焦谷酰胺基小肽的合成方法

摘要

焦谷酰胺基小肽的合成方法，涉及一种焦谷酰胺基小肽的合成方法。提供一种原料价廉易得、产率高、后处理简单、更适合大规模生产的焦谷酰胺基小肽的合成方法。在装有回流冷凝管的25mL容器中加入10mmol焦谷酰胺基环缩二氨酸、20～30mmol氨基酸或小肽和20～30mmol碱的有机溶剂反应，将混合物在0～70℃搅拌反应过夜，减压浓缩后，柱层析纯化，得焦谷酰胺基小肽，产率20％～85％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种焦谷酰胺基小肽的合成方法，包括以焦谷氨酸为原料一步合成二聚焦谷氨酸，再在碱存在下，在有机溶剂中与氨基酸或小肽反应得到相应的焦谷酰胺基小肽。

背景技术

二肽传统的合成方法是采用二环己基碳二亚胺(DCC)缩合。早在1986年S.A.Andronati等(Andronati，S.A.；Mazurov，A.A.；Korotenko，T.I.，Khimiya Prirodnykh Soedinenii，1986，2，222-224)就用二环己基碳二亚胺(DCC)作缩合剂在N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)存在下合成焦谷酰胺基组氨酸二肽。这种方法的产率较高，文献报道最高可达90％，但是反应产生的副产物二环己基脲(DCU)会给后处理带来麻烦。

由于传统的合成法后处理麻烦，C.H.Kwon等(Kwon，C.H.；Nagasawa，H.T.；DeMaster，E.G.；Shirota，F.N.，J.Med.Chem.1986，29，1922-1929)用焦谷氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)反应制得焦谷氨酸丁二酰亚胺酯从而活化焦谷氨酸的羧端，与亮氨酸苄酯反应，再脱除苄基保护基得到焦谷氨酸亮氨酸二肽，总产率约78％。

J.J.Wen等(Wen，J.J.；Crews，C.M.，Tetrahedron Lett.1998，39，779-782)则在全合成中采用N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)作缩合剂，在1-羟基苯并三唑(HOBt)的存在下反应引入焦谷酰胺基，产率80％。

B.Liang等(Liang，B.；Vera，M.D.；Joulli.M.M.，J.Org.Chem.2000，65，4762-4765)在他们的全合成中采用五氟苯酚活化焦谷氨酸从而引入焦谷酰胺基，产率67％，总产率不高。

A.P.Smimova等(1、Smirnova，A.P.；Krasnoshchekova，S.P.；Nikitina，A.M.；Shvachkin，Y.P.，Pharm.Chem.J.2001，35，393-394；2、Smirnova，A.P.；Funtova，S.M.；Knyazeva，V.V.；Shvachkin，Y.P.，Pharm.Chem.J.2001，35，437-438.)在合成促甲状腺素释放素类似物的片断焦谷氨酸丝氨酸二肽时采用了五氯苯酚活化焦谷氨酸的羧端，三乙胺作碱，与丝氨酸甲酯反应，再脱甲基得到焦谷氨酸丝氨酸二肽，总产率约70％。此法反应步骤较多，副产物难以除去，还需改进。

R.Jain等(1、Jain，R.；Singh，J.；Perlman，J.H.；Gershengorn，M.C.，Bioorg.Med.Chem.2002，10，189-194；2、Kaur，N.；Monga，V.；Josan，J.S.；Lu，X.P.；Gershengorn，M.C.；Jain，R.，Bioorg.Med.Chem.2006，14，5981-5988)在合成促甲状腺素释放素类似物的片断焦谷酰胺基组氨酸二肽时则采用以2，4，5-三氯苯酚活化焦谷氨酸的羧端，与组氨酸甲酯反应得到焦谷氨酸组氨酸甲酯，再脱甲基的合成方法，反应总产率小于60％。该法在制备2，4，5-三氯苯基酯时采用二环己基碳二亚胺(DCC)法制备，同样会有二环己基脲(DCU)生成。

W.J.Zhang等(Zhang，W.J.；Berglung，A.；Kao，Jeff L.-F.；Couty，J.P.；Gershengorn，M.C.；Marshall，G.R.，J.Am.Chem.Soc.2003，125，1221-1235)采用了2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATu)作为缩合剂在1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)和N，N’-二异丙基乙胺存在下合成焦谷氨酸组氨酸甲酯，再脱甲酯得到焦谷氨酸组氨酸二肽的方法，此法产率不高(53％)。采用的缩合剂价格昂贵，不适合大规模工业化。

