一种新型PRRS病毒受体及该受体的阻断抑制剂

摘要

本发明涉及一个新型PRRS病毒的细胞受体，即非肌肉肌球蛋白II型重连A(nonmuscle myosin heavy chain II－A，NMHC II－A)蛋白以及非肌肉肌球蛋白II型(nonmuscle myosin II)的抑制剂－blebbistatin，作为抑制PRRS病毒感染细胞的药物。本发明提供了一种利用纯化的NMHC II－A蛋白和人工合成的多肽及其blebbistatin抑制PRRS病毒感染细胞的方法。本发明还提供了利用NMHC II－A蛋白和多肽产生的抗体。这种通过纯化得到的NMHC II－A蛋白或人工合成方法获得的多肽及其blebbistatin以及抗NMHC II－A蛋白和抗多肽抗体都对PRRS病毒感染细胞有抑制活性，可开发成防治PRRS病毒感染的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及发现一个新型PRRS病毒细胞受体以及利用受体蛋白和多肽及其衍生物进行对PRRS病毒感染的防治，属于生物学领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and res piratory syndrome，PRRS)又名蓝耳病，是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种猪的急性传染病。PRRSV侵入宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合。利用细胞内吞作用而感染易感细胞(Nauwynck，HJ，Duan X，Favoreel HW，etc.J.Gen.Virol.1999，80：297-305)，如MA-104和PAM。到目前为止已报道的四个独立但功能相关的PRRSV细胞受体，它们是唾液酸粘附素(Sialoadhesin)(Vanderheijden N，Delputte PL，Favoreel HW，etc.J.Virol.2003，77：8207-8215)，似肝磷脂蛋白(Heparinlike)(Delputte PL，Vanderheijden N，Nauwynck，HJ，etc.J.Virol.2002，76：4312-4321)，波形蛋白(Vimentin)(Kim JK，Fahad AM，Shanmukhappa K，etc.J.Virol.2006，80：689-696)，清道夫受体(CD163)蛋白(Calvert JG，Slade DE，Shields SL，etc.J.Virol.2007.81：7371-7379)。但是还存在有其他的PRRSV细胞受体，这些受体均可结合或参与结合PRRSV感染易感细胞，从而引起蓝耳病。因此，通过对PRRSV的研究，依然会不断的有新的病毒受体出现，从而扩大研究的范围。

发明内容

本发明涉及一个新型PRRSV的细胞受体，同时提供了一种利用纯化的NMHCII-A蛋白和人工合成的多肽及其blebbistatin作为受体阻断剂，抑制PRRSV感染细胞的方法，同时可以作为受体阻断剂的还有利用NMHC II-A蛋白和多肽免疫小鼠所得的抗体。上述的各种阻断剂都对PRRSV感染细胞有抑制活性，可开发成防治PRRSV感染的药物。

申请人利用模拟PRRSV的GP5膜抗原的单克隆抗独特型抗体首先从非洲绿猴肾细胞系(MA-104)和猪肺巨噬细胞(PAM)上分离和提纯出一个可溶性蛋白(Zhou EM，Xiao YH，Shi YF，etc.J.Virol.Methods.2008，149：300-308)。

利用这个模拟PRRSV GP5抗原的单克隆抗独特性抗体，申请人发现了一个新的PRRSV细胞受体，经过分析其氨基酸序列所得该受体为即非肌肉肌球蛋白II型重连A(nonmuscle myosin heavy chain II-A，NMHC II-A)蛋白，其蛋白的羧基端的氨基酸序列为Seq ID No：1所示。

同时发现了该受体阻断和抑制剂，它们是NMHC II-A蛋白、NMHC II-A多肽、抗NMHC II-A蛋白和多肽抗体，以及非肌肉肌球蛋白II型(nonmuscle myosinII，NMM-II)抑制剂，即(+)-blebbistatin：是NMM-II的选择性抑制剂[(±)-或(-)-blebbistatin]的无活性的对映异构体。其中：

(a)NMHC II-A蛋白，蛋白的羧基端的氨基酸序列为Seq ID No：1所示；

(b)NMHC II-A人工多肽，其氨基酸序列为Seq ID No：2所示；

(c)NMHC II-A人工多肽，其氨基酸序列为Seq ID No：3所示；

(d)NMHC II-A人工多肽，其氨基酸序列为Seq ID No：4所示；

上述病毒受体及受体阻断和抑制剂，所针对的PRRSV主要包括经典美洲株(代表毒株为VR-2332)，中国分离株(代表毒株为Ch-1a)，以及高致病性毒株(代表毒株为JXA-1)。

