2PCR扩增和琼脂糖电泳

以芽孢杆菌DNA为模版，采用芽孢杆菌16S rRNA基因通用引物，进行PCR扩增。反应体系和程序见表1和表2。

表1PCR反应体系

  10×缓冲液(含Mg2+)  5μL  dNTP(2.5mmol/L)  2μL  引物R1(20pmol/μL  0.5μL  引物F1(20pmol/μL  0.5μL  模版  4μL  TaqDNA聚合酶(2.5U)  0.5μL  ddH2O  37.5μL  总体积  50μL

表2PCR反应程序

上游引物：5’CA GA T GGGA GC TT GC T CCCTG3’

下游引物5’C GA CTTCA CCCCAA TCA TC A TC TG 3’

上述引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

通过PCR扩增出16S rDNA片段，经测序获得目的基因序列。用美国生物信息学中心(NCBI)的BLAST程序对所初步获得的菌种的16S rDNA序列进行登陆，获得登录号为FJ 169903(GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，与已收录的序列进行核苷酸同源性比较。经过微生物学分类鉴定，确定该分离的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，我们将该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dcy-1，该菌株已于2008年8月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 208122。

3、发酵培养

将筛选得到的枯草芽孢杆菌株dcy-1接种到发酵培养基上(成分及配比：蛋白胨10g/L、麸皮5g/L、NaCl 5g/L、酵母提取物1g/L，补充蒸馏水至1L，调pH至7.0左右，于121℃高压蒸汽灭菌20min)，在160rpm，30-33℃摇床上培养36h，得到生产上可以应用的液体菌剂，申请人将该菌剂命名为枯草芽孢杆菌菌剂dcy-1。

显而易见，申请人或其他本领域的其他人运用农业微生物常规操作方法如固体培养发酵方法制备出本发明所述的的固体菌剂。类似的方法可以参照华中农业大学的授权发明专利(专利号为ZL 02147874.0，发明名称：净化水质的枯草芽孢杆菌、菌剂及固体发酵工艺与应用)所介绍的方法生产出本发明所述的枯草芽孢杆菌固体菌剂dcy-1。

4、堆肥发酵试验

按重量计：将鲜猪粪300公斤(本身有一定的含水量)，稻壳糠100公斤，将液体菌剂dcy-1按5‰(重量计)的添加量加入到所述的培养物料中(必要时加适量的水)，调节物料的碳、氮比为25∶1，调节堆肥的含水率为60％进行堆肥试验。分别设置试验组和对照组，实验组加菌剂dcy-1(添加量为5‰，重量计算)，对照组不加菌剂dcy-1，堆制时间设为19天，按照常规检验方法检测本发明菌剂的应用效果。

5、堆肥指标的测定

5.1温度测定：在堆肥的过程中，每天上午10时，下午3时左右对堆体温度测定，记录。

5.2堆肥样本pH值的测定：称取5g堆肥样品(过18目筛)置于50mL烧杯中，用量筒加25mL蒸馏水，搅拌1min(最好用磁力搅拌器)使样品充分散开，放置1h(此时应避免空气中有氨及挥发性酸)，然后以pHS-2型pH计测定pH值。

5.3堆肥中大肠菌群值测定(参照中华人民共和国卫生部发布，中华人民共和国国家标准：粪便无害化卫生标准(GB7959-1987)，北京，中国标准出版社，1988年2月版)：

5.3.1称取10g发酵成熟的堆肥样品，放于无菌的250mL带玻璃珠的三角瓶内，加无菌水，使其体积为I00mL，即成为1∶10的混悬液。

5.3.2样品稀释：用1mL灭菌吸管吸取1∶10混悬液1mL，注入10mL灭菌水管内，制成1∶100稀释液，按同法依次稀释，制成1∶1000、1∶10000稀释液(每种稀释液各换一支灭菌吸管)。

初发酵试验：无菌操作，用1mL灭菌吸管吸取1∶10(相当0.19份样品)、1∶100(相当0.019份样品)、1∶1000(相当0.0019份样品)、1∶10000(相当0.00019份样品)稀释液各1mL，分别接种于乳糖胆盐发酵管内，每个稀释液各用1支吸管。置44.5℃培养24±2h。

5.3.3平板分离：平板培养基使用伊红美蓝琼脂培养基。伊红美蓝琼脂平板内含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，菌体带H⁺，故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的，有金属光泽的深紫色(龙胆紫的紫色)阳性菌落。而产酸弱的菌株的菌落呈棕色。不发酵乳酸的菌落无色透明。

