重组胎盘生长因子的表达生产、分离纯化及其化学标记

摘要

本发明属于生物技术领域－重组基因工程领域。胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)在血管新生或增生中起着重要作用；但体内天然的PLGF含量低且半衰期短，故很难提取到足够量的内源PLGF蛋白以满足日益增长的实验研究及临床需要。本发明公开了一种以重组基因工程，细胞培养技术在体外高效表达生产重组PLGF的系统及以层析分离技术从表达的上清液中提取纯化PLGF蛋白的方法。本发明还公开了一种对纯化的PLGF蛋白进行体外非放射性化学偶联标记处理的方法。本发明的PLGF蛋白(包括未标记的或化学偶联标记的)在实验研究及临床诊疗上具有广泛的用途。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术-重组基因工程领域，涉及以基因工程及真核细胞发酵培养技术来表达生产具生物活性的重组胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)。本发明还涉及重组PLGF蛋白的分离纯化、体外化学标记与其应用。

背景技术：

血管增生或新生(angiogenesis)是指体内的血管(如毛细血管和小静脉)通过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。血管新生在维持机体的许多正常的生理过程如组织胚胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的。但过度的血管新生或增生也与许多病理变化(如肿瘤的增生扩散、炎症反应等)息息相关。体内的血管能够不断地增生与增长的关键是其内衬的血管内皮细胞具有分裂增生及定向迁移置入已有的血管管壁的能力。血管内皮细胞的增生受体内正(即刺激血管增生)、负(即抑制血管增生)两大方面因子的调控。其中正面调控血管内皮细胞增生的最为重要的因子为血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，以下简称VEGF)及胎盘生长因子(placentalgrowth factor，以下简称PLGF)。

VEGF(包括VEGF-A，B，C，D及E等)、PLGF(包括PLGF-1，PLGF-2及PLGF-3)与血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)一起，共同构成PDGF家族成员。PDGF家族蛋白之间有相似的氨基酸序列及结构，其共同特征在于其N-端含有高度保守的带8个半胱氨酸残基的多肽序列。PDGF家族蛋白主要以二聚体可溶性糖蛋白形式存在于细胞外间质或体液中，并通过与表达在血管内皮细胞上的带酪氨酸激酶的特异受体结合而介导出包括如促血管内皮细胞分裂增生、趋化迁移及血管通透性增强等一系列的生物活性。目前已知的VEGF/PLGF的特异受体主要有三种：即VEGFR-1(fms-liketyrosine kinase，简称FLT-1)；VEGFR-2(Kinase-insert Domain Receptor，简称KDR；在小鼠中称为Flk-1)和VEGFR-3(简称FLT-4)。其中VEGF-A可与VEGFR-1及VEGFR-2受体结合；而VEGF-B和PLGF仅与VEGFR-1受体结合。

VEGF及PLGF两者同源，且其结构与生物活性相近，但以往的研究更为关注的是VEGF。而对于PLGF，尽管其基因早在1991年就已克隆出(Maglione D et al.PNAS 1991，88：9267-9271)，但其在血管增生中的意义长时期以来一直是处于从属或未定状态。近年来随着研究的深入，越来越多的结果证明PLGF实际上参与许多生理或病理条件下的血管增生。支持该结论的证据至少包括以下几点：1)PLGF除了在胎盘中高水平表达之外，体内其他组织器官(如肺脏等)及细胞中也检测到PLGF基因的表达；2)PLGF基因剔除的小鼠其在外伤或移植肿瘤后所诱发的血管新生比其在正常小鼠中明显降低(Carmeliet P et al，Nature Medicine 2001，7：575-583)；3)血液或尿液中PLGF及其可溶性FLT-1受体(即VEGFR-1)蛋白的水平与高危妊娠妇女中的先兆子癫的发生与发展密切相关；4)动物体内实验已证明注射抗-PLGF的抗体后，肿瘤的生长可得到控制(Fischer C et al.Cell2007，131：463-475)。因此，PLGF及其受体应是一很好的药物靶点或系统，可用于研究开发各种与血管增生有关的疾病的药物制剂。

