具有促胰岛素活性的生物活性多肽的制备方法

摘要

本发明涉及制备具有促胰岛素活性的生物活性多肽的方法，所述方法包括下列步骤：(a)以编码所述多肽的多核苷酸载体转化经遗传修饰的宿主细胞，所述细胞的蛋白酶基因已被敲除；和(b)培养所述转化的宿主细胞以制备所述生物活性多肽。本发明还涉及制备具有促胰岛素活性的生物活性多肽的方法，所述多肽具有N－末端识别位点His－Gly，所述方法包括下列步骤：(a)以编码所述多肽的多核苷酸载体转化经遗传修饰的毕赤酵母，所述毕赤酵母的蛋白酶基因STE13已被敲除；和(b)培养所述转化的毕赤酵母以制备所述生物活性多肽。

说明书

技术领域

本发明提供了一种体系，该体系通过克隆天然肽或基因工程形式的肽并在遗传修饰的微生物(如酵母)中表达而制备促胰岛素肽(例如Exendin-4)，其中氨基肽酶基因被破坏从而能够有效表达全长的蛋白或多肽。

背景技术

Exendin是降低血糖水平并与GLP-1具有部分序列相似性(53％)的一系列肽(Goke等，1993 J.Biol.Chem.268；19650-19655；以参考方式引入本文)。在大毒蜥(Gila Monster)(希拉毒蜥(Heloderma suspectum)；Raufman 1996 Reg.Peptides，61；1-18；以参考方式引入本文)和墨西哥连珠蜥蜴(Mexican beadedlizard)的毒液中发现了exendin。在大毒蜥的毒液中发现的Exendin-4尤其受关注。Exendin-4前体是包括信号和前序列(prosequence)的87个氨基酸的多肽(Sequence ID No：1)。对其进行加工以得到酰胺化的39个氨基酸的Exendin-4(Sequence ID No：2)。公开的PCT国际专利申请WO98/35033(以参考方式将其内容引入本文)公开了编码proexendin肽(包括exendin和其它新型肽)的cDNA、它的分离、以及特异性识别这种肽的抗体(Poh1等，1998，J.Biol.Chem.273；9778-9784；以参考方式引入本文)。Exendin-4已经显示出在分离的大鼠胰岛素瘤细胞中是GLP-1受体的强激动剂。与GLP-1相比其还具有更长的生物半衰期(Young等1999 Diabetes 48；1026-1034；以参考方式引入本文)。这是可以预期的，因为活性GLP-1((Sequence ID No：3)中被DPP-IV识别的His-Ala结构域不存在于Exendin-4中，而是以序列His-Gly替代。

系统性给予的Exendin-4能降低糖尿病db/db小鼠的血糖水平40％(WO99/07404；以参考方式引入本文)。Eng的美国专利5,424,286(以参考方式将其内容引入本文)公开了N-末端序列的相当一部分对于保留促胰岛素活性是必需的。

肽序列中的氨基酸残基数目对通过固相合成化学制备多肽的生产成本有显著影响。制备50肽(50-mer peptide)的成本比10肽的成本高至少5倍。固相肽合成还需要使用诸如TFS和氢氟酸等腐蚀性溶剂，需要以许多合成步骤来制备肽，并且需要后续的肽纯化。因此，需要一种对用于制备大量具有生物活性的Exendin-4和其它促胰岛素肽的高效并节省成本的方法。

在毕赤酵母或其它微生物中表达重组蛋白或多肽并不总是能够成功制备全长多肽。通常，异源重组多肽/蛋白在细胞内受到蛋白酶的切割/降解。考虑到蛋白的结构和存在于细胞中的蛋白酶的多重性，在许多情况中被蛋白酶识别或靶向的氨基酸序列的特异性是未确定的并且未被发布。因此本领域的技术人员未必总是可能推测哪种蛋白酶负责切割/降解特定的重组多肽/蛋白。例如，已有报道在毕赤酵母中表达鼠或人内皮抑素(endostatin)会得到缺失C-末端赖氨酸的产物(Folkman等，1999 May；15(7)：563-72)。当酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的KEX-1基因的毕赤酵母同源物被破坏时，毕赤酵母宿主可将全长的内皮抑素分泌到培养基中。在另一项研究中，有报道在毕赤酵母中KEX-2而非YPS-1基因的缺失可制得哺乳动物明胶，其在蛋白的单精氨酰位点(monoarginylic site)被切割(Werten和de Wolf，Applied andEnvironmental Microbiology，2005 May；71(5)：2310-7)。

