一种基于增强型绿色荧光蛋白基因缺失为筛选标记的克隆载体pGreen－S及其构建方法

摘要

本发明公开了一种基于增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因缺失为筛选标记的克隆载体pGreen－S及其构建方法，所述pGreen－S载体是将EGFP基因插入pUC18载体的Xba I酶切位点，其主要构件依次为复制起始序列－EGFP基因上游多克隆位点－EGFP基因序列－EGFP基因下游多克隆位点－lacZ基因序列－抗性选择基因序列。本发明pGreen－S载体可用于基因重组体的筛选，与lacZ的蓝/白斑筛选方法比较，筛选结果更为可靠，具有简便、经济、省时、高效的特点。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体的说是涉及一种基于增强型绿色荧光蛋白基因缺失为筛选标记的克隆载体pGreen-S及其构建方法。

背景技术

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)是分子生物学中最为常用的报告基因，如pUC系列即是lacZ插入失活型载体。其筛选原理是：载体含有lacZ操纵子的DNA区段及编码β-半乳糖苷酶N端146氨基酸的基因片段(α肽段)，其编码区中同时形成多克隆位点，且不影响读码框和基因功能。化学物质异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导该片段的合成。选择α肽段缺陷型宿主菌(自身能合成C端的其余肽段)，在IPTG存在时，载体与宿主菌的β-半乳糖苷酶基因实现互补(α互补)，生成具有活性的β-半乳糖苷酶，使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷(X-gal)分解成为蓝色化合物，表现为培养基上出现蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点时，使β-半乳糖苷酶N端片段的编码基因失活，不能形成α互补，则带有重组质粒的受体菌呈现白色菌落。人们可从菌落的颜色变化(蓝/白斑显色)来筛选重组体。

但是，实际应用中，这种方法存在的问题是，当插入的DNA片段(较小)不能破坏β-半乳糖苷酶的N端片段阅读框时，重组体菌落可表现出浅蓝色甚至蓝色，出现假阴性克隆，其误选率在30％左右。同时，蓝/白斑筛选方式有赖于诱导物IPTG及生色底物X-gal，以至使每个筛选平板增加1.5元左右的费用(以每平板加0.8mg IPTG与0.8mg X-gal计)。此外，筛选平板终止培养后需4℃静置过夜才能使颜色充分显现，因而延长了实验时间，降低了效率。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是从发光水母(AequoreaVictoria)分离的一种功能独特的天然荧光蛋白质。自1994年GFP克隆后，GFP及其突变体作为基因表达标记物或融合蛋白标记在动物、植物、微生物的研究中广泛应用。GFP荧光形成具有敏感、直观、即时的特点，且荧光的产生不需要加入任何外源底物、酶或其他辅助因子，因此GFP很适合作为基因重组体的筛选标记物。

已见报道的研究中[李寿东，齐义鹏，胡建红，林宏。生物工程学报，1997，13(3)：323-325；王进，李付广，李倩如，杜英。郑州大学学报医学版，2002，37(5)：621-624；董越梅，李久蒂，朱至清。植物学报，1999，41(5)：487-489]，基于GFP表达策略形成的载体存在明显不足：第一，外源基因插入位点均选择在GFP基因上游，其筛选策略是以插入基因是否导致GFP基因阅读框移码进而影响GFP的表达来筛选重组体，对插入基因序列要求严格，一旦不能满足要求则无法筛选重组体第二，改造后含GFP筛选标记的载体多克隆位点区域中，限制性内切酶位点较少，降低了基因重组的灵活性；因此，其实用性受到明显限制。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)基因缺失为筛选标记的克隆载体pGreen-S，使基因重组体的筛选结果更为简便可靠，筛选过程更为简便、经济、省时、高效。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述载体的主要构件是复制起始序列—EGFP基因上游多克隆位点—EGFP基因序列—EGFP基因下游多克隆位点—lacZ基因序列—抗性选择基因序列。

优选的方案是：所述的EGFP基因上游多克隆位点为EcoR I、Sac I、Kpn I、Sma I、Xma I、BamHI及Xba I酶切位点。

更为优选的方案是：所述的EGFP基因下游多克隆位点为Xba I、Sal I、PstI、SpnI及Hind III酶切位点。

更为优选的方案是：所述的抗性选择基因序列为Amp^r基因序列。

更为优选的方案是：一种宿主细胞，含有上述任一方案所述的克隆载体。

本发明的另一目的在于提供一种基于增强型绿色荧光蛋白基因缺失为筛选标记克隆载体pGreen-S的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于增强型绿色荧光蛋白基因缺失为筛选标记的克隆载体pGreen-S的构建方法，包括如下步骤：

A)设计扩增引物，以质粒pEGFP-N1为模板进行PCR扩增EGFP基因；

B)将pUC18质粒经Xba I酶切线性化后，与经Xba I酶切的PCR扩增的EGFP基因片段按照分子生物学方法连接并转化感受态E.coli DH5α，涂布于X-gal、IPTG的LB平板，氨苄浓度70μg·mL^-1，37℃培养12h；

C)挑取白色及绿色菌落转接于LB液体培养基摇瓶37℃过夜培养，氨苄青霉素浓度70μg·mL^-1，小量提取质粒作Xba I酶切验证、基因测序。

优选的方案是：所述的扩增引物为：

上游引物：5′-GCACTCTAGATATGGTGAGCAAGGGCG-3′；

下游引物：5′-GCTATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA-3′；

上游引物及下游引物中分别含有Xba I酶切位点。

本发明pGreen-S载体的主要特征是：

第一，pGreen-S的EGFP基因在P_lac启动子的调控下过量表达，含有pGreen-S的大肠杆菌菌落，在自然光下即可显现为清晰的绿色，长波紫外灯下显现更为明亮的绿色，无需显色过程；