但是在以PLGF及其受体为靶点的药物研发领域，目前还存在一些技术难题。其中一大技术难题是由于体内天然的PLGF含量低且半衰期短，故很难从组织细胞或其他常规生物样品(如血浆中)提取与分离到足够量的PLGF蛋白以满足日益增长的实验及临床研究的需要。解决该问题的理想方案是以基因工程技术在真核细胞或原核细菌中表达生产重组的PLGF蛋白。在原核细菌中表达生产重组PLGF蛋白的技术方案只见有个别文献报导。如在一份公开号为CN1620465(公告日：2005.05.25)的中国发明专利文献中(专利文献：专利发明名称：重组胎盘生长因子的制备方法，专利申请人：意大利盖莫纳股份公司)报导了一种在原核细菌中诱导表达重组PLGF及表达蛋白的复性与提取纯化的方法。但该专利文献报导的方法生产重组PLGF蛋白存在着一些内在缺陷。其缺陷主要表现在于：1)原核细菌中表达的PLGF蛋白多以包涵体形式存在，其复性过程复杂繁琐，且一般难以获得如天然PLGF样活性的蛋白；2)原核细菌中表达的PLGF蛋白不含糖基，而天然的PLGF是含糖基的蛋白，而已有的研究表明糖基在维持PLGF的结构稳定及其生物活性上起着重要的作用。

有鉴于上述因素，作为具有潜在药用价值的重组PLGF蛋白的表达生产将以在真核细胞中表达最为理想。常见的可用于表达重组蛋白的真核宿主细胞有哺乳动物细胞、昆虫细胞及酵母细胞等。但以哺乳动物细胞如CHO细胞表达生产重组蛋白，其表达量一般较低而用于培养该类细胞的培养基成本高、价格贵，故不太适合用于工业化大规模生产。而真核单细胞酵母表达系统由于兼有原核细胞的生长快速、培养方便经济、成本低廉，和真核细胞系统的对表达产物的翻译后再加工修饰(如糖基化)的双重优点，则是工业化生产表达重组PLGF蛋白的最理想宿主。

为了获得经济而又便于大规模生产制备具生物活性的PLGF蛋白，本发明在此公开了一种以基因工程技术在真核酵母细胞中分泌表达重组PLGF蛋白的系统及从分泌表达的上清液中快速分离纯化重组PLGF蛋白的方法。以该系统及方法来表达与制备生产重组PLGF蛋白具有高效快速、经济简便等优点，尤其适合用于工业化大规模生产。本发明还公开了一种对分离提取的PLGF蛋白进行体外非放射性化学偶联标记处理的方法。本发明中的PLGF蛋白(包括化学偶联标记的或未标记的)在实验研究及临床诊治上具有广泛的用途。

发明内容

本发明目的之一是公开了一种以基因工程技术在真核宿主细胞(尤其是在酵母细胞)中高效分泌表达具生物活性的重组PLGF蛋白的系统。该系统的特征在于其采用以真核酵母细胞分泌性表达的方式，表达获得的重组PLGF蛋白保持有如内源性PLGF蛋白的天然结构及较高的生物活性。此外，由于分泌表达的重组蛋白集聚于细胞培养液中，更便于对重组PLGF蛋白进行回收及分离纯化等下游工艺操作。

本发明另一大目的是公开了从酵母细胞表达上清液中简便快速分离提纯重组PLGF蛋白的方法。该方法的特征在于其采用了离子交换层析柱。

本发明还公开了一种对分离提纯的重组PLGF蛋白进行体外非放射性化学物标记处理的方法及其制备过程。其中用于标记PLGF蛋白的化学物是生物素(Biotin)。生物素标记的PLGF蛋白在与亲和素(avidin)合并使用时，构成的生物素-亲和素检测系统具有检测迅速、灵敏、专一、稳定、多级放大效应及无放射污染等特点。