本发明证明：通过使酿酒酵母STE13基因的毕赤酵母同源物中断，可阻止在N-末端具有氨基酸HG(His-Gly)的蛋白/多肽的体内蛋白水解切割。非常明确的是，已经显示通过使酿酒酵母STE13基因的毕赤酵母同源物中断，解决了与甘氨酸-延长的Exendin-4(GlyExendin-4，具有C-末端甘氨酸的Exendin-4前体)的蛋白水解切割相关的问题。

GLYEXENDIN-4

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSG(Sequence IDNo：4)

发明内容

发明目的：

本发明的主要目的是制备生物活性多肽。

本发明的另一主要目的是制备促胰岛素肽Exendin-4。

本发明的又一目的是开发促胰岛素肽的制备方法。

本发明的又一目的是开发从毕赤酵母宿主细胞表达全长多肽的方法。

本发明的又一目的是开发使促胰岛素肽酰胺化的方法。

发明陈述

本发明涉及制备具有促胰岛素活性的生物活性多肽的方法，该方法包括下列步骤：(a)以编码多肽的多核苷酸载体转化经遗传修饰的宿主细胞，所述宿主细胞的蛋白酶基因已被敲除；和(b)培养转化的宿主细胞以制备生物活性多肽；本发明还涉及制备具有促胰岛素活性的生物活性多肽的方法，所述多肽具有N-末端识别位点His-Gly，该方法包括下列步骤：(a)以编码多肽的多核苷酸载体转化经遗传修饰的毕赤酵母(Pichiapastoris)，所述毕赤酵母的蛋白酶基因STE13已被敲除；和(b)培养转化的毕赤酵母以制备生物活性多肽。

发明详述

本发明涉及制备具有促胰岛素活性的生物活性多肽的方法，该方法包括下列步骤：

a.以编码该多肽的多核苷酸载体转化经遗传修饰的宿主细胞，所述细胞的蛋白酶基因已被敲除；和

b.培养该转化的宿主细胞以制备所述生物活性多肽。

在本发明的另一实施方式中，该方法还包括分离以及随后将所分离的多肽α-酰胺化的步骤。

在本发明的又一实施方式中，所述宿主细胞是酵母细胞。

在本发明的又一实施方式中，所述酵母细胞是毕赤酵母。

在本发明的又一实施方式中，所述蛋白酶基因是STE13基因。

在本发明的又一实施方式中，所述蛋白酶基因是N-末端二肽酰肽酶基因。

在本发明的又一实施方式中，所述方法涉及在诱导所述多肽表达的条件下培养转化细胞。

本发明还涉及制备具有促胰岛素活性的生物活性多肽的方法，所述多肽具有N-末端识别位点His-Gly，该方法包括下列步骤：

a.以编码所述多肽的多核苷酸载体转化经遗传修饰的毕赤酵母，所述毕赤酵母的蛋白酶基因STE13已被敲除；和

b.培养该转化的毕赤酵母以制备所述生物活性多肽。

在本发明的另一实施方式中，所述多肽是SEQ ID No4的Glyexendin-4。

在本发明的另一实施方式中，所述Glyexendin-4具有相应的SEQ ID No5的多核苷酸序列。

在本发明的另一实施方式中，所述方法涉及使所述Glyexendin-4多肽与C-末端α-酰胺化酶接触从而产生α-酰胺化的exendin-4多肽。

在本发明的另一实施方式中，所述α-酰胺化的exendin-4多肽是HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2。

附图说明

图1.在毕赤酵母中表达GlyExendin-4的框架(construct)。

图2.显示GlyExendin-4-N和N-2(即N-末端经切割的GlyExendin-4)两个峰的HPLC色谱图。

图3.将NdeI限制性位点引入经PCR从毕赤酵母基因组扩增的STE1基因片段的策略。

图4.使酿酒酵母STE13基因的毕赤酵母同源物的基因组拷贝缺失的框架。

图5.假定缺失菌株的PCR分析。从克隆D2、D4、D6、D8、D10、D12(泳道2-泳道7)和GS115(泳道1)的基因组DNA扩增的PCR产物。

图6.显示源于STE13基因已缺失的毕赤酵母宿主的全长GlyExendin-4的HPLC色谱图。

图7.显示源于DAP2已缺失的毕赤酵母宿主的N-2杂质的HPLC色谱图。

图8.STE13已缺失的毕赤酵母的培养上清液的ESI-TOF分析，显示了GlyExendin-4的质量。

图9.GlyExendin-4的胰蛋白酶解图谱。

具体实施方式

本发明提供了通过在微生物中高效表达异源基因而制备促胰岛素肽的体系。这一体系可用于诸如GlyExendin-4等肽前体的大规模重组体的制备。该体系提供了不采取固相肽合成而制备大量生物活性肽的途径。使用该创造性体系所生产的肽可用于配制药物组合物。所述肽及其组合物可以用于治疗糖尿病、降低胃蠕动、延迟胃排空、防止高血糖症以及降低食欲和食物摄取。