比较先前的方法不难看出，几乎所有的合成方法都需要经过焦谷氨酸羧端的活化同时保护另一个氨基酸的羧端。因此，需要一种原料价廉易得、产率高、后处理简单、更适合大规模生产的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的焦谷酰胺基小肽合成方法需要经过焦谷氨酸羧端的活化同时保护另一个氨基酸的羧端等问题，提供一种原料价廉易得、产率高、后处理简单、更适合大规模生产的焦谷酰胺基小肽的合成方法。

本发明的技术方案是包括以焦谷氨酸为原料一步合成二聚焦谷氨酸，再在碱存在下，在有机溶剂中与氨基酸或小肽反应得到相应的焦谷酰胺基小肽。

本发明的合成路线如下：

              R＝氨基酸侧链

其具体步骤为：

在装有回流冷凝管的25mL容器中加入10mmol焦谷酰胺基环缩二氨酸、20～30mmol氨基酸或小肽和20～30mmol碱的有机溶剂反应，将混合物在0～70℃搅拌反应过夜，减压浓缩后，柱层析纯化，得焦谷酰胺基小肽，产率20％～85％。

所述焦谷酰胺基小肽为N端是焦谷酰胺基的小肽。

所述小肽为任意氨基酸和任意小肽。

所述碱为任意的有机碱和无机碱，适合的有机碱包括三乙胺或二异丙基乙胺等，适合的无机碱包括碳酸氢盐，或碱金属和碱土金属的碳酸盐等，优选三乙胺。

所述有机溶剂为任意的有机溶剂，适合的有机溶剂包括三氟乙醇(TFE)、二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等中的至少一种，优选为三氟乙醇(TFE)。

所述反应的温度最好为40～50℃。

本发明反应生成相应的焦谷酰胺基氨基酸或焦谷酰胺基小肽。

本发明不仅适合于形成任意焦谷酰胺基小肽，而且适合于含有侧链氨基的氨基酸或小肽的侧链氨基，因为本领域的技术人员知道，很多保护基可用于并且适合用于这种情况。

焦谷酰胺基氨基酸可以使用常用的多肽缩合试剂进行肽链延长，比如：DCC，HOSu，HOBt，氯甲酸叔丁酯，氯甲酸异丙酯，氯甲酸乙酯，三苯基膦-全卤代烃等。

与现有的方法相比，本发明具有以下突出的优点：

1、可以广泛应用到各种焦谷酰胺基小肽的合成；

2、反应不用保护氨基酸的羧端和活泼的侧链，避免了保护脱保护造成的产率损失；

3、反应不用特别的缩合剂，比以往的合成方法更经济；

4、操作简单(两步完成)，不需要超低温或者超高温；

5、副产物少，后处理简单。

具体实施方式

以下将用实施例更详细地描述发明，而且其目的仅仅在于说明本发明，而不是对其进行限制。

实施例1：在装有回流冷凝管的25mL圆底烧瓶中加入1.04g(4.68mmol)焦谷酰胺基环缩二氨酸，0.75g(10mmol)甘氨酸，10mL三氟乙醇和1.38mL(10mmol)三乙胺。将混合物在70℃加热搅拌过夜。减压浓缩后，柱层析纯化(洗脱剂为异丙醇∶乙腈∶氨水＝10∶10∶1)，得1.48g白色L-焦谷氨酸-甘氨酸二肽固体，产率85％。¹H NMR(D₂O)：δ(ppm)2.06-2.15(1H，m)，2.35-2.47(2H，m)，2.48-2.58(1H，m)，3.82(2H，s)，4.35(1H，dd，J＝9.04Hz，5.28Hz)；¹³CNMR(D₂O)：δ(ppm)25.0，29.2，42.6，57.1，174.9，175.6，182.4；ESI-MS(m/z)：187[M+H]⁺，209[M+Na]⁺。