本发明的PLGF蛋白(标记的或未标记的)因保持有与其受体特异结合的生物活性，故其在实验研究及临床诊疗上具有广泛的用途。其明显的用途至少包括(但不限于)：

1)作为药物成分，用于干预或治疗各种与血管增生有关疾病；

2)作为检测试剂用于体内及体外定性及定量检测PLGF受体的表达；

3)作为中合吸附剂用于分离PLGF受体表达阳性的细胞(如血管内皮细胞)与组织等；

4)作为显示剂，用于体内定位跟踪显示PLGF受体表达阳性的细胞与器官组织；

5)作为抗原用于制备及筛选抗PLGF蛋白的抗体(包括单克隆及多克隆抗体等)。

本发明的具体内容描述如下：

1.含PLGF编码基因的表达载体的构建及其在真核宿主(酵母细胞)中的分泌表达

本发明的目的之一是建立在真核宿主(尤其是酵母细胞)中高效分泌表达重组PLGF的系统与方法。保证重组PLGF蛋白在真核宿主(酵母细胞)中高效分泌表达的一大关键因素是需要一段信号肽(signal peptide)以引导新合成的重组PLGF穿透内质网，并最终分泌到细胞外间质。编码该信号肽的基因可来自于PLGF基因本身，或其他外源基因如IL-2，免疫球蛋白(Ig)等。在本发明的具体实施中因优选酵母细胞表达系统，故其信号肽则选择了酵母细胞中已知的α分泌信号肽序列。多个已知的含酵母α分泌信号肽序列的表达载体如pPic9k(Invitrogen)等可供选择。构建含PLGF及酵母α分泌信号肽序列的重组基因表达载体的具体技术与操作方法可参见《分子克隆》等书。其中有关操作包括如下步骤：

1)先采用RT-PCR方法从细胞组织如人外周血单核细胞(PBMCs)中克隆扩增获得含人PLGF蛋白编码区(coding region)的cDNA(包括PLGF131、152等形式)。用于PCR扩增的上、下游引物可参照已公开的PLGF cDNA序列在体外合成。

2)PCR克隆获得的PLGF cDNA经限制性内切酶酶切处理，再用T4连接酶将其与经相应的酶切处理的表达载体pPic9k(Invitrogen)相连，经转化入感受细菌；

3)再经筛选，扩增，提取质粒DNA及酶切鉴定，即获得含重组PLGF基因的真核细胞表达载体pPic9k-PLGF。

由于重组PLGF基因在电转化后细胞中的表达量与PLGF基因在宿主(酵母)染色体中整合的拷贝数正相关。而在表达质粒载体pPic9k-PLGF转化后的酵母细胞获得了对G418的抗性，其抗药能力与表达质粒在酵母菌染色体中的拷贝数正相关。因此可通过筛选对G418具有高抗药性的克隆得到高表达目的基因的菌株。

在获得含多拷贝PLGF基因的酵母细胞后，挑取数个克隆用于诱导表达PLGF。诱导表达在摇床培养中进行，以1％甲醇诱导。诱导表达2-3天后，收集酵母细胞培养上清液，离心后，再以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)(SDS-PAGE)和Western-blot鉴定分析上清中所含的重组PLGF蛋白。

2.PLGF蛋白的分离纯化

本发明一大目的是建立从酵母细胞表达上清液中快速分离提取重组PLGF蛋白的方法。该方法的特征在于其采用了离子交换层析柱。

其中有关操作包括如下步骤：

1)收集的PLGF培养发酵上清液，离心及滤膜过滤；

2)过滤后上清液与结合缓冲液平衡；

3)上样至DEAE-SEPHAROSE层析柱中；

4)层析柱以洗脱液去除杂蛋白；

5)以回收缓冲液洗脱被吸附的蛋白并分步收集洗脱下的样品；收集的样品再经透析即分离获得PLGF蛋白；分离获得的PLGF蛋白可再经理化与生物活性鉴定及蛋白浓度测定等分析。鉴定实验包括：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE(SDS-PAGE)，考马斯亮蓝染色；免疫印迹/ELISA试验；与VEGF受体结合试验及体外促血管内皮细胞增殖实验等。

3.PLGF蛋白的体外化学标记处理

本发明的另一大目的是采用非放射性偶联标记方法对分离纯化的PLGF蛋白进行体外化学标记处理。可用于标记的常用化学标记物包括(但不限于)酶(辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，微过氧化物酶)；荧光素(异硫氰酸荧光素(FITC)；生物素-抗生物素及胶体金等；其中，在本发明中体外化学偶联标记PLGF蛋白的优选标记物是生物素(Biotin)。

生物素是一种小分子量的维生素，它与亲和素及亲和素样蛋白质具有很高的结合能力。通过适宜的方法，生物素可以偶联到许多蛋白质，并不改变蛋白原有的生物学活性。生物素标记的蛋白可与亲和素形成高度亲合、专一稳定的结合，可用于ELISA、dot-blot或Western-blot等许多试验。

在本发明实施中，用于标记PLGF蛋白的生物素化学试剂是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯酰活化的生物素。在pH7-9的缓冲液中，NHS活化的生物素能够非常有效地与蛋白质的伯氨基(-NH2)反应，形成稳定的酰胺键。生物素标记蛋白质的效果或效率高低则取决于蛋白质的大小、蛋白质表面伯氨基的分布以及生物素标记试剂的使用量。在本发明中，理想的或优化的标记条件如下：