通过在微生物中表达异源基因而制备促胰岛素肽时，使优选作为载体的一部分的肽的编码多核苷酸序列转化进入微生物。编码促胰岛素肽的基因的表达受启动子(例如诱导型启动子或组成型启动子)控制。优选的是，所述启动子是强启动子，更优选是强诱导型启动子，这是考虑到促胰岛素肽的大量制备。以该基因转化的细胞可以是真菌的(例如酵母(例如，酿酒酵母、毕赤酵母))。为了在毕赤酵母中表达，用于驱动基因表达的启动子优选是AUG1启动子、GAP启动子(强组成型启动子)、或者AOX1或AOX2启动子(强诱导型启动子)；并且载体可以来源于已知的或者市售的载体，例如pPIC、pPIC3K、pPIC9K或pHIL-D。为了在酿酒酵母中表达，所用的启动子可以是CUPI启动子、ADH启动子、TEF1启动子或GAL启动子。为了在特定生物中表达可以对编码被表达的促胰岛素肽的多核苷酸序列优化(例如，为在宿主微生物中使用可以优化密码子的使用)。多核苷酸序列可以选择性地含有前导序列、信号序列、前肽(pre-peptide)序列/前导肽(pro-peptide)序列、加工标签、检测或纯化标签、融合肽等。在某些实施方式中，该基因编码信号肽。信号肽可以指导肽的加工或者分泌。在某些实施方式中，信号肽是Exendin-4的信号肽或Matα因子的信号肽。在某些实施方式中，基因编码前导肽，并且该前导肽包括天然的Exendin-4前导肽或Matα因子的前导肽(见WO 98/35033；Pohl等，J.Biol.Chem.273：9778-9784，1998；其中每一个以参考方式引入本文)。

选择存在载体的(例如，抗生素抗性、在不含特定营养的培养基上生长的能力)和/或表达编码促胰岛素肽的外源基因的转化的宿主细胞。经选择的细胞随后在适合编码所述肽的基因的表达的条件下培养。在某些实施方式中，在其中培养细胞的培养基包括例如甲醇等试剂，其诱导编码所述肽的基因的表达。在其它实施方式中，使用组成型启动子时，诱导外源基因表达的试剂不是必需的。转化的宿主细胞产生肽。优选的是，肽被宿主细胞正确加工。也就是，肽被正确折叠并翻译后修饰。在某些实施方式中，肽被分泌到生长培养基中。重组制得的肽随后从宿主细胞或从培养基(如果肽已被分泌)中分离并纯化。经纯化的肽可以被进一步化学修饰或酶法修饰(例如，α-酰胺化、切割)。

在一个方面中，制得促胰岛素肽GlyExendin-4。毕赤酵母中的GlyExendin-4涉及制备表达框架，所述表达框架包括信号序列、前导肽、前肽和/或标签，其后串联跟随40个氨基酸的GlyExendin-4序列。在某些实施方式中，信号序列包含天然Exendin-4的23个氨基酸的信号序列或者α-因子的19个氨基酸的信号序列。前导肽包含天然GlyExendin-4的24个氨基酸的前导肽或者α-因子的66个氨基酸的前导肽。标签可以辅助肽的加工(Kjeldsen等Biotechnol.Appl.Biochem.29：79-86，1999；以参考方式引入本文)。在某些实施方式中，标签带有诸如实施例6描述的EAEA间隔区等带电氨基酸序列。制备了经毕赤酵母密码子优化的编码GlyExendin-4的核苷酸序列，可选地带有信号肽或前导肽。随后将合成的核苷酸序列克隆进入携带选择性标记基因的适当载体，例如pPIC、pPIC3K、pPIC9K或pHIL-D。将载体转化进入毕赤酵母细胞，并且选择携带载体的转化细胞。以足够大的规模发酵所选出的克隆以产生所需量的GlyExendin-4肽。与在细菌体系中所产生的肽不同，这样产生到培养基中的GlyExendin-4肽不需要进一步的加工步骤就使其成为功能完善的肽(EP 978565 Ohsuye等Suntorylimited；以参考方式引入本文)。使用本领域已知的蛋白质纯化技术从培养基中纯化肽。GlyExendin-4肽优选不被毕赤酵母宿主细胞糖基化。未被糖基化也是一项优势，这是因为GlyExendin-4是功能完善的并且其可使纯化步骤更简单和更方便，并获得改善的肽产量。纯化的GlyExendin-4肽可进一步化学修饰或酶法修饰(例如，C-末端α-酰胺化)。GlyExendin-4肽可用在用于对对象(例如人)给药的药物组合物中。