而上述的非肌肉肌球蛋白II型(nonmuscle myosin II，NMM-II)抑制剂：(+)-blebbistatin与NMM-II反应而阻断PRRSV经典美洲株、中国分离株，以及高致病性毒株感染细胞。与(±)-或(-)-blebbistatin不同的是，(+)-blebbistatin不抑制细胞依赖NMM-II的细胞分裂和增殖(Straight AF，Cheung A，Limouze J，etc.Science.2003，299：1743-1747)。而(±)-blebbistatin一直是脊椎动物细胞上NMM-II ATP酶活性的选择性抑制剂，而由于发明人将NMHC II-A蛋白作为了PRRSV受体，同时经发明人的长期试验，发现(+)-blebbistatin是可以作为阻断PRRSV感染细胞的受体阻断剂，这在之前的研究中也一直未见应用。

其病毒受体非肌肉肌球蛋白II型重连A(nonmuscle myosin heavy chainII-A，NMHC II-A)蛋白的具体分离及鉴定过程为：

利用模拟PRRSV GP5膜抗原的单克隆抗体独特型抗体从MA-104和PAM细胞中提纯出一个可溶性蛋白(Zhou EM，Xiao YH，Shi YF，et al.J.Virol.Methods，2008，149：300-308)；50μg上述可溶性蛋白用7.5％ SDS-PAGE分离，分离出的蛋白用胃蛋白酶水解，水解片段经微毛细管高压液相层析分离，将分离片段用纳米电喷射离子化，经离子捕获质谱仪分析。将获得的水解片段序列与GenBank氨基酸序列库对比获得受体蛋白为非肌肉肌球蛋白II型重连A(NMHC II-A)。

上述(b)或(c)或(d)人工多肽的合成，具体方法是：根据NMHC II-A重连的氨基酸序列，用DNA Star软件分析序列的抗原表位，设计出20个多肽序列，通过固相多肽合成方法合成多肽，合成的多肽通过MBS或戊二醛方法与载体蛋白匙孔虫戚血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)偶联。同时利用上述合成的人工多肽通过PRRSV阻断试验，证明了NMHC II-A羧基端内的23个氨基酸为PRRSV结合区域，因此羧基端具有与序列表中Seq ID No：1一致的蛋白，可以作为病毒的受体并作为相应的阻断剂。

NMHC II-A蛋白和多肽-KLH偶联产物与铝佐剂混合免疫小鼠产生抗NMHCII-A蛋白和多肽抗体，可采用腹腔免疫小鼠的方法制得，也可采用其他的抗体制备方法制得该血清抗体。如：与其它佐剂混合，采用肌肉或皮下免疫方法制得。具体的免疫方法可采用现有生物学中的免疫方法。

综上所述，由于发明人将羧基端具有与序列表中Seq ID No：1一致的蛋白，特别是非肌肉肌球蛋白II型重连A(nonmuscle myosin heavy chain II-A，NMHCII-A)蛋白作为了PRRSV受体，因此与之相关的上述的各种物质，均可以都对PRRSV感染细胞有抑制活性，可开发成防治PRRSV感染的药物。从而为PRRS的研究和防治提供了一个全新的思路，扩大了研究的范围，对于实际生产有着极为重要的意义。

具体实施方式

实施例1 新型PRRSV细胞受体的发现和鉴定

利用模拟PRRSV GP5膜抗原的单克隆抗体独特型抗体从MA-104和PAM细胞中提纯出一个可溶性蛋白(Zhou EM，Xiao YH，Shi YF，et al.J.Virol.Methods，2008，149：300-308)：50μg可溶性蛋白用7.5％SDS-PAGE分离，分离出的蛋白用胃蛋白酶水解，水解片段经微毛细管高压液相层析分离，将分离片段用纳米电喷射离子化，经离子捕获质谱仪分析。将获得的水解片段序列与GenBank氨基酸序列库对比获得受体蛋白为非肌肉肌球蛋白II型重连A(NMHCII-A)。

实施例2 NMHC II-A人工多肽合成

根据NMHC II-A重连羧基端序列制定的多肽序列通过固相多肽合成方法合成多肽，具体方法是：

将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂与DMF混合振荡30-60min进行树脂溶涨；通过沙芯抽滤掉DMF，加入3倍摩尔过量C端第一个氨基酸与树脂连接，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30-60min；去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液，反应5-15min；取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min对反应物进行检测。依次用DMF、甲醇和DMF洗涤两次。通过下列方法之一对连接产物进行缩合。