1)用于标记的试剂(NHS活化的生物素)的终溶度为9mM；

2)标记生物素：待标记PLGF蛋白质的摩尔比为反应摩尔比控制在10：1至50：1间；

3)标记的缓冲液pH为7-9；

4)标记的温度与时间：为室温下反应30-60分钟。

在该优化的标记条件下，平均每个PLGF蛋白分子一般可偶联上1-4个生物素，获得较理想的标记效果。

其中，以生物素来标记PLGF蛋白的方法包括如下步骤：

1)溶解PLGF蛋白质于PBS中；

3)加入适量的标记试剂(NHS-生物素)与PLGF蛋白样品混合，室温反应30-60分钟；

3)通过透析或脱盐去除未反应的过量生物素，即得到生物素标记的PLGF蛋白。

4.标记的或未标记的PLGF蛋白的应用

本发明的另一大内容还涉及PLGF蛋白(包括标记的或未标记的)的应用。

重组PLGF蛋白因保持有如内源性PLGF的生物活性(表现在能与PLGF/VEGF受体高度特异结合并可刺激血管内皮细胞分裂增生)，故其在实验研究及临床诊疗上具有广泛的用途。其明显的用途至少包括(但不限于)以下几种：

1)作为检测试剂盒成分用于体内及体外定性及定量检测PLGF/VEGF受体的表达；

2)作为吸附剂用于分离PLGF/VEGF受体表达阳性的细胞(如血管内皮细胞)或组织等；

3)作为非放射性显示剂，用于体内定位与跟踪PLGF/VEGF受体表达阳性的细胞与器官组织；

4)作为抗原用于制备及筛选抗PLGF蛋白的抗体(包括单克隆及多克隆抗体等)。

5)作为药物成分，用于干预或治疗各种与血管增生有关疾病；

其中有关本PLGF蛋白的几项应用具体描述如下：

4.1 PLGF蛋白作为检测试剂盒成分应用于测定PLGF受体的表达

本发明的PLGF(包括标记的或未标记的)可作为检测试剂盒成分用于体外定性或定量检测PLGF受体的表达。被检测的PLGF受体可以是以膜蛋白表达于培养细胞细胞或组织中，也可以是以流离的或降级的可溶性分子存在于各种体液(如血清)及细胞培养上清液中。

如用抗PLGF-R的抗体为包被抗体，用生物素标记的PLGF蛋白为检测试剂，以ELISA方法来检测样品中流离的PLGF受体，其步骤包括：

1)用抗PLGF-R的抗体(如抗人Flt1抗体)包被ELISA板，4℃过夜；

2)包板以含牛血清白蛋白(BSA)的封闭液于室温封闭温育1小时；

3)加入含流离PLGF受体的待检样品(如血清，细胞上清液等)，37°C孵育1-2h；

4)PBS-T洗板后，加入含生物素标记的PLGF蛋白试剂，温育1-2小时；

5)PBS-T洗板后，再加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，37°C孵育1h；

6)PBS-T洗板后，然后加入显色液(如邻苯二胺，-3％ h202)，室温静置至显色，再加入终止液，以酶标仪测定各孔的吸光。根据显色OD结果并与参照物相比较，可测出待检样品中的流离PLGF受体(如Flt1受体)的溶度。

