强启动子枯草芽孢杆菌核黄素操纵子整合型载体的构建并在枯草芽孢杆菌中的表达

摘要

本论文研究的主要内容是以下内容： 通过DNA片段原生质转化法，用带有完整 recA 基因的 DNA 片段转化产核黄素菌株 B．subtilis 24(recA4突变株)原生质体，恢复了B．subtilis 24的同源重组功能。恢复 recA 基因功能恢复后，菌株的核黄素产量没有下降(为 1.3g/L)是比较理想的受体菌。 运用基因工程方法构建了带强启动子SP02和P43及原启动子P1核黄素操纵子的三个B．subtilis 整合型质粒，发现三个带核黄素操纵子质粒都可以在大肠杆菌中能产一定量的核黄素，核黄素产量P43>P1≈SP02。然后，分别通过整合型质粒在 B．subtilis D3染色体上定点(amyE位点)整合和随机整合研究了带不同启动子的核黄素操纵子在 B．subtilis 中的表达情况。定点(amyE位点)整合的转化子中，核黄素产量P1>P43>SP02。通过比较发现随机整合的效果要比定点(amyE位点)整合好，通过筛选得到了带有P43强启动子核黄素操纵子的高产核黄素菌株，达3.1g/L。 研究了不带启动子的 rib 结构基因构建的多克隆载体重组子在 E．coli(Top10)中产核黄素的原因。利用PCR方法从 B．subtilis 扩增出只含核黄素操纵子中 ribA结构基因的DNA片段，克隆到E．coli 中发现该菌株已有一定的核黄素表达量。一方面解释了带rib 结构基因的多克隆载体在E． coli (Top10)中产核黄素的原因，另一方面说明了单独增加，ribA的基因剂量就能增加核黄素的产量。

目录

文摘

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前言

第一章文献综述

1.1核黄素的生产

1.2产核黄素基因工程菌研究现状

1.3 B.subtilis产核黄素工程菌

1.3.1 B.subtilis核黄素操纵子结构

1.3.2 B.subtilis核黄素操纵子编码产物的功能

1.3.3 B.subtilis产核黄素工程菌的优点

1.4 B.subtilis合成核黄素的代谢工程

1.4.1代谢工程的基本原理

1.4.2 B.subtilis合成核黄素的代谢分析

1.4.3 B.subtilis产核黄素工程菌构建思路

1.5 B.subtilis中的同源重组

1.5.1 RecA蛋白的功能

1.5.2同源重组的相关基因簇及表达产物

1.6枯草芽孢杆菌中质粒的复制及稳定性

1.7 B.subtilis整合型质粒

1.7.1整合型质粒的原理

1.7.2整合型质粒的用途

1.7.3常见的枯草芽孢杆菌整合型质粒

1.8本文的主要研究内容

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种和质粒

2.1.2主要实验仪器

2.1.3药品与试剂

2.1.4培养基

2.2核黄素的发酵和测定方法

2.2.1菌体生长曲线的测定

2.2.2菌种的纯化和保藏

2.2.3发酵初筛

2.2.4发酵液中核黄素的测定

2.3基因工程方法

2.3.1原生质体转化

2.3.2 Spizizen转化

2.3.3质粒的小规模提取

2.3.4枯草芽孢杆菌质粒的大规模提取

2.3.5大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.3.6革兰氏阳性菌染色体DNA的提取

2.3.7用于转化和构建载体的DNA片段的制备

2.3.8 DNA的酶切和连接

2.3.9 DNA片段的回收和纯化

第三章实验结果和讨论

3.1受体菌的改造

3.1.1 recA基因的扩增及酶切鉴定

3.1.2 DNA片段的原生质体转化及recA+菌株的筛选

3.2产核黄素整合型表达载体的构建

3.2.1 SP02-rib整合型表达载体的构建

3.2.2 P43-rib整合型表达载体的构建

3.2.3 P1-rib(原启动子)产核黄素整合型表达载体的构建

3.3整合型表达载体在E.coli中的表达

3.4整合型表载体在了B.subtilis中的表达

3.4.1质粒Spizizen法转化B.subtilisD3

3.4.2转化子的整合方式和核黄素产量

3.5ribA基因载体的构建和表达

3.5.1 PCR扩增枯草杆菌ribA结构基因

3.5.2克隆载体的构建

第四章结论

参考文献

附录

论文发表

致谢