第二，pGreen-S是以EGFP的绿色荧光缺失方式筛选重组体，其绿色荧光消失是EGFP基因的缺失引起，而不是EGFP基因不表达；在基因操作时，以相应的内切酶切除EGFP基因，重组体因EGFP基因的缺失而使含有重组质粒的菌落显现白色，目测颜色对比明显，因而使实验结果的判定更加直观，如果借助实验室常备的紫外光观测及成像设备则观察和采集数据更加清晰便捷；

第三，pGreen-S含有两组多克隆位点，即EGFP基因上游的多克隆位点1(MCS1)：EcoR I、Sac I、Kpn I、Sma I、Xma I、BamHI及Xba I位点；又保留了位于EGFP基因下游的多克隆位点2(MCS2)：Xba I、Sal I、Pst I、SpnI及Hind III酶切位点，实际操作中，实验者可以在上述两组MCS中分别选择一个酶切位点进行组合，因此大大增加了外源基因定向克隆策略的灵活性；

第四，pGreen-S是以EGFP的绿色荧光缺失为标记筛选重组体，该筛选方法摒弃了lacZ策略中对X-gal、IPTG的依赖，同时EGFP的即时显色效能也大大缩短了实验时间，使得重组体的筛选工作更为经济高效；

第五，pGreen-S保留了lacZ基因，在绿/白斑筛选重组体的同时，仍可以用蓝/白斑筛选作为备选方法，使实验手段和策略的选择方案增加，能给实验者带来选择的便利。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明：

附图说明

图1为本发明pGreen-S载体结构示意图；

图2为本发明实施例中利用pGreen-S载体筛选重组体图；

图3为本发明实施例中利用本发明pGreen-S载体进行重组体筛选示意图。

具体实施方式

实施例：一种利用增强型绿色荧光蛋白的绿色荧光缺失为标记筛选重组体的克隆载体pGreen-S，是将增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescentprotein，EGFP)正向插入pUC18载体的Xba I酶切位点所得。pGreen-S载体构建过程如下：

1、pGreen-S载体的构建

根据EGFP基因序列，设计一对上下游引物，以质粒pEGFP-N1(Clontech)为模板PCR扩增EGFP基因。引物如下：

上游引物：5′-GCACTCTAGATATGGTGAGCAAGGGCG-3′

下游引物：5′-GCTATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA-3′

上游引物及下游引物中均含有Xba I限制性内切酶位点。

扩增得到0.73kb基因片段，经Xba I酶切后，与同样酶切的pUC18质粒在T4DNA连接酶作用下连接，构建pGreen-S载体。

2：pGreen-S载体的鉴定

基因连接产物转化感受态E.coli DH5α，涂布于X-gal、IPTG的LB(氨苄青霉素浓度70μg·mL^-1)平板，37℃培养12～17h，挑取白色及绿色菌落转接于LB(氨苄青霉素浓度70μg·mL^-1)液体培养基37℃震荡培养过夜，小量提取质粒进行Xba I限制性酶谱分析。结果表明这两种菌落均含有插入片段，但插入基因的方向不同。DNA序列分析表明白色菌落为EGFP基因反向插入的菌落，绿色菌落为EGFP基因正向插入菌落，将EGFP基因正向插入的质粒命名为pGreen-S载体，其质粒图谱及多克隆位点如图1所示。

3：pGreen-S载体筛选功能的验证

为说明本发明pGreen-S载体筛选重组体功能，我们选取选取葡萄球菌蛋白A的ZZ肽基因(0.35kb)在pGreen-S载体MCS1的EcoR I酶切位点和MCS2的Pst I酶切位点双酶切插入。

一、ZZ肽基因引物及扩增：

上游引物：5′-AAAGAATTCATGGTAGACAACAAATTCAAC-3′，含有EcoRI酶切位点；下游引物：5′-AAACTGCAGTTCGGCGCCTGAGCATC-3′，含有PstI酶切位点。

以质粒pEZZ18(Amersham)为模板，PCR方式扩增ZZ肽基因。

二、ZZ肽基因重组体的构建：

0.35kb的目的基因扩增片段经EcoR I/Pst I双酶切后，克隆至pGreen-S质粒的EcoR I/Pst I酶切位点，连接产物转化感受态E.coli DH5α，涂布LB(氨苄青霉素浓度70μg·mL^-1)平板，37℃培养12～17h。

三、基因重组体的筛选：

LB平板上出现两种颜色菌落：白色菌落和绿色菌落。随机挑选白色菌落及绿色菌落转接于LB液体培养基37℃震荡培养过夜。小量提取质粒进行EcoR I和Pst I双酶切验证，白色菌落为重组子，绿色菌落为非重组子(未插入目的基因的pGreen-S)。如图2所示，左图为菌落自然光下观察，白色菌落为含有重组体的E.coli DH5α菌落；绿色菌落为含有pGreen-S(非重组体)的E.coli DH5α菌落；右图为菌落365nm紫外光下观察，绿色菌落为含有pGreen-S(非重组体)的E.coli DH5α菌落；

通过本实验可以说明，pGreen-S载体可以利用EGFP的荧光特性筛选出插入外源基因的重组体，只需在MSC1、MCS2之间灵活组合能切除EGFP基因的内切酶位点，均可以利用本发明的pGreen-S载体进行重组体筛选。其筛选策略如图3所示，其中：内切酶a为MCS1中任一内切酶；内切酶b为MCS2中任一内切酶。

上述实施例中，EGFP基因还可以在pUC18质粒其它内切酶位点插入，达到实施例构建筛选载体的目的。

上述实施例中，EGFP基因还可以插入pUC19质粒的多克隆位点，达到实施例构建筛选载体的目的。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。