在毕赤酵母中制备GlyExendin-4多肽的过程中遇到了问题。发现所分泌的多肽是全长分子和N-末端经剪切的分子(缺少头两个氨基酸HG)的混合物。通过敲除酿酒酵母STE13基因的毕赤酵母同源物可提高全长Exendin的产量，所述STE13基因编码二肽酰肽酶。这一研究也首次显示出STE13毕赤酵母同源物的新奇识别位点；其还可在N-末端二肽序列“HG”之后切割。

定义

“肽”或者“蛋白质”：根据本发明，“肽”或者“蛋白质”包含以肽键连接到一起的一串至少三个氨基酸。术语“蛋白质”和“肽”可以互换使用。本发明的肽优选只含有天然氨基酸，虽然可以选择性使用本领域中已知的非天然氨基酸(即，非天然存在的但可被引入多肽链的化合物)和/或氨基酸类似物。另外，可以修饰本发明的肽中的一种或多种氨基酸，例如，通过加入诸如糖类基团、磷酸基团、法呢基团、异法呢基团、脂肪酸基团、用于结合的连接体等化学个体、功能化或其它修饰(例如α-酰胺化)等。在优选的实施方式中，肽的修饰得到更稳定的肽(例如在体内更长的半衰期)。这些修饰可以包括肽的环化、D-氨基酸的引入等。修饰实质上不应干扰肽的所需生物活性。在某些实施方式中，肽的修饰得到更具生物活性的肽。

“转化”：本文所用的术语“转化”是指将含有核酸序列的载体引入宿主细胞。载体可以将自身或自身的一部分整合进入细胞的染色体，或者载体可以作为可自我复制的染色体外载体存在。在一些实施方式中整合被认为是有利的，这是由于核酸更可能稳定的保存在宿主细胞中。在其它实施方式中，染色体外载体是理想的，这是由于每一宿主细胞可含有载体的多个拷贝。

本发明提供了用于重组生产促胰岛素肽的体系，并且在制备大量的用在药物组合物中或用于研究目的的生物活性肽时尤其有用。本发明提供了制备用于生产肽的多核苷酸和重组细胞的方法以及重组生产肽本身的方法。本发明还包括用于实践本发明的方法的多核苷酸序列、载体和细胞，以及使用重组生产的肽的药物组合物和方法。

如上所述，促胰岛素肽在宿主微生物中的重组表达涉及制备带有肽编码序列的多核苷酸、将这一序列引入载体、使用载体转化微生物细胞、和选择带有载体的细胞。随后在适合生产促胰岛素肽的条件下培养这些被选择出的细胞，从细胞或从细胞在其中生长的培养基纯化所述促胰岛素肽。随后将经纯化的肽用于药物组合物中以治疗如糖尿病或肥胖症等疾病。

从发酵物收获肽后，将肽纯化。肽可以从细胞纯化，或者如果肽是被分泌的，则肽可以从培养基纯化。如果从细胞纯化肽，将细胞裂解，然后从细胞裂解物中纯化肽。可以使用任何本领域已知的方法纯化肽，所述方法包括硫酸铵沉淀、柱层析(例如，离子交换层析、体积排阻层析、亲和层析)、FPLC、HPLC(例如反相、正相)等。将肽纯化至所需的纯度水平。在某些实施方式中，最终的肽为大于90纯度％、95纯度％、98纯度％、或99纯度％，优选大于98纯度％。

经纯化的肽可以直接使用，或者可以进一步修饰肽。在某些实施方式中，以蛋白酶处理肽以切割肽。在其它实施方式中，肽被磷酸化。在另一些实施方式中，肽被糖基化。肽可以被α-酰胺化。可以对肽进行其它修饰。可以对肽进行化学修饰或酶法修饰。

在毕赤酵母中生产GlyExendin-4

重组GlyExendin-4在毕赤酵母中的生产涉及制备表达框架，所述表达框架含有信号序列、可选的前导肽或标签，其后串联有40个氨基酸的GlyExendin-4序列。信号序列包括天然Exendin-4的23个氨基酸的信号序列或者α-因子的19个氨基酸的信号序列。前导肽包含天然Exendin-4的24个氨基酸的前导肽或者α-因子的66个氨基酸的前导肽。

设计合成的、经毕赤酵母密码子优化的GlyExendin-4编码序列(CDS)，并且制备该序列的重叠寡核苷酸。将寡核苷酸磷酸化、退火并连接。进行PCR以扩增CDS，将CDS克隆进入携带有选择性标记基因的适当载体的限制性位点。载体选自pPIC、pPIC3K、pPIC9K或pHIL-D。这些载体含有AOX启动子以驱动GlyExendin-4基因的表达。将携带合成的GlyExendin-4cDNA的载体转化进入毕赤酵母细胞，并且将转化的细胞涂布在基本培养基上。

