一种基于分子印迹整体柱的L－苯丙氨酸的分析检测方法

摘要

本发明涉及在微通道中利用分子印迹整体柱进行L－苯丙氨酸的快速富集与检测。分子印迹整体柱的制备方法：将L－苯丙氨酸溶解在二甲基亚砜中，加入功能单体、致孔剂震荡1小时后，加入交联剂、引发剂，超声脱气，通氮气除氧，将此溶液充满微通道C2中，密封微通道，在紫外光照下反应。将分子印迹整体柱用于L－苯丙氨酸检测时，当样品流经分子印迹整体柱后，与另一通道C1中的荧光衍生试剂发生反应，流经检测口检测。

说明书

【技术领域】：

本发明属于生物化工技术领域，涉及微流控芯片中L-苯丙氨酸分子印迹整体柱的制备以及L-苯丙氨酸的富集、检测。

【背景技术】：

L-苯丙氨酸是人体8种必需氨基酸之一，它不能由人体合成，只能通过食物从外界摄取，但是它在人体内的含量是有限制的，如果超过一定的含量，会引发一系列相关的疾病，如苯丙酮尿症。苯丙酮尿症(PKu)是一种呈世界性分布的遗传性代谢疾病，国内发病率大约为1/16500，其病因通常是由于人体内缺少苯丙氨酸羟化酶(PAH)，导致体内的苯丙氨酸不能正常代谢为酪氨酸，引起人体血液、尿液、脊液中的苯丙氨酸的累积及酪氨酸浓度的降低，对人脑造成破坏，导致智力低下。苯丙酮尿症患者在幼儿时能尽早发现是可以治疗的，所以建立人体血液中苯丙氨酸浓度的测定方法是十分必要的。从1961年细菌抑制法测定血样中苯丙氨酸浓度筛查苯丙酮尿症创立以来，有许多方法应用于检测苯丙氨酸，如高效液相色谱法、气相-质谱法等，但是现有的方法具有：样品前处理复杂、分析速度慢、仪器昂贵等缺点。随着现代仪器技术发展和生物检测技术的应用，寻求更加灵敏、方便和快速的检测方法成为新的目标。

分子印迹技术是一种高选择性的特异识别方法，以其操作简单、聚合物的选择性好、性能稳定、价格便宜等优点，用于固相萃取和色谱柱填料中。

整体柱(Monolithic Column)是吸取了无孔填料和膜的快速分离能力及高效液相色谱多孔填料的高容量，又没有增加柱阻力等优点而发展起来的一种新型高效液相色谱填料，而分子印迹整体柱(Molecluarly Imprinted Monolithic Column)兼具分子印迹与整体柱的优点，具有高效、快速、专一的特点，同时可以满足复杂样品前处理的要求。

此外，微流控芯片分析技术是一种新型分析技术，具有分析速度快、样品用量少等优点。

【发明内容】：

本发明的目的是实现L-苯丙氨酸的快速富集以及检测，提供了一种微流控芯片中L-苯丙氨酸分子印迹整体柱的制备方法以及微流控芯片中L-苯丙氨酸的快速富集、检测。

在微流控芯片的微通道中制备L-苯丙氨酸的分子印迹整体柱，并在微流控芯片中利用柱后荧光衍生方法实现L-苯丙氨酸的快速富集与检测，该方法包括以下步骤：

(1)将模板分子L-苯丙氨酸超声溶解在溶剂二甲基亚砜(DMSO)中，加入功能单体、致孔剂振荡混合、静置作用至少1小时以形成复合物；

(2)向(1)中形成的复合物溶液中加入交联剂、引发剂，超声脱气(时间为3～20min)，通入氮气除氧(时间为10～60min)，将此溶液充满微流控芯片的微通道中，然后密封通道入口和出口，并用0.1～2mm厚黑色的纸盖住芯片微通道其它地方，只留下微通道中的分子印迹整体柱部分进行光照聚合反应，聚合反应在365nm左右的紫外灯光照下进行，时间为24～72小时；这里分子印迹整体柱的长度可以通过被光照的微通道部分的长度来调节，即如果需要1cm长的分子印迹整体柱，就让通道中1cm长的部分进行光照，而芯片其它部分用黑色纸盖住以不让紫外光线通过。

(3)将分子印迹整体柱与注射泵连接，利用溶剂冲洗柱子以除去致孔剂和模板分子，便可得到具有良好印迹效果的分子印迹整体柱；

(4)将分子印迹整体柱用于L-苯丙氨酸(L-Phe)的分析检测，当样品在注射泵的驱动下，流经分子印迹整体柱后，与另一通道中的荧光衍生试剂4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并氧杂恶二唑(NBD-F)发生反应，生成具有发生荧光的物质(NBD-F与L-Phe的结合物，L-Phe-NBD)然后流经检测口时，利用激光诱导荧光检测系统检测，激光的最大激发波长为488nm。这里，样品中L-苯丙氨酸的含量在1×10^-7mol·L^-1到1×10^-4mol·L^-1之间，荧光试剂NBD-F的浓度为1×10^-3mol·L^-1与1×10^-5mol·L^-1之间。