而如以生物素标记的PLGF为试剂，用免疫组化等方法来检测表达于细胞或组织(如组织芯片或常规病理切片)样品中的PLGF受体，其检测步骤包括：

1)在切片上滴加上含BSA的封闭液于室温封闭温育1小时；

2)用双蒸水充分洗涤，在切片上滴加含生物素标记的PLGF蛋白试剂，温育1-2小时；

3)用洗脱液洗去多余样品，滴加酶标记的亲和素，温育30-60分钟；

4)用洗脱液洗净，滴加底物，避光温育5-10分至显色；

5)于显微镜下判读检测结果。组织芯片、切片的检测结果再与临床资料比较，可得到如检测符合率，敏感度、稳定性及特异性等有关诊断或检测参数。

4.2.PLGF蛋白用于体内外分离吸附PLGF受体表达阳性细胞或组织

PLGF蛋白还可用于体内外吸附或分离含PLGF受体的细胞与组织。如用生物素标记的PLGF蛋白体外吸附分离PLGF受体表达阳性的细胞或组织为例，其步骤包括：

1)先将亲和素吸附在适当的固相载体上(如细胞培养板，细胞培养皿，硝酸纤维素膜或尼龙膜等)；

2)在固相载体上滴加含牛血清白蛋白(BSA)的封闭液温育1小时；

3)用PBS洗涤，在固相载体上滴加生物素偶联标记的PLGF蛋白，温育1-2小时；

4)再加入细胞或其他待分离样品，温育1-2小时；

5)用PBS洗涤后，即获得PLGF受体表达阳性的细胞或组织。

4.3.PLGF蛋白的其他用途

本发明中的PLGF蛋白可作为抗原用于制备及筛选抗PLGF蛋白的抗体。制备的抗体包括多克隆，单克隆及其基因工程改造的抗体(如人源化抗体等)。抗PLGF蛋白抗体的制备可参照常规已知的方法开展。其中用于制备多克隆抗体的动物包括鼠，羊，兔，鸡等；而用于制备单克隆抗体的动物包括鼠，兔等。抗PLGF蛋白单克隆抗体抗体的筛选方法包括ELISA，免疫组化等。

本发明的PLGF蛋白因保持有与其受体特异结合的生物活性，故可作为药物成分(与其他合适载体或溶液合并使用)，引入体内用于干预或治疗各种与血管增生有关疾病；或作为显示剂，用于体内定位跟踪显示PLGF受体表达阳性的细胞与器官组织。

此外，本发明中的生物素标记的PLGF蛋白还可以与偶联有亲和素的磁粒微株合并使用，通过磁场吸附的作用而达到简便而又快速分离PLGF受体蛋白或PLGF受体表达阳性的细胞或组织的目的。而分离获得的PLGF受体蛋白或PLGF受体表达阳性的细胞(如血管内皮细胞)或组织可用于进一步的实验研究(如用于建立体外血管增生模型来筛选抗血管增生药物成分；用于制备抗PLGF受体的抗体等)。

附图说明

图1为构建的酵母表达质粒pPic9-PLGF1的示意图。其中含有编码人PLGF131的cDNA片段插入在表达载体的EcoR I和Not I酶切位点之间。

图2为SDS-PAGE检测分析质粒pPic9-PLGF1转染阳性酵母细胞分泌表达的重组PLGF蛋白。其中条带1(阴性对照酵母细胞上清液)和2(pPic9-PLGF1转染阳性酵母细胞上清液)为不加DTT未还原的两上清液样品；条带3(阴性对照酵母细胞上清液)和4(pPic9-PLGF131转染阳性酵母细胞上清液)为加DTT还原后的两上清液样品；条带M为蛋白分子量标准(分子量分别为66，44，29，20及14KD)。

图3为以直接ELISA法检测与鉴定酵母表达上清中的重组PLGF131蛋白。其中图示中的PLGF131代表质粒pPic9-PLGF1转染的酵母发酵上清液包被样品组；而neg代表阴性对照酵母上清包被样品组；样品均以对半系列稀释。

图4为以ELISA法定量检测从酵母表达上清中分离获得的重组PLGF131蛋白的量及其相对活性。其中图示中的VEGF(10ug/ml)代表以重组VEGF165蛋白包被的样品；PLGF131代表以分离获得的重组PLGF131蛋白包被的样品；yeast代表阴性对照酵母上清包被样品；样品均以对半系列稀释。

本发明具体实施方式

实施例一：PLGF表达载体的构建。

1.1 PCR扩增人PLGF基因

用于PCR扩增人PLGF基因的引物如下：

正向上游引物(PLGF-F)：ggattcGAA TTCgccttgtctgctgggaacggc

反向下游引物(PLGF-R)：ggattcGC GGCC GC gccgggtgcggggtctctctc

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：94℃ 5分/94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 40秒，共20个循环。

基因PCR扩增完毕，取少量经琼脂糖凝胶电泳分析，于约400bp处有一扩增条带，片段大小与预期的PLGF131基因片段相符。

1.2 PLGF-pPic9K质粒的构建和鉴定

上述PCR扩增片断及pPic9K质粒分别用EcoR I和Not I双酶切，随后用琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段。将上述两种回收的酶切片段各取约10ng混合后16℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞。随机挑选阳性克隆若干，小量提取质粒DNA，构建的表达载体用EcoR1和Not1双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分析，于约400bp处有一酶切条带，大小与预期相符。随后挑选两个经酶切鉴定正确的克隆送往上海鼎安公司进行DNA序列测定，测序引物选择通用引物α-factor primer，测序结果证明PLGF131基因片段已经插入到质粒pPic9K的预期位置，其读码框与α-factor分泌信号相符，基因全长未见突变。

