通过使用细菌ω－转氨酶光学拆分外消旋胺混合物制备光学活性N－保护的3－氨基吡咯烷或光学活性N－保护的3－氨基哌啶以及相应的酮

摘要

本发明涉及光学活性胺的制备方法，所述光学活性胺可以用作合成例如药用产品的中间体。

说明书

技术领域

本发明涉及光学活性手性胺的制备方法。

背景技术

手性胺在医药、农药和化学产业中起到非常重要的作用。它们通常作为中间体或合成单体用于制备各种诸如药物活性物质的生理活性物质，例如头孢菌素或吡咯烷衍生物。在为数众多的手性胺的各种应用中，只有一种特定的光学活性形式，即(R)或(S)对映体是有生理活性的。因此，需要提供一种光学活性形式的手性胺的制备方法。

通过添加手性羧酸结晶非对映体盐来制备手性胺，这些要求部分得到了满足(Breuer at al.，Angewandte Chemie(2004)116,806-843)。其他的化学方法则是利用对映体选择性拆分，通过分解具有C＝N双键的前手性的前体。

此外，使用不同的酶，例如蛋白酶、酰胺酶和脂肪酶，进行立体选择性裂解外消旋体是已知的(Bornscheure and Kazlauskas，Hydrolases in Organic Synthesis(2005)，Wiley-VCH Weinheim)。特定的转氨酶，即α-转氨酶适合用于制备光学活性的氨基酸也是已知的(Bartsch et al.，Appl.Environm.Microbiol.(1996)62，3794-3799，Cho et al.，Biotechnol.Bioeng.(2003)83,226-234，JP 011 53084A2(1998)，JP 633 04986 A2(1988)，EP 0 248 357 A2 and Ziehr et al.，Biotechnol.Bioeng.(1987)29,482-487)。

然而，这些现有技术的方法具有各种缺点。尽管相比传统的方法，酶法通常使用更为温和的条件，并且能够获得合理的立体选择性，但是，它们通常使用的酶的底物特异性、对映体选择性和/或转化率对于工业化的生产过程还不够高。另外，使用转氨酶生产光学活性胺的一个最主要的缺陷是常常会发生底物和产物抑制现象。因此，本发明的一个目的就是提供一种用于制备光学活性的手性胺的改进的方法，特别是一种底物特异性、转化率和/或对映体选择性得到提到的方法。

发明内容

通过提供一种光学活性手性胺的制备方法，本发明解决了潜在的技术问题，该方法包括转化一种包含一个酮基的氨基受体化合物，以及一种3-氨基吡咯烷(3AP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物，每一种均在环氮原子上结合一个保护基团，加入(R)或(S)选择性转氨酶，以获得3AP或3APi的对映体。这个氨基化合物对应于所述的氨基受体化合物，而N-保护的3-吡咯烷酮或N-保护的哌啶-3-酮则是酮产物。

本发明的方法包括(a)提供一种氨基受体和一种1-N-保护的3AP或1-N-保护的3APi的消旋混合物，例如各个胺的两种对映体的混合物，(b)用(R)-或(S)-选择性转氨酶转化所述氨基受体以及各个胺的消旋混合物，(c)获得一种光学活性的手性胺，一种胺产物和一种酮产物。

根据本发明的一个优选实施例，在随后的可选处理步骤中，步骤c)中获得的光学活性的手性胺被从步骤c)获得的反应混合物中分离并纯化。

本发明的反应根据以下反应式进行：

根据本发明，所述3-氨基吡咯烷(3AP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物在环的第二个氮原子上都具有保护基团，也就是在胺的手性中心的一号位的氨基，参与转氨反应的3号位没有受到保护。

保护基团的存在使得所述被保护的胺，即1-N-保护的3AP或3APi，更有效地转化为所需的光学活性手性胺。因此，保护基团的存在，获得了所需的光学活性手性胺的高得率。相比之下，环上的氮原子没有保护基团的起始胺的效率较低。