方法a：加入三倍过量的溶于DMF的保护氨基酸(FOMC-Asp-OH)和HBTU，再加入十倍过量的NMM，反应30-60min；

方法b：加入三倍过量的溶于DMF的保护氨基酸(FOMC-Asp-OH)和HOBt，再加入三倍过量的DIC，反应30-60min。

之后依次用DMF、甲醇和DMF洗涤两次。重复以上步骤，依次连接序列中的氨基酸。最后一个氨基酸连接后，依次用DMF、甲醇、DMF和DCM洗涤两次，抽干10-20min。用切割液(TFA 94.5％，水2.5％，EDT 2.5％，TIS 1％)切割120min将多肽从树脂上切割出来，用氮气吹干，用乙醚洗六次，常温挥干。粗制的多肽用纯水或者加少量乙腈溶解，按照下列条件用HPLC纯化多肽。层析柱为VenusiMRC-ODS C18，30 x 250mm；A泵溶液为0.1％的Trifluoroacetic溶于100％的纯水；B泵溶液为0.1％的trifluoroacetic溶于100％的acetonitrile。最后将纯化后的多肽冻干保存-20度保存。

或通过其它方法也可合成多肽，如利用tert-butoxy-carbonyl或9-fluorenylmethoxycarbonyl的固相合成方法(Merrifield RB.J.AM.Chem.Soc.，1963，85：2149-2154；Chang CD and Merenhofer J.Int.J.Pept.ProteinRes.1978，11：246-249)。

实施列3 多肽与载体蛋白匙孔虫戚血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)偶联

每个多肽通过下列方法之一与KLH偶联：

(1)MBS(M-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide)偶联剂偶联：5mg KLH用1mL PBS(0.1M，pH6.0)溶解，加入50uL DMSO(含1mg MBS)反应1小时，反应产物用HPLC分离，加入5mg多肽，反应3小时，真空冷冻干燥制得。

(2)戊二醛偶联：5mg KLH溶于去离子水，加入一定量的戊二醛以及5mg多肽，反应5-6小时，用碳酸氢钠和碳酸钠缓冲液透析24小时，真空冷冻干燥制得。

实施例4 抗NMHC II-A蛋白和人工多肽抗体的制备

蛋白和多肽-铝佐剂制备：NMHC II-A蛋白或多肽-KLH偶联产物溶于0.005MPBS，pH 6.2(终容积10mL)，缓慢加入溶于0.005M PBS(pH 6.2)的硫酸钾铝(比例为50μg蛋白/0.4mg铝)，调升pH至6.8-7.3，搅拌2小时，离心800g 10分钟，蛋白-铝佐剂沉淀用生理盐水洗涤一次，用0.1M的PBS溶解制得。蛋白和多肽也可与其它佐剂使用，如：福氏佐剂。

免疫程序：每只小鼠经腹腔免疫50μg NMHC II-A蛋白或人工多肽，共免疫三次，采集小鼠血清检测和鉴定抗体。抗NMHC II-A蛋白或人工多肽的抗体也可使用其它动物(如：家兔，山羊等)以及采用其它途径免疫(如：肌肉或皮下)。产生抗体的小鼠也可利用其脾脏通过细胞融合制备单克隆抗体。

实施例5 NMHC II-A蛋白、人工合成多肽及抗体的鉴定

间接ELISA法：首先，NMHC II-A蛋白及各个多肽用PBS(0.01M，pH7.2)包被ELISA板，每孔200ng，4C过夜。ELISA板用PBS-T(PBS含0.5％体积的Tween-20)洗涤3次后，用封闭液(2.5％浓度的脱脂奶粉溶于PBS-T，200μl/孔)封闭1小时，洗涤3次，每孔加入稀释的小鼠血清反应1小时，洗涤3次，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG反应1小时，洗涤3次，每孔加入100μl HRP底物(TMB)反应15分钟，每孔加入50μl 1M硫酸终止反应，用酶标仪在450nm下读取每孔的OD值。检测结果见表1和表2。小鼠免疫之前的血清作为阴性对照血清，免疫后小鼠血清的OD值大于阴性对照的3倍则为阳性。由表1结果证实NMHC II-A蛋白具有免疫原性，血清抗体具有与NMHC II-A蛋白结合特性，其抗体效价可以达到1:100000。同时，这些血清抗体可以与人工合成多肽结合，其抗体效价可以达到1:10000。由表2结果证实人工合成的3个多肽所免疫的小鼠不但可以结合免疫用的多肽，还可以结合NMHC II-A蛋白，其抗体效价可以达到1:10000。