5.3.4将产酸产气或只产酸的发酵管接种于伊红美蓝琼脂培养基上，然后放入37℃恒温培养箱内，培养24h，挑选典型菌落(带金属光泽菌落)，进行革兰氏染色，于显微镜下观察。

5.3.5复发酵试验：以上革兰氏阴性无芽孢杆菌者，需通过此试验再进一步证实.将平皿中其余的另一半菌落接种于乳糖发酵管内，置44.5℃培养24h，原理与初发酵试验相同，培养后产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

5.3.6根据发酵管的阳性管数查表，即为粪大肠菌群菌值(参照中华人民共和国卫生部发布，中华人民共和国国家标准：粪便无害化卫生标准，GB7959-1987；北京，中国标准出版社，1988年2月版)。

5.4堆肥中蛔虫卵死亡率测定：

取待检样品2g放入乳钵中，先加水10mL搅匀，再加饱和食盐水50mL混匀后，吸取浸出液，注入改良Mc Master’S计数板的计数室，置显微镜台上，静置1min-2min，由于饱和食盐水的比重大于蛔虫卵的比重，当堆料与饱和食盐水混合后，静止，可使蛔虫卵漂浮在溶液的表面，便于在显微镜下观察。在显微镜下计数两个刻度室中的虫卵总数和活虫卵数，两个计数室虫卵数的平均值A乘200，即为每g待检样品中的虫卵数。

6、生物发酵床试验

6.1生物发酵床的设计：为了验证本发明的枯草芽孢杆菌菌剂dcy-1在集约化(规模化)养猪猪舍生物发酵床(又称栏圈垫料)中的应用效果，本实施例设计了如下的生物发酵床，所用材料及其配比如表3所示。

表3、生物发酵床垫料材料选择及其配比(重量)

  原料  谷壳  锯末  鲜猪粪  米糠  本发明的菌剂dcy-1  比例  50％  40％  10％  2kg/m³  100g/m³

6.2采用逐级混合的方法，将所需的米糠与本发明的菌剂dcy-1混合拌匀。

6.3按表3给出的量，将谷壳、锯末、鲜猪粪、米糠与菌剂dcy-1混合物由下到上顺序倒入发酵坑，用铲车或人工将其反复翻堆充分混合搅拌均匀。边翻堆搅拌边喷洒水，调节水分，使垫料水分达到45％-50％(以外观显示湿润但手握疏松不成团为度，注意水分不要过量)。

6.4将搅拌混合均匀后的垫料堆积起来发酵。堆积好后表面铺平，适当按压，再用包装袋覆盖周围保温。垫料堆积发酵共10天，中间翻堆一次，以将表层垫料翻埋到深部发酵。

6.5从第二天起，选择垫料不同部位监测30cm处的温度的变化。当温度逐渐上升，第二天便可达到40℃，以后最高可达到70℃左右，一周后又缓慢下降到40-45℃，温度趋于稳定。

实施结果：

试验组在堆制刚开始时，猪粪成褐色团块，有很浓的臭味和蛆的存在，并吸引了大量的蚊蝇。24h后，堆体即发出一股强烈刺鼻刺眼的氨味。从第5天开始，氨味大大减弱，堆体仅有很淡的臭味。但取样时，对堆体的翻动还是会引发很浓的氨味，此外，白色菌团已在堆体周边范围生长。至第9天时，蝇蛆完全消失，室内己完全闻不出氨味，揭开薄膜可见猪粪己成松散状。第11天时，试验的两堆体四周最下部表面有蘑菇状的菌丝生长。到第14天左右时，已变得疏松的猪粪有森林腐殖土的芳香味。而对照组与实验组相比，直到第19天才达到腐熟标准。两个堆体在堆制过程中，都经历了升温期、高温期、降温期三阶段，它们的的高温期分别维持在一周以上，但是达到高温期的堆肥堆的时间有先有后，加有菌剂dcy-1的实验堆在试验的15天的发酵期中，第三天堆肥堆的温度即上升到40℃以上，比对照组提前两天，高温期55℃以上维持12天，比对照组(不加菌剂dcy-1)提前5天。分析表明大肠杆菌和蛔虫卵的杀灭率分别为0.58％、100％；0.63％、100％，达到了国家粪便无害化卫生标准。