所以，本发明提供了一种酶解1-N-保护的胺的方法，通过使用至少一种(R)-或(S)-选择性转氨酶，将1-N-保护的手性胺的对映体混合物中一种特定的对映体上的一个氨基转移到一种氨基受体上，从而形成所需的光学活性产物。在本发明的上下文中，术语“胺的酶解”或“消旋混合物的酶解”是指利用立体选择性酶转化消旋混合物的一种对映体的光学分解。根据(R)-或(S)-选择转氨酶的对映体偏好性，一种所需光学构型的光学活性手性胺，即(R)-或(S)-对映体就获得了。因此，在本发明的一个实施例中，在酶解合成中使用一种(S)-选择性转氨酶，去除消旋混合物中的(S)-对映体，并生成手性胺的所需的光学活性的(R)-对映体；而在本发明的另一个实施例中，在酶解合成中使用(R)-选择性转氨酶，去除消旋混合物中的(R)-对映体，并生成所需的光学活性的(S)-对映体。除了所需的光学活性手性胺外，该反应还从消旋混合物的转氨反应中产生了一种酮产物，来自所使用的氨基受体的一种胺产物，以及部分未分解的不需要的对映体和未转化的氨基受体。

在本发明的一个优选实施例中，所述保护基团是一个叔丁氧羰基(Boc)。在另一个优选实施例中，所述保护基团是一个苄基。在另一个优选实施例中，所述保护基团是一个苄氧羰基(Cbz)。

在本发明的上下文中，一种转氨酶是磷酸吡哆醛依赖性的转氨酶，其催化氨基的转移。转氨酶被分类在E.C.2.6.1.X。在本发明的一个特别优选的实施例中，所述转氨酶是一种(R)-或(S)-选择性的转氨酶，在一个优选实施例中，特别的是一种ω-转氨酶。

在本发明的上下文中，(R)-或(S)-选择性转氨酶是一种分类号为E.C.2.6.1.18的酶。这些氨基转氨酶的特征在于，它们主要利用初级的胺作为底物。这些酶的进一步的特征就是显示出的(R)-或(S)-选择性转氨酶催化的反应的平衡常数大于1，本发明可以使用的(R)-或(S)-选择性转氨酶已有描述，例如在Iwasaki et al.，Biotechnol.lett.(2003)25，1843-1846，Shin et al.，Biotechnol.Bioeng.(1997)55，348-358，Shin and Kim，Book of Abstracts，217^thACS National Meeting，Anaheim，Calif.，March 21-25，(1999)180，Shin and Kim，Biosc.Biotechnol.Biochem.(2001)65，1782-1788和Shin and Kim，Biotechnol.Bioeng.(1998)60,534-540。

所以，在本发明的一个优选实施例中，本发明的方法所使用的(R)-或(S)-选择性转氨酶是来源于：河流弧菌(Vibrio fluvialis)、特别是菌株JS17，反硝化产碱菌(Alcaligenes denitrificans)、特别是菌株Y2K-2，肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)、特别是菌株YS2F，或者是苏芸金杆菌(bacillus thuringiensis)、特别是菌株JS64(关于菌株的鉴定请见上述的Shin and Kim，1998)。当然，本发明也可以理解为术语(R)-或(S)-选择性转氨酶是有机体的提取物，例如含有一种(R)-或(S)-选择性转氨酶的微生物或细胞，或者是自身包含有(R)-或(S)-选择性转氨酶的活体或死的细胞和微生物。这样一种微生物或细胞或提取物或转氨酶可以采用固定或非固定的形式，所述(R)-或(S)-选择性转氨酶也可以是重组产生、自然生成或遗传修饰的(R)-或(S)-选择性转氨酶，这些酶部分或完全地由核酸序列编码，或者是它们的衍生物，包含于一种上述的有机体和它们的等同物中。

在本发明的上下文中，术语“光学活性手性胺”与术语“对映体活性手性胺”涉及同样的主题。这些术语特别的是指一种制备物，在一个更为优选的实施例中，其基本上不含不需要的对映体。因此，光学活性手性胺主要是包含一种过量的对映体或者甚至是仅由一种对映体组成。

特别的，在本发明的上下文中，光学活性手性胺的光学纯度至少为70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8％，特别是至少为99.9％。

在本发明中，光学纯度用一种对映体超过另一种对映体的百分比来表示，所以，光学纯度的百分比是(R)-和(S)-对映体的浓度之差与两种对映体的总浓度的商(A的光学纯度％＝([A]-[B])：([A]+[B])×100，其中A和B代表(R)-和(S)-对映体浓度，或相反)。