其中，

(1)所述的功能单体为4-乙稀基吡啶；致孔剂为环己醇和十二醇混合液；

(2)所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯EDMA，引发剂为偶氮二异丁腈AIBN；

所述的模板分子、功能单体、交联剂的物质的量比为1:4:15、1:4:20、1:4:30、1:4:40、1:6:15、1:6:20、1:6:30、1:6:40；环己醇和十二醇的质量比分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9或0:10。

所述的溶剂DMSO用量为环己醇和十二醇混合溶剂质量的0～1倍，最好是0.2倍、0.4倍、0.5倍、0.8倍、1倍、1.5倍、2倍，便于称取。溶剂和致孔剂总量为功能单体、交联剂总质量的1～3倍，引发剂用量为混合溶液总质量的0.2％～10％。

所述的微流控芯片通道内径为50μm、80μm、100μm、150μm、200μm，分子印迹整体柱的长度为0.4cm～1.5cm。

本发明的优点在于：在微流控芯片中制备了L-苯丙氨酸分子印迹整体柱，分析速度快，样品用量少，分子识别性能好。

【附图说明】：

图1为微流控芯片结构示意图，其中，A为用于荧光衍生试剂溶液驱动的注射泵，B为用于样品或流动相驱动的注射泵，C1为荧光衍生试剂溶液通道，C2为流动相通道，1为荧光试剂溶液储液池，2为流动相储液池，3为废液池，4为荧光检测点(即在该处进行荧光采集，荧光检测点距离2个通道的交叉口至少1cm)。

【具体实施方式】：

实施例1.

首先将模板分子L-苯丙氨酸0.1mmol超声溶解在0.20g二甲基亚砜中，加入致孔剂(环己醇1.00g)，功能单体4-乙烯基吡啶0.4mmol，相互作用1小时以形成复合物，再加入交联剂EDMA 4mmol、引发剂AIBN 22mg，溶液经过超声脱气5min，通氮气除氧15min，然后将此溶液充满流控芯片通道中，用黑色纸盖住不需光照的微通道部分，只留下1cm长度的微通道，在365nm紫外光照下聚合48小时。将制得的分子印迹整体柱与注射泵连接，分别用甲醇、甲醇/水(80:20，v/v)溶液冲洗除去致孔剂和模板分子得到分子印迹整体柱1。

实施例2.

加入致孔剂(环己醇0.20g和十二醇0.80g)，其它同实施例1，可得到分子印迹整体柱2。

实施例3.

加入致孔剂(环己醇0.40g和十二醇0.60g)，其它同实施例1，可得到分子印迹整体柱3。

实施例4.

加入致孔剂(环己醇0.60g和十二醇0.40g)，其它同实施例1，可得到分子印迹整体柱4。

实施例5.

首先将模板分子L-苯丙氨酸0.1mmol超声溶解在0.20g二甲基亚砜中，加入致孔剂(环己醇1.00g)，功能单体4-乙烯基吡啶0.6mmol，相互作用1小时以形成复合物，再加入交联剂EDMA4mmol、引发剂AIBN22mg，溶液经过超声脱气5min，通氮气除氧15min，然后将此溶液充满流控芯片通道中，用黑色纸盖住不需光照的通道部分，只留下1cm长度的通道，在365nm紫外光照下聚合48小时。将制得的分子印迹整体柱与注射泵连接，分别用甲醇、甲醇/水(70：20，v/v)溶液冲洗除去致孔剂和模板分子得到分子印迹整体柱5。

实施例6.

加入致孔剂(环己醇0.10g和十二醇0.90g)，其它同实施例5，可得到分子印迹整体柱6。

实施例7.

加入致孔剂(环己醇0.70g和十二醇0.30g)，其它同实施例5，可得到分子印迹整体柱7。

实施例8.

加入致孔剂(环己醇0.50g和十二醇0.50g)，其它同实施例5，可得到分子印迹整体柱8。

实施例9.

将分子印迹整体柱1连接到注射泵中，将10微升的2×10^-6mol·L^-1L-苯丙氨酸溶液在注射泵的驱动下流经分子印迹整体柱，流速2μL·min^-1，同时利用另一台注射泵驱动1×10^-4mol·L^-1的荧光试剂NBD-F溶液与穿过分子印迹整体柱的L-苯丙氨酸反应，到达检测点，利用激光诱导荧光检测器进行检测，通过计算流经分子印迹整体柱前后的L-苯丙氨酸质量差，就可以得到分子印迹的富集效率，当富集后，利用洗脱液洗脱分子印迹柱，同时进行荧光检测，就可以检测到洗脱下来的L-苯丙氨酸的量，从而可以进一步计算L-苯丙氨酸在整体柱上的洗脱率。通过以上实验，制得的分子印迹整体柱1对L-苯丙氨酸的富集效率可达到82％，洗脱率达到99％。并且，从样品富集到洗脱整个分析检测时间只需要10分钟。