将转化的毕赤酵母细胞涂布在含有选择试剂的培养基上从而确定多拷贝整合体并选择阳性克隆。以阳性克隆完成发酵，并使用层析技术的组合从无毕赤酵母细胞的上清液中纯化GlyExendin-4肽，所述层析技术包括离子交换、疏水、凝胶过滤和/或亲合层析。在某些实施方式中，由毕赤酵母细胞所生产的GlyExendin-4肽是完全未被糖基化的产物。

在表达GlyExendin-4的过程中观察到其降解的部分产物作为杂质出现。通过质谱分析确定这些杂质是GlyExendin-4在N-末端被剪切2、6或8个氨基酸的形式。(N-2)GlyExendin-4对全长GlyExendin-4的比例约为1：1。发现其它形式的量很低并且随着发酵进行而积累。这一问题通过使毕赤酵母中编码酿酒酵母STE13的同源物的基因缺失而得到解决。

GlyExendin-4的纯化和修饰

如下所示从培养基分离和纯化重组肽或具有GlyExendin-4多肽序列的肽结合物：将培养基与宿主细胞分离，或者如果肽产生于细胞内，则在细胞裂解后分离细胞碎片。随后使用盐或溶剂将肽沉淀并且进行例如离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析等多种层析步骤，和/或结晶。

GlyExendin-4肽具有40个氨基酸。可选的是，第39个氨基酸丝氨酸被酰胺化。在体外对40个氨基酸的肽酰胺化以产生C-末端氨基酸酰胺化的39个氨基酸的GlyExendin-4肽，也就是，C-末端的甘氨酸被移去并且倒数第二位的丝氨酸被酰胺化。在某些实施方式中，使用C-末端α-酰胺化酶完成酰胺化。

通过其在大鼠胰岛素瘤细胞系中诱导胰岛素分泌的能力而确定GlyExendin-4和39氨基酸酰胺化变体的生物学活性。

将借助于下列实施例进一步详细阐述本申请的技术。然而，不应将这些实施例理解为是对本发明的范围的限制。

实施例1：经密码子优化的GlyExendin-4 CDS的合成

通过聚合酶链式反应(PCR)使用重叠寡核苷酸合成经密码子优化的编码GlyExendin-4的核苷酸序列(Sequence ID No：5)。合成10个寡核苷酸以沿两条链覆盖GlyExendin-4基因，该基因与相邻引物(successive primers)有14bp重叠区域。在含有10×PNK缓冲液、T4多核苷酸激酶和dATP的反应混合物中将重叠寡核苷酸磷酸化。将等摩尔量的磷酸化的寡核苷酸退火并且随后使用T4DNA连接酶连接。

连接混合物用作模板以通过PCR使用寡核苷酸扩增GlyExendin-4CDS，所述寡核苷酸为5′-CTC GAG AAA AGA CAT GGA GAA GGA ACATTT ACA TC-3′(Sequence ID No：6)(正向引物)和5′-GAA TTC TTA TCCAGA TGG TGG-3′(Sequence ID No：7)(反向引物)。依照标准方案进行PCR反应，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)在50μL终体积中进行扩增。扩增条件包括：在Perkin-Elmer热循环仪中，于94℃起始变性4分钟的1个循环，随后30个循环(于94℃变性30秒；于60℃退火30秒；于72℃延伸60秒)以及最终延伸10分钟的一个循环。

实施例2：将经密码子优化的GlyExendin-4克隆进测序载体中

使用TA克隆试剂盒(Fermentas)在反应混合物中将扩增后获得的140bp的PCR片段克隆进入载体pTZ57RT/A中，所述反应混合物含有3μl载体、2μl PEG4000 PCR缓冲液和1μl T4DNA连接酶。转化DH5α感受态细胞，并通过限制性消化筛选含有GlyExendin-4基因片段的阳性克隆。对1个阳性克隆的两条链测序。

实施例3：将GlyExendin-4 CDS亚克隆进入表达载体

使用EcoRI和XhoI将GlyExendin-4片段从TA克隆(见实施例2)切离并亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K(Invitrogen，San Diego，CA)的相同位点。这将GlyExendin-4核苷酸序列置于具有酿酒酵母的Mat α信号肽的框架中并且处于甲醇可诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子的控制下(图1)。如invitrogen手册中所描述的，通过电穿孔将表达载体转化进入毕赤酵母。