在本发明中，优选的，所述手性胺的消旋混合物转化成所需的光学活性手性胺的转化率至少为30、40、45、46、47、48、49％，特别是50％，分析光学纯度的浓度和转化率可以通过使用例如HPLC、气相色谱(GC)，光度或荧光的方法来确定。

本发明显示，保护基团对于转化率有着积极的作用，因而使得使用(S)-特异性转氨酶的(R)-3-氨基吡咯烷的得率得到提高。另外，保护基团还显示了(虽然不明显)对于3-氨基吡咯烷的转化率的影响，并且对于酶的选择性有积极作用。

在本发明的上下文中，氨基受体是一种分子，其含有一个酮基，并且，通过(R)-或(S)-选择性转氨酶，能够接受来自一个氨基供体的氨基，例如，在目前的情况下，来自胺的消旋混合物的一种胺。在本发明的一个特别优选的实施例中，所述氨基受体是一个α-酮酸。在本发明的一个更为优选的实施例中，所述氨基受体选自：苯丙酮酸，其盐，丙酮酸，其盐，乙醛酸，其盐，苯乙酮，2-酮戊二酸，其盐，丙酮，3-氧代丁酸，其盐，和2-丁酮。此外，在另一个实施例中，3-氧代吡咯烷(3-OP)，(3-吡啶基)甲酮(3-PMK)，3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)，或3-氧代戊酸甲酯(3-OPME)也可以用作氨基受体。

根据本发明，由氨基受体苯丙酮酸转化获得的胺产物为苯丙氨酸。由氨基受体丙酮酸转化获得的胺产物为丙氨酸。由氨基受体乙醛酸转化获得的胺产物为甘氨酸。由氨基受体苯乙酮转化获得的胺产物为1-苯乙胺。由氨基受体2-酮戊二酸转化获得的胺产物为谷氨酸。由氨基受体丙酮转化获得的胺产物为异丙胺。由氨基受体3-氧代丁酸转化获得的胺产物为3-氨基丁酸。由氨基受体2-丁酮转化获得的胺产物为仲丁胺。由氨基受体3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)转化获得的胺产物为3-氨基丁酸。由氨基受体3-氧代戊酸乙酯(3-OPME)转化获得的胺产物为3-氨基戊酸甲酯。

因此，在一个优选实施例中，所获得的需要的光学活性手性胺依赖于所使用的(R)-或(S)-选择性转氨酶，或者是所述手性胺的(R)-或(S)-对映体。

根据本发明，本方法所获得的酮为1-N-保护的3-吡咯烷酮或者是1-N-保护的哌啶-3-酮。

本发明的方法包括使用一种(S)-或(R)-选择性转氨酶以及一种氨基受体转化1-N-保护的3AP的消旋混合物，以获得光学活性(R)-或(S)-1-N-保护的3AP。本发明的方法也包括使用一种(R)-或(S)-选择性转氨酶以及一种氨基受体转化1-N-保护的3APi的消旋混合物，以获得光学活性(S)-或(R)-1-N-保护的3APi。

根据本发明的方法，所获得的1-N-保护的3AP或1-N-保护的3APi中的保护基团可以使用现有技术已知的任意去保护的方法去除。一种使用浓缩的盐酸和丙酮去除叔丁氧羰基(Boc)的方法例如在Coffey et al.，Org.Proc.Res.Dev.，8(6)(2004)，pages 945-947中有报道。

在本发明的一个特别优选的实施例中，所述氨基受体和胺的消旋混合物在水介质、例如生理缓冲液中通过转氨酶进行反应。在一个特别优选的实施例中，所述转氨反应的pH控制在5～9，特别是7～8.5。在一个特别优选的实施例中，所述反应的温度控制在10～65℃，优选20～50℃，特别是18～25℃，优选室温或34～39℃，特别是37℃。在本发明的一个更为优选的实施例中，所述氨基受体和胺的消旋混合物的摩尔比为1：1～1：10，特别是1：1～1：4。在本发明的一个优选实施例中，所述酶活力可以是从1～20.000μmol/min。