实施例2：L-焦谷氨酸-β-丙氨酸二肽(L-pGlu-β-Ala-OH)：在装有回流冷凝管的25mL圆底烧瓶中加入1.04g(4.68mmol)焦谷酰胺基环缩二氨酸，0.89g(10mmol)β-丙氨酸，7mL三氟乙醇和1.74mL(10mmol)二异丙基乙胺。将混合物在0℃加热搅拌过夜。减压浓缩后，柱层析纯化(洗脱剂为异丙醇:乙腈:氨水＝10:10:1)，得1.11g无色黏稠状L-焦谷氨酸-β-丙氨酸二肽，产率59％。¹H NMR(D₂O)：δ(ppm)1.98-2.07(1H，m)，2.32-2.42(2H，m)，2.44-2.54(1H，m)，2.46(2H，t，J＝6.72Hz)，3.43(2H，t，J＝6.32Hz)，4.26(1H，dd，J＝9.04Hz，5.20Hz)，4.41(1H，dd，J＝8.24Hz，5.00Hz)；¹³C NMR(D₂O)：δ(ppm)25.2，29.3，35.2，36.1，57.1，174.8，178.4，182.3；ESI-MS(m/z)：201[M+H]⁺，223[M+Na]⁺。

实施例3：L-焦谷氨酸-L-天冬氨酸二肽(L-pGlu-L-Asp-OH)：在装有回流冷凝管的25mL圆底烧瓶中加入1.04g(4.68mmol)焦谷酰胺基环缩二氨酸，1.33g(10mmol)天冬氨酸，20mL三氟乙醇和2.76g(20mmol)碳酸钾。将混合物在40℃加热搅拌过夜。减压浓缩后，柱层析纯化(洗脱剂为异丙醇:乙腈:氨水＝5:5:1)，得0.75g白色L-焦谷氨酸-L-天冬氨酸二肽固体，产率33％。¹H NMR(D₂O)：δ(ppm)2.01-2.09(1H，m)，2.34-2.40(2H，m)，2.44-2.55(1H，m)，2.88(1H，d，J＝17.00Hz，7.36Hz)，2.96(1H，d，J＝17.02Hz，5.08Hz)，4.32(1H，dd，J＝9.06Hz，4.88Hz)，4.74(1H，dd，J＝6.94Hz，5.48Hz)；¹³C NMR(D₂O)：δ(ppm)25.1，29.2，35.4，49.2，56.8，173.9，174.4，174.8，182.3；ESI-MS(m/z)：245[M+H]⁺，267[M+Na]⁺。

实施例4：L-焦谷氨酸-L-天冬氨酸双甲酯2d(L-pGlu-L-Asp(OMe)₂)：在装有回流冷凝管的25mL圆底烧瓶中加入1.04g(4.68mmol)焦谷酰胺基环缩二氨酸，1.98g(10mmol)天冬氨酸甲酯盐酸盐，10mL二甲亚砜和1.38mL(10mmol)三乙胺。将混合物在50℃加热搅拌过夜。减压浓缩后，柱层析纯化(洗脱剂为乙酸乙酯:甲醇＝25:1)，得0.92g白色L-焦谷氨酸-L-天冬氨酸二肽双甲酯固体，产率35％。¹H NMR(D₂O)：δ(ppm)2.07-2.12(1H，m)，2.36-2.44(2H，m)，2.50-2.61(1H，m)，2.97(1H，d，J＝16.90Hz，7.36Hz)，3.04(1H，d，J＝16.78Hz，3.36Hz)，3.72(3H，s)，3.78(3H，s)，4.36-4.38(1H，m)，4.85-4.88(1H，m)；¹³C NMR(D₂O)：δ(ppm)25.1，29.1，35.2，49.1，52.5，53.2，56.7，172.2，172.8，174.8，182.2；ESI-MS(m/z)：295[M+Na]⁺。

实施例5：L-焦谷氨酸-L-丝氨酸二肽(L-pGlu-L-Ser-OH)：在装有回流冷凝管的25mL圆底烧瓶中加入1.04g(4.68mmol)焦谷酰胺基环缩二氨酸，1.05g(10mmol)丝氨酸，10mLN，N-二甲基甲酰胺和1.38mL(10mmol)三乙胺。将混合物在40℃加热搅拌过夜。减压浓缩后，柱层析纯化(洗脱剂为异丙醇:乙腈:氨水＝10:10:1)，得0.40g白色L-焦谷氨酸-L-丝氨酸二肽固体，产率20％。¹H NMR(D₂O)：δ(ppm)2.07-2.16(1H，m)，2.35-2.46(2H，m)，2.48-2.55(1H，m)，3.83(1H，d，J＝11.58Hz，5.84Hz)，3.87(1H，d，J＝11.54Hz，4.08Hz)，4.31(1H，dd，J＝5.76Hz，4.08Hz)，4.38(1H，dd，J＝9.00Hz，5.16Hz)；13C NMR(D₂O)：δ(ppm)25.0，29.3，57.0，57.1，61.8，174.5，175.7，182.3；ESI-MS(m/z)：216[M+H]⁺，239[M+Na]⁺。