实施例4：GlyExendin-4在毕赤酵母宿主中的表达

转化

如Invitrogen手册中所描述，通过电穿孔将表达质粒引入毕赤酵母菌株GS115(his4.Mut⁺)，所述质粒具有毕赤酵母密码子优化的核苷酸插入片段。用于电穿孔的条件是充电电压1.5kV、电容25μF和电阻200Ω。将转化细胞涂布在缺乏组氨酸的基本培养基(YNBD)上并于30℃温育3天。

多拷贝整合体的筛选

选取转化体的单菌落并在含有YPD(1％酵母提取物、2％细菌蛋白胨(Baco-Peptone)、2％右旋葡萄糖)的微量滴定板(microtiter plate)中于30℃培养过夜。将预培养的培养物再次涂布在含遗传霉素(Geneticin)(2mg/ml)的YPD琼脂平板上并于30℃温育。选择在YPD-遗传霉素(2mg/ml)平板上生长的克隆以进行表达研究。

GlyExendin-4的小规模诱导

使用下列方案诱导GlyExendin-4表达：

将在琼脂平板(YEPD)上生长的培养物接种于250ml烧瓶中的YNBG(酵母氮源甘油Yeast Nitrogen Base Glycerol)培养基-50ml中

YNBG成分(用于100ml)

不含氨基酸的酵母氮源(Yeast Nitrogen Base，YNB)：90ml中1.34g

甘油：20％10ml

在YNBG培养基中过夜生长。转入BYYG(50ml于250ml中)以使起始OD为0.3。

BYYG成分(用于100ml)

细菌蛋白胨(Bactopeptone) ：1g

酵母提取物               ：2g

不含aa的YNB              ：1.34g

甘油                     ：20％10ml

1M KH₂PO₄，pH6            ：10ml

培养2天。离心，称重沉淀并在诱导培养基(BYYM)中重悬。

3g沉淀于6ml培养基中并转入100ml烧瓶。

诱导培养基成分(用于100ml)

细菌蛋白胨(Bactopeptone)：1g

酵母提取物              ：2g

不含aa的YNB             ：1.34g

甲醇                    ：3ml

1M KH₂PO₄，pH6          ：10ml

每天投入甲醇和氮(连续2天)并在第三天收集。

氮：120μl的5×yp(0.1×yp)

甲醇：180μl的100％甲醇(3％)

5×YP成分(用于50ml)

酵母提取物：2.5g

细菌蛋白胨(Bactopeptone)：5g

通过离心沉淀经诱导的细胞并通过tricine(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine，N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)凝胶电泳和HPLC分析无细胞上清液中的GlyExendin-4。虽然在凝胶上观察到预期大小的单一条带，但通过HPLC可分辨出GlyExendin-4的两个峰(图2)。通过质量分析对这两个峰进行分析并发现这两个峰对应于GlyExendin-4的全长形式和N-末端剪切(无N-末端氨基酸HG；(N-2))的形式。

实施例5：使用间隔区序列在毕赤酵母中克隆GlyExendin-4

将经密码子优化的编码GlyExendin-4的核苷酸序列与在其N-末端编码EAEA的间隔区序列串联克隆进毕赤酵母载体pPIC9K。将携带插入片段的表达载体转化进入毕赤酵母。多肽一经表达，以Lys-Arg结尾的Mat-α通过KEX2蛋白酶的作用被从该肽切离，同时间隔区肽被STE13蛋白酶切离，从而释放GlyExendin-4。使用这一框架所表达的GlyExendin-4的分析无助于消除或减少(N-2)GlyExendin-4的比例。

实施例6：在生产GlyExendin-4的毕赤酵母克隆中使酿酒酵母STE13基因的毕赤酵母同源物缺失

两个氨基酸从GlyExendin-4的N-末端移除表明二肽酰肽酶的活性。处理两种二肽酰肽酶DAP2和STE13的毕赤酵母同源物以试图消除(N-2)杂质。

通过插入失活在毕赤酵母中使酿酒酵母的二肽酰肽酶基因同源物(STE13)缺失。使用BLASTP确定酿酒酵母STE13基因(其编码反式高尔基体二肽酰肽酶)的假定毕赤酵母同源物。毕赤酵母STE13核苷酸序列由JamesCregg教授提供。预计破坏该酶催化结构域的～450bp区域被选取并通过PCR从毕赤酵母菌株GS115的基因组DNA中扩增。该片段随后被克隆进合适的载体，在同源区内线性化并转化进入生产GlyExendin-4的毕赤酵母菌株中以实现缺失。在含有100μg/ml Zeocin的YEPD/1M山梨糖醇平板上进行选择。将大约900个这些转化体接种于96孔板中的YEPD。过夜培养后将其再次涂布于YEPD平板并通过平板测定的方法筛选STE13的缺失。由测定确定的假定缺失菌株通过PCR筛选以验证基因座是否被破坏。确认STE13基因座被破坏的克隆被用来进行进一步分析。