表1.抗NMHC II-A血清抗体的鉴定结果

表2-1.抗人工多肽(Seq ID No：2)血清抗体的鉴定结果

表2-2.抗人工多肽(Seq ID No：3)血清抗体的鉴定结果

表2-3.抗人工多肽(Seq ID No：4)血清抗体的鉴定结果

间接免疫荧光(IFA)法：将3次免疫后的小鼠抗NMHC II-A蛋白及抗多肽抗体血清稀释后与MA-104和PAM单层细胞结合0.5-2小时，用荧光标记的羊抗鼠IgG检测抗体与细胞的结合，检测结果见表3。由表3结果证实血清抗体具有与细胞结合特性，其抗体效价可以达到1:320。

表3.血清抗体结合MA-104和PAM细胞的间接免疫荧光检测结果

实施例6 NMM-II抑制剂(blebbistatin)对细胞的作用

(±)-blebbistatin是脊椎动物细胞上NMM-II ATP酶活性的选择性抑制剂，它抑制细胞卵裂沟的收缩，快速和可逆阻断细胞起泡，阻断细胞迁移以及胞质分裂(Straight AF，Cheung A，Limouze J，etc.Science.2003，299：1743-1747)。(-)-blebbistatin是(±)-blebbistatin的活性对映异构体，(+)-blebbistatin是(±)-blebbistatin的无活性对映异构体。Marc-145细胞和PAM(10⁵个细胞/ml)培养于DMEM培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50μg/ml，庆大霉素50μg/ml，10％小牛血清)中，37℃，5％CO₂培养箱中培养成单层。将(±)-blebbistatin，(S)-(-)-blebbistatin和(R)-(+)-blebbistatin(购自美国Tocris Cookson公司)溶解于DMSO中，再用PBS倍比稀释，加入单层细胞培养板，连续培养并观察细胞病变(CPE)。CPE在普通显微镜下观察所见为细胞表面粗燥，折光性强，最后细胞脱落。由表4结果表明(±)-blebbistatin和(S)-(-)-blebbistatin抑制细胞增殖并造成CPE。然而，(R)-(+)-blebbistatin不抑制细胞增殖，无CPE。因此(+)-blebbistatin可作为PRRSV受体阻断剂。

表4.Blebbistatin对MA-104和PAM细胞的作用结果

实施例7 PRRSV受体阻断试验

Marc-145细胞和PAM(10⁵个细胞/ml)培养于DMEM培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50μg/ml，庆大霉素50μg/ml，10％小牛血清)中，37℃，5％CO₂培养箱中培养成单层。将采用实施例1、2、4的方法得到的NMHC II-A蛋白、人工合成的多肽、血清抗体以及(+)-blebbistatin溶于DMEM培养基中，过滤除菌后与固定浓度(10³TCID₅₀/ml)的不同毒株的PRRSV混合孵育1小时后，加入上述细胞中，每个稀释度做8个重复，37℃吸附1小时后，去掉混合物，加入DMEM培养基，连续培养，每天观察CPE。PRRSV感染细胞所致的CPE表现为细胞表面粗燥，折光性强，最后细胞脱落。表5所示结果为NMHC II-A蛋白、人工合成的多肽、血清抗体以及(+)-blebbistatin在每孔浓度依次为μg、μg、μL和μM时抑制CPE的程度。判断细胞CPE的指标如下：“-”代表无CPE；“+”代表25％的细胞出现CPE；“++”代表50％的细胞出现CPE；“+++”代表75％以上的细胞出现CPE。由表5结果表明NMHC II-A蛋白和人工合成多肽(Seq ID No：2，3，4)在2μg-100μg/孔、抗NMHCII-A蛋白和抗人工合成多肽的血清在5μL-100μL/孔以及(+)-blebbistatin在2μM-100μM/孔都可以完全抑制PRRSV对细胞造成的CPE；说明NMHC II-A蛋白及其衍生物能够阻断PRRSV感染细胞，可用于开发防治PRRSV的药物。

表5.PRRSV受体阻断试验结果

<110>山东农业大学

<120>一种新型PRRS病毒受体及该受体的阻断抑制剂

<160>4

<210>1

<211>23

<212>PRT

<213>Porcine reproductive and respi ratory syndrome virus

<400>1

Gly Ala Gly Asp Gly Ser Asp Glu Glu Val Asp Gly Lys Ala Asp Gly

1               5                  10                 15

Ala Glu Ala Lys Pro Ala Glu

               20

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>人工多肽

<400>2

Gly Ala Gly Asp Gly Ser Asp Glu Glu

1               5

<210>3

<211>14

<212>PRT

<213>人工多肽

<400>3

Gly Ala Gly Asp Gly Ser Asp Glu Glu Val Asp Gly Lys Ala

1               5                  10

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>人工多肽

<400>4

Lys Ala Asp Gly Ala Glu Ala Lys Pro Ala Glu

1               5                  10