在一个优选实施例中，本发明涉及一种方法，用于制备如上所述的光学活性手性胺，根据该方法，在第一步a)提供一种氨基受体以及3-氨基吡咯烷(3AP)或3-氨基哌啶(3APi)的消旋混合物，每一种均在环氮原子上具有保护基团；在第二步b)使所述手性胺的消旋混合物和所述氨基受体通过至少一种ω-转氨酶转化；在第三步c)获得一种光学活性手性胺，一种胺产物，以及一种酮产物；在下一步d)在步骤c)获得的酮产物和/或胺产物被从获得的反应混合物中去除，也就是通过酶解，特别是使用选自于脱羧酶、合酶、脱氢酶中的一种酶酶解。

在一个更为优选的实施例中，所述酮和/或胺产物可以利用蒸发或萃取去除。在一个更为优选的实施例中，所获得的酮产物也可以通过自发的脱羧作用去除。

在一个更为优选的实施例中，步骤c)中获得的所述酮产物通过与一种乙醇脱氢酶(ADH)反应而被去除，所述乙醇脱氢酶例如乳酸菌发酵得到的酸乳酒ADH，能将苯乙酮降解为1-苯乙醇。

在本发明的一个更为优选的实施例中，步骤c)中获得的所述酮和/或胺产物被连续地从反应混合物中去除，优选的是通过连续萃取。

在一个特别优选的实施例中，所述酮产物可以使用一种两相系统或酶-膜反应器通过连续萃取的方式被去除。

这些特别优选的实施例的优点是获得了理想的转化率，因为作为本方法的副产物的酮被从平衡反应中去除。这个反应由于受到产物导向的制约，因此可以高立体选择性地转化为所需的产物。去除酮产物是特别有利的，因为这使得产物抑制最小化。

本发明的更优选的实施例是从属权利要求的主题。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作更为详细的描述。

实施例1：酶解(R，S)-B3AP

本实施例中，来自河流弧菌(Vibrio fluvialis)(Julich Chemical Solutions，德国)的(S)ω-转化酶(以下称为TA7)，以及来自反硝化产碱菌(Alcaligenesdenitrificans)(Julich Chemical Solutions，德国)的(S)ω-转化酶(以下称为TA7)(以下称为TA8)被用于反应混合物中，在pH＝7的50mM Tris-HCl中的终浓度为4U/ml。以10mM(终浓度)的(R，S)-B3AP(N-1叔丁氧羰基氨基吡咯烷)消旋混合物溶液(20μmol)作为起始反应物，使用TA7或TA8，以终浓度为10mM的丙酮酸盐作为氨基受体，在反应混合物中于37℃转化15小时。

反应15小时后，使用TA7(S)ω-转化酶得到的光学活性的胺(R)-B3AP的光学纯度为62.5±0.5％，转化率为39.0±5％。

TA8(S)ω-转化酶在15小时的反应时间后得到的光学活性的胺(S)-B3AP的光学纯度为97.5±0.5％，转化率为47.6±5％。

很明显，获得的光学纯度较高或者甚至是很高，而且接近于理想的立体选择性酶的值。需要注意的是，对于TA7，光学纯度相对较低主要是由于转化率较低。

实施例2：酶解(R，S)-1-N-Boc-3-哌啶

对于酶解(R，S)-1-N-Boc-3-哌啶的消旋混合物，用丙酮酸(终浓度10mM)作为氨基受体；使用(S)ω-转化酶TA8于50mM的磷酸钠缓冲液中，pH7.5。在TA8酶浓度为2U/ml的条件下，于37℃反应72小时后，获得的光学活性的(R)-1-N-Boc-3-哌啶的光学纯度为70±5％，转化率为54±0.5％。在相同的反应条件下，使用20U/ml的TA8获得的光学活性的(R)-1-N-Boc-3-哌啶的光学纯度为98.5±0.5％，转化率为72±5％。

实施例3：通过消旋裂解制备光学活性的(R)-B3AP

230mg(0.85mmol)消旋(R，S)-B3AP，终浓度为10mM，用0.8U/ml的(S)ω-转化酶TA8处理。终浓度为10mM的丙酮酸用作氨基受体。反应在pH＝8的磷酸钾缓冲溶液中进行，反应温度37℃。过量的对映体通过气相色谱法检测。反应7小时反应后，获得的89.4mg光学活性(R)-B3AP的光学纯度为98.7±0.5％，得率为39±5％(0.33mmol)。