实施例二：表达载体转化GS115宿主菌及PLGF蛋白的诱导表达

2.1 采用碱裂解-PEG纯化法丛100ml菌液中制备pPic9-PLGF1质粒。具体步骤参考《分子克隆三》相关章节进行。

2.2 取两管各约15ug pPic9-PLGF1质粒分别用30U Sal I和30U Bgl II彻底酶切线性化。酶切结束后，质粒用乙醇沉淀并分别用5ul超纯无菌去离子水重溶。

2.3 GS115感受态细胞的制备

(1)接种单克隆于3ml YPD培养基，30℃培养过夜

(2)按300ul上述新鲜菌液于300ml YPD培养基中，30℃

培养18小时。此时OD值为1.3左右。

(3)1500g离心5分钟收集细菌，随后用300ml冰冷的无菌去离子水重悬。

(4)1500g离心5分钟收集细菌，随后用150ml冰冷的无菌去离子水重悬。

(5)1500g离心5分钟收集细菌，随后用20ml冰冷的1M山梨醇重悬。

(6)1500g离心5分钟收集细菌，随后用500ul冰冷的1M山梨醇重悬，放置于冰上。

2.4 电转化

采用Bio-Rad公司的Gene pusler进行电转化。电转杯间隙1mm，

电转条件1000KV 25uF 200Ω。电击结束后立刻加入1ml 1M山梨醇，将细菌转移至50ml无菌离心管中，30℃静置1小时。然后加入1ml YPD，30℃摇床培养4小时。将细菌涂布于RD-His平板，培养3天。

2.5 筛选整合有多拷贝PLGF131基因的克隆

通常目的基因的表达量与目的基因在宿主菌染色体中整合的拷贝数正相关。同时转化后的酵母获得了对G418的抗性，且其抗药能力也与表达质粒在酵母菌染色体中的拷贝数正相关。因此通过筛选对G418具有高抗药性的克隆便可能得到高表达目的基因的菌株。

筛选高抗药性的克隆方法如下：

(1)配制含0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mg/ml G418的YPD平板各两块备用。

(2)吸取5ml YPD培养基滴于转化平板表面，用无菌Tips将所用阳性克隆全部刮下，并转移至15ml无菌离心管中充分混匀。

(3)加入无菌甘油至终浓度为20％，充分混匀后1ml分装，留一管备用，其余立即冻存于-20℃。

(4)取10ul上述菌液，用无菌水梯度稀释后分别涂布于YPD平板，30℃培养过夜，第二天通过菌落计数计算菌液的滴度(cfu/ml)。

(5)取一管冻存菌融化(第3步所得)，根据第4步测定的滴度。取适量菌液用无菌水稀释至106cfu/ml，然后取100ul分别涂布于第1步配制的梯度浓度的G418平板上。30℃培养2-5天。

3、诱导表达

从低浓度G418平板和高浓度G418平板分别随机挑取数个克隆用于诱导表达试验。诱导步骤如下。

(1)挑取单克隆接种于20ml BMGY培养基中，培养至OD600＝2-6；

(2)1500g离心5分钟收集菌体，并用2ml BMMY培养基重悬；

(3)1500g离心5分钟收集菌体，并用2ml BMMY培养基重悬；

(4)取1ml重悬的菌液转移至15ml圆底离心管中，放入摇床进行诱导表达。

(5)另1ml重悬的菌液转移至250ml无菌三角瓶中，加入19ml新鲜BMMY培养基，放入摇床进行诱导表达。

(6)每12小时补加100％的甲醇至终浓度为0.5％，每24小时取样适量；样品12000rpm离心2分钟后将上清和菌体分别冻存于-20℃。

实施例三：SDS-PAGE检测分析酵母细胞分泌表达的重组PLGF蛋白

采用SDS-PAGE及ELISA法方法来检测分析与鉴定酵母细胞上清液中分泌表达的重组PLGF蛋白。转化GS115酵母宿主在诱导表达48-96小时后，收集上清液并上样(加DTT还原，或不加DTT未还原)至12％SDS-PAGE胶电泳分析。电泳结束后，PAGE胶以银染显色蛋白，其结果如图2所示：与阴性对照酵母上清相比(泳带1和3)，pPic9-PLGF1转化的酵母上清液样品在加DTT还原的条件下(泳带4)在约20-25KD左右可见特异性蛋白条带，这与预测的重组PLGF蛋白单体的分子量相符；而在未加DTT的未还原样品中(泳带2)，特异性蛋白条带则在40-50KD左右，与重组PLGF蛋白二聚体的分子量相符。此结果证明pPic9-PLGF1转化的酵母分泌表达了重组PLGF蛋白。