STE13缺失载体的构建

Sequence ID No：8中给出了STE13 CDS的编码序列和被选取以提供靶向同源性的片段。在两步PCR步骤中组装STE13片段(图3)。第一步PCR使用下列引物对以Taq聚合酶(Bangalore Genei，India)进行：IISTEFP1/IISTERP1(PCR1；Sequence ID No：9、10)和IISTEFP2/IISTERP2(PCR2；Sequence ID No：11、12)。PCR循环参数：于94℃进行起始变性4分钟，随后进行于94℃变性30秒、于60℃退火30秒并于72℃延伸30秒的30个循环；于72℃进行最终延伸10分钟。GS115的基因组DNA用做用于该PCR的模板。引物在片段的近似中心引入限制性位点(NdeI)。这为在同源区域内将框架线性化提供了限制性位点。第二步PCR是使用XT Taq聚合酶(Bangalore Genei，India)进行的重叠PCR，通过将两个扩增出的片段作为模板从而产生450bp片段。重叠PCR所用的引物：IISTEFP1/IISTERP2。PCR循环参数：与PCR1相同，但修改为在起始变性步骤之后包括于94℃变性45秒、于37℃退火45秒并于72℃延伸30秒的3个循环，从而促进重叠。还在片段的5′端和3′端引入限制性位点从而有利于克隆。450bp片段首先被克隆进入pTZ57R-TA载体(Fermentas，Canada)并通过测序鉴定。随后将其在BamHI/BglII位点亚克隆到pPICZA(Invitrogen，USA)从而得到Stefrg/pPICZA(图4)。在以NdeI将Stefrg/pPICZA线性化后，通过电穿孔将框架转化进入生产GlyExendin-4的毕赤酵母菌株(此前在实施例4中对方法已有描述)。

平板测定

该测定此前对酿酒酵母已有描述(Rendueles和Wolf，(1987)J.Bacteriol.，169(9)：4041-4048)。简单而言，通过以氯仿淹覆平板首先裂解菌落。在氯仿彻底挥发后，将在1％Tris琼脂中的底物、Ala-Pro-4MβNA和快速石榴子石GBC(Fast garnet GBC)的混合物倾倒以形成覆盖物。将其于室温温育约10分钟～15分钟。选取未染红的菌落作为STE13缺失菌株。将有完整STE13的GS115包括进来作为对照以检验染色进程。

PCR分析

从那些在平板测定中选取为阳性的转化体分离基因组DNA，并通过PCR确认STE13基因座的缺失。设计同源区域上游的正向引物和来自载体序列的反向引物从而可在缺失菌株中观察到～800bp的扩增。未被破坏的基因座将不显示任何扩增。在以PCR分析获得的阳性中(图5)，选取克隆D2以进行进一步分析。

以甲醇诱导(如实施例4中所描述的方法)克隆D2，以HPLC和LCMS检验时被表达的GlyExendin-4在N-末端未被剪切。这清楚地表明STE13二肽酰肽酶的活性是造成GlyExendin-4的N-末端剪切的原因(图6)。

以相同方式在表达GlyExendin-4的毕赤酵母克隆中进行酿酒酵母二肽酰肽酶基因DAP2的毕赤酵母同源物的缺失(数据未给出)。这继续显示(N-2)杂质，表明其不是产生这一杂质的原因(见图7)。

实施例7：发酵毕赤酵母以表达GlyExendin-4

将从于-70℃储存的小管中刚解冻的毕赤酵母细胞接种于50ml生长培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、10％1M磷酸盐缓冲液pH6.0、0.67％酵母氮源和0.1％甘油)并于28℃～32℃和220rpm～260rpm培养。将种子细胞在含有1L发酵培养基的2L发酵罐中培养，所述发酵培养基由4％甘油、0.01％硫酸钙、2％硫酸钾、1.4％硫酸镁和0.4％氢氧化钾组成。在下列条件下以上述培养基进行发酵罐实验：于20℃～30℃的不同温度、pH5.0、通气速率0.5vvm～2.0vvm。将搅拌速度从350rpm逐渐增加至1200rpm以保持溶解氧水平为高于30％。通过50％甘油的投料使生物量增长至300g/L。无菌地收集1L培养基流体并在12个250ml烧瓶中的每一个烧瓶中分装50ml。将所有的烧瓶于220rpm～260rpm以20℃～30℃的不同温度培育。每天加入100μL甲醇，并在5天后进行GlyExendin-4表达的分析。