反应结束后，用5N的盐酸调节pH值到5。生成的B3OP4用二氯甲烷提取四次，每次75ml。薄板层析未在反应溶液中检测到B3OP。然后，用KOH调节pH值至13，用二氯甲烷提取3次，每次100ml。薄板层析只检测到一条B3AP的条带。合并含有B3OP和B3AP的有机相，用无水硫酸钠干燥，随后增溶剂被蒸发。然后进行¹H和¹³C核磁共振谱检测。

得到103.6mg作为酮产物的Boc-3-吡咯烷酮，转化率44±5％。另外还得到了胺产物丙氨酸。选择性地除去胺产物丙氨酸，例如用丙氨酸脱氢酶的反应，被证实是非常有用的，因为这使得生成的丙氨酸所引起的产物抑制最小化，随之而来的是，这也能使用更高浓度的胺作为起始反应物。使用丙酮的情况也是如此。

使用丙酮作为氨基受体可以提高转化率，丙酮在转化为胺产物异丙胺后，可以在减压条件下从反应产物中去除。

实施例4：河流弧菌(Vibrio fluvialis)转氨酶光学拆分1-N-苄基-3-氨基吡咯烷(Be3AP)的消旋混合物

在一个1.5ml的反应管中装入：

●10μl(R，S)-Be3AP溶液于DMSO中(终浓度5mM)

●20μl磷酸吡哆醛，10mM(终浓度0.2mM)

●100μl丙酮酸盐，100mM(终浓度10mM)

●830μl磷酸钠缓冲液，50mM，pH 8

加入40μl的河流弧菌(Vibrio fluvialis)转氨酶启动反应。对应的酶浓度为7U/ml。分别在反应开始后0分钟，10分钟，30分钟和60分钟取样。

反应的进程和光学纯度在表1中列出。

 

         时间[min]对映体(R)-Be3AP过量                   的百分比[％ee_R]                 Be3AP浓度[mM]          转化率[％]005010632.35430961.556960950.8583

[％ee_R]：(R)对映体过量的百分比。

数据显示，河流弧菌(Vibrio fluvialis)转氨酶对转化Be3AP有很高的活性。

实施例5：河流弧菌(Vibrio fluvialis)转氨酶光学拆分(R，S)-Cbz-3-氨基吡咯烷(C3AP)的消旋混合物

在一个1.5ml的反应管中装入：

●10μl(R，S)-C3AP溶液于DMSO中(终浓度5mM)

●20μl磷酸吡哆醛，10mM(终浓度0.2mM)

●100μl丙酮酸盐，100mM(终浓度10mM)

·830μl的磷酸钠缓冲溶液，50mM，pH 8

加入40μl的河流弧菌(Vibrio fluvialis)转氨酶启动反应。对应的酶浓度为7U/ml。分别在反应开始后0分钟，10分钟，30分钟和60分钟取样。

10分钟后即在样品中检测到(R)-C3AP对应体过量，(R)对映体过量的百分比为97.3％ee_R.30分钟后已检测不到(S)对映体。

实施例6：河流弧菌(Vibrio fluvialis)转氨酶光学拆分(R，S)-1-N-boc-3-氨基哌啶(B3APi)的消旋混合物

在一个1.5ml的反应管中装入：

●100μl(R，S)-B3APi盐酸溶液于水中(终浓度5mM)

●20μl磷酸吡哆醛，10mM(终浓度0.2mM)

●100μl的丙酮酸盐，pH 8，100mM(终浓度10mM)

●580μl的磷酸钠缓冲液，50mM，pH 8

加入200μl的河流弧菌(Vibrio fluvialis)转氨酶启动反应。对应的酶浓度为35U/ml。分别在反应开始后10分钟，30分钟，60分钟，2小时，4小时和18小时取样。

4小时后获得的对应体过量的百分比为96.3％eeS。转化率为55±5％。尽管需要使用大量的酶，但足以证明河流弧菌(Vibrio fluvialis)转氨酶可以用于光学拆分(R，S)-B3APi。