实施例四：ELISA法检测分析酵母细胞上清液中的重组PLGF蛋白

以ELISA法检测与鉴定酵母表达上清中的重组PLGF蛋白，其步骤如下：

1)用质粒pPic9-PLGF1转染阳性PLGF培养发酵上清液及阴性对照酵母上清液包被ELISA板；

2)ELISA板经PBS液漂洗及2％BSA(in PBS-0.1％tween20液)室温封闭后，加入含重组可溶性VEGF/PLGF受体蛋白(即sflt1，或sVEGFR-1)的试剂，37°C孵育2h；

3)PBS-T洗脱，加入小鼠抗PLGF受体蛋白的抗体(即抗人VEGFR-1)，37°C孵育2h；

4)PBS-T洗脱，加入生物素标记的山羊抗小鼠PLGF蛋白，37°C孵育1h；

5)PBS-T洗脱，再加入辣根过氧化物酶标记的Avidin，37°C孵育1h；

6)PBS-T洗脱，加入显色液(邻苯二胺)-3％双氧水，室温10-20min，至显色；

7)加入1mol/L HCL终止反应，以酶联免疫仪测定492nm波长处各孔的吸光值。

ELISA检测结果如图3所示：质粒pPic9-PLGF1转染阳性的酵母发酵上清液(PLGF131)包被样品组呈阳性，而阴性酵母对照上清(neg)样品为阴性。此结果证明转化的酵母分泌表达了重组PLGF蛋白，且表达的重组PLGF蛋白可与其特异受体)(flt-1，即VEGFR-1)结合。

实施例五：PLGF蛋白的分离纯化

收集的PLGF培养发酵上清液，经离心及滤膜过滤后，加入1.8M氨水使发酵上清PH值达到8.0，然后加入等体积结合缓冲液(结合缓冲液：50mM Tris·HCl+50mM NaCl PH＝7.4)。平衡后，上样至DEAE-SEPHAROSE层析柱中(1L/10ml层析柱)。层析柱先以洗脱液去除杂蛋白，再以缓冲液(50mM NaAc+500mMNaCl，PH＝5.0)洗脱被吸附的蛋白并收集洗脱下的样品(每500ul一管分步收集，共8-12管)。洗脱收集液再经透析后即分离获得PLGF131蛋白。分离的蛋白再以PIERCE-BCA(bicinchoninic acid)方法测定蛋白浓度，SDS-PAGE及考马斯亮蓝(R-250)染色观察测定纯化，体外检测其与受体(flt-1，或VEGFR-1)特异结合的活性。

其中体外检测与鉴定检测分离获得的重组PLGF蛋白其与特异受体(flt-1，或VEGFR-1)结合的活性的方法采用ELISA，其步骤如下：

1)用含重组PLGF蛋白或VEGF阳性对照蛋白，阴性对照酵母上清液包被ELISA板；

2)ELISA板经PBS液漂洗及2％BSA(in PBS-0.1％tween20液)室温封闭后，加入含重组可溶性VEGF/PLGF受体蛋白(即sflt1，或sVEGFR-1)的试剂，37°C孵育2h；

3)PBS-T洗脱，加入小鼠抗PLGF受体蛋白的抗体(即抗人VEGFR-1)，37°C孵育2h；

4)PBS-T洗脱，加入生物素标记的山羊抗小鼠PLGF蛋白，37°C孵育1h；

5)PBS-T洗脱，再加入辣根过氧化物酶标记的Avi din，37°C孵育1h；

6)PBS-T洗脱，加入显色液(邻苯二胺)-3％双氧水，室温10-20min，至显色；

7)加入1mol/LHCL终止反应，以酶联免疫仪测定492nm波长处各孔的吸光值。

结果如图3所示：与含VEGF的阳性对照蛋白样品一样，含重组PLGF蛋白样品包被的样品呈阳性；，而阴性酵母对照上清(neg)样品为呈阴性。此结果证明分离获得的PLGF蛋白保持有与其特异受体(flt-1，或VEGFR-1)结合的活性。