甲醇投料后每隔24小时留取样本，并使用HPLC确定GlyExendin-4的水平。下面给出了于不同生长温度下发酵5天后获得的GlyExendin-4的产量。

表1

 

生长温度(℃)GlyExendin-4产量(g/L)200.0443220.0467240.0567260.0867280.0905300.0685

实施例8：发酵重组毕赤酵母以生产GlyExendin-4

将从于-70℃储存的小管中刚解冻的毕赤酵母细胞接种到于28℃～32℃和220rpm～260rpm的50ml生长培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、10％1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)、0.67％酵母氮源和0.1％甘油)。将种子细胞在含有1L发酵培养基(3.5％甘油、0.01％硫酸钙、1％硫酸钾、1％硫酸镁和0.25％氢氧化钾)的2L发酵罐中培养。在下列条件下以上述培养基进行发酵罐实验：于20℃～30℃的不同温度、pH5.0、通气速率0.5vvm～2.0vvm。将搅拌速度从350rpm逐渐增加至1200rpm以使溶解氧水平保持30％以上。通过50％甘油的投料使生物量增长至285g/L，随后进行甲醇投料。

甲醇投料后每隔24小时留取样本，并使用HPLC确定GlyExendin-4的水平。下面给出了于不同生长温度下发酵5天后获得的GlyExendin-4的产量。

表2

 

生长温度(℃)GlyExendin-4产量(g/L)200.23220.37240.67260.72280.75300.67

实施例9：表征在毕赤酵母中表达的GlyExendin-4

发酵后使用标准的层析技术从无细胞上清液纯化GlyExendin-4。通过ESI-TOF(图8)表征的纯化的肽具有与全长GlyExendin-4对应的4.2kDa的质量，强烈提示不存在N-末端剪切和糖基化种类。N-末端测序(Sequence IDNo：13)进一步确认不存在N-末端降解。通过胰蛋白酶消化(图9)和随后的单独片段(Sequence ID No：14～No：17)测序确认了被表达的肽的序列。这进一步确认不存在糖基化种类。

其它实施方式

上述的是对本发明的某些非限制性的优选实施方式的描述。如所附权利要求书中所定义的，本领域的技术人员将意识到可以对这一描述做出各种变化和修改，而不背离本发明的实质和范围。

序列表

<110>XXX

<120>促胰岛素肽的制备

<130>2001568-0040

<140>尚未获得

<141>1950-11-11

<160>13

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>87

<212>PRT

<213>希拉毒蜥(Heloderma suspectum)

<223>Exendin-4前体的氨基酸序列

<400>1

<210>2

<211>39

<212>PRT

<213>希拉毒蜥(Heloderma suspectum)

<223>Exendin-4的氨基酸序列

<400>2

<210>3

<211>31

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<223>活性GLP-1(7-37)的氨基酸序列

<400>3

<210>4

<211>40

<212>PRT

<213>希拉毒蜥(Heloderma suspectum)

<223>GlyExendin-4的氨基酸序列

<400>4

<210>5

<211>141

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码Exendin-4的核苷酸序列，为在毕赤酵母中表达而优化

<400>5

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增Exendin-4CDS的PCR引物(正向)

<400>6

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增Exendin-4CDS的PCR引物(反向)

<400>7

<210>8

<211>2553

<212>DNA

<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)

<223>STE13CDS的核苷酸序列。靶标序列以加粗字体标示。

<400>8

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增来自毕赤酵母的STE13靶向序列的引物(正向)-PCR1

<400>9

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增来自毕赤酵母的STE13靶向序列的引物(反向)-PCR1

<400>10

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增来自毕赤酵母的STE13靶向序列的引物(正向)-PCR2

<400>11

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增来自毕赤酵母的STE13靶向序列的引物(反向)-PCR2

<400>12

<210>13

<211>10

<212>PRT

<213>希拉毒蜥(Heloderma suspectum)

<223>N-末端测序结果

<400>13

<210>14

<211>12

<212>PRT

<213>希拉毒蜥(Heloderma suspectum)

<223>胰蛋白酶消化GlyExendin-4获得的片段-对应于图9中的T1峰

<400>14

<210>15

<211>8

<212>PRT

<213>希拉毒蜥(Heloderma suspectum)

<223>胰蛋白酶消化GlyExendin-4获得的片段-对应于图9中的T2峰

<400>15

<210>16

<211>7

<212>PRT

<213>希拉毒蜥(Heloderma suspectum)

<223>胰蛋白酶消化GlyExendin-4获得的片段-对应于图9中的T3峰

<400>16

<210>17

<211>13

<212>PRT

<213>希拉毒蜥(Heloderma suspectum)

<223>胰蛋白酶消化GlyExendin-4获得的片段-对应于图9中的T4峰

<400>17