实施例六 PLGF131蛋白的体外生物素化学标记

在本发明实例中，生物素标记试剂的制备溶度为9mM，采用的标记试剂与VEGF蛋白的反应摩尔比为50：1。其标记包括以下步骤：

1)溶解50-200ug PLGF131蛋白质于200-700ul PBS中；

2)剪下一管生物素标记试剂，剩余的试剂放为-20度冻存。加入200ul试剂(水、DMF或DMSO)溶解，并用移液器混匀；

3)按上述计算结果，加入适量的标记试剂与蛋白样品混合，并混匀；

4)室温反应30-60分钟；

5)通过透析或脱盐去除未反应的过量生物素，即得到生物素标记的PLGF131蛋白。

实施例七 PLGF蛋白用于检测流离的(或可溶性)PLGF受体及定量检测PLGF的水平

本发明中的PLGF蛋白(包括生物素标记处理的PLGF蛋白)还可与其他试剂成分合并使用组成试剂盒，用于体外检测各种生物样品(如血清、细胞裂解液、细胞培养上清液等)中可与VEGF蛋白结合的物质(如流离的或可溶性VEGF受体)或定量检测PLGF或VEGF的水平。其中，同PLGF蛋白合并使用的试剂盒成分包括抗PLGF抗体，可溶性PLGF/VEGF受体等。该类试剂盒可既可用于以两步法/夹心ELISA法或免疫印迹等方法来检测可溶性PLGF/VEGF受体及其水平。

如用标记处理的PLGF蛋白及抗人VEGFR1抗体为试剂，采用夹心ELISA法来检测样品中可溶性VEGFR1受体为例，其检测步骤包括：

1)用抗人VEGR1抗体包被96-well-ELISA板(2μg/ml，50μl/孔)，4℃过夜；

2)经1x PBS液漂洗及2％BSA(in PBS-0.1％tween20液)室温封闭1～2h后，分别加入待检的样品，37°C孵育2h；

3)经PBS-T洗脱后，加入生物素标记的PLGF蛋白(1：4)，37°C孵育1h；

4)经PBS-T洗脱后，加入辣根过氧化物酶标记的Avidin(1：5000)，37°C孵育1h；

5)经PBS-T洗脱后，加入显色液(邻苯二胺)-3％双氧水，室温10-20min，至显色；

6)加入1mol/L HCL终止反应，以酶联免疫仪测定492nm波长处各孔的吸光值；根据OD值并与已知正常参照物(如重组可溶性VEGFR1受体蛋白)相比较，可计算出待检样品中所含流离的或可溶性VEGF1受体蛋白的水平。

同理，生物素标记的PLGF蛋白如与其他试剂成分(如抗人VEGF抗体)及已知溶度的PLGF/VEGF蛋白参照物(如重组PLGF或VEGFR蛋白)合并使用，构成竞争性ELISA试剂盒，也可用于体外检测各种生物样品(如血清、细胞裂解液、细胞培养上清液等)中VEGF的水平。

如以竞争性ELISA法来检测样品血清中PLGF或VEGF的水平为例，其检测步骤包括：

1)用抗人VEGF抗体包被96-wel1-ELISA板(2μg/ml，50μl/孔)，4℃过夜；

2)经PBS液漂洗及2％BSA(in PBS-0.1％tween20液)室温封闭后，分别加入待检的样品，37°C孵育2h；

3)经PBS-T洗脱后，加入已知固定溶度的生物素标记的PLGF蛋白(1∶4000)及待检的样品(血清)，37°C孵育2h；另设PLGF或VEGF蛋白对照参照组，该组加入已知固定溶度的生物素标记的PLGF及不同溶度的未标记的PLGF或VEGF参照物，37°C孵育2h；

4)经PBS-T洗脱后，加入辣根过氧化物酶标记的Avi din(1：5000)，37°C孵育1h；

5)经PBS-T洗脱后，加入显色液(邻苯二胺)-3％双氧水，室温10-20min，至显色；

6)加入HCL终止反应，以酶联免疫仪测定492nm波长处各孔的吸光值；

7)根据OD值并与含已知溶度的PLGF或VEGF蛋白相比较，可计算出待检样品中VEGF蛋白的水平。因VEGF蛋白与生物素标记的PLGF蛋白竞争结合抗人VEGF抗体之故，样品中所含VEGF蛋白的量与OD值呈反比关系，即VEGF蛋白的量越高，OD值越低。