实施例6：L-焦谷氨酸-L-苏氨酸二肽(L-pGlu-L-Thr-OH)：在装有回流冷凝管的25mL圆底烧瓶中加入1.04g(4.68mmol)焦谷酰胺基环缩二氨酸，1.07g(9mmol)苏氨酸，2mL三氟乙醇10mL二甲亚砜的混合溶液，2.7mL(20mmol)三乙胺。将混合物在30℃加热搅拌过夜。减压浓缩后，柱层析纯化(洗脱剂为异丙醇:乙腈:氨水＝10:10:1)，得1.68g白色L-焦谷氨酸-L-苏氨酸二肽固体，产率78％。¹H NMR(D₂O)：δ(ppm)1.17(3H，d，J＝6.44Hz)，2.09-2.17(1H，m)，2.36-2.46(2H，m)，2.48-2.61(1H，m)，4.19(1H，d，J＝3.88Hz)，4.26(1H，qd，J＝6.44Hz，4.04Hz)，4.41(1H，dd，J＝8.94Hz，5.00Hz)；¹³C NMR(D₂O)：δ(ppm)19.2，25.1，29.3，57.2，60.3，67.8，174.7，176.3，182.4；ESI-MS(m/z)：231[M+H]⁺，253[M+Na]⁺。

实施例7：L-焦谷氨酸-L-组氨酸二肽(L-pGlu-L-His-OH)：在装有回流冷凝管的25mL圆底烧瓶中加入1.04g(4.68mmol)焦谷酰胺基环缩二氨酸，1.40g(9mmol)组氨酸，5mL三氟乙醇的10mLN，N-二甲基甲酰胺混合溶液，3.00g(30mmol)碳酸氢钾。。将混合物在50℃加热搅拌过夜。减压浓缩后，柱层析纯化(洗脱剂为异丙醇:乙腈:氨水＝5:5:2)，得2.14g白色L-焦谷氨酸-L-组氨酸二肽固体，产率86％。¹H NMR(D₂O)：δ(ppm)1.87-1.95(1H，m)，2.27-2.41(2H，m)，2.44-2.53(1H，m)，3.03(1H，dd，J＝15.14Hz，8.96Hz)，3.22(1H，dd，J＝15.12Hz，4.72Hz)，4.27(1H，dd，J＝9.12Hz，4.68Hz)，4.51(1H，dd，J＝8.92Hz，4.96Hz)，7.07(1H，s)，8.08(1H，s)；¹³C NMR(D₂O)：δ(ppm)25.1，28.2，29.1，54.4，57.0，117.2，131.6，134.6，174.1，176.9，182.3；ESI-MS(m/z)：267[M+H]⁺，289[M+Na]⁺。

实施例8：向250mL圆底烧瓶中加入2.66g(10mmol)L-焦谷氨酸-L-组氨酸二肽，1.15g(10mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和100mL N，N-二甲基甲酰胺，搅拌溶解。0℃下加入2.47g(12mmol)二环己基碳二亚胺。搅拌30min后加入1.14g(10mmol)L-脯氨酰胺，混合物自然升至室温反应48h。反应结束后，过滤除去白色不溶物，滤液减压浓缩后，柱层析纯化(洗脱剂为氯仿:甲醇:氨水＝40:10:1)，得2.32g白色L-焦谷氨酸-L-组氨酸-L-脯氨酰胺固体，产率64％。¹H NMR(D₂O)：δ(ppm)1.81-1.87(1H，m)，1.92-2.25(3H，m)，2.27-2.33(1H，m)，2.35-2.43(2H，m)，2.47-2.57(1H，m)，3.04(1H，dd，J＝14.26Hz，8.00Hz)，3.14(1H，dd，J＝14.80Hz，6.40Hz)，3.50-3.57(1H，m)，3.80-3.85(1H，m)，4.33(1H，dd，J＝9.06Hz，4.60Hz)，4.42(1H，dd，J＝8.56Hz，5.28Hz)，4.93(1H，dd，J＝7.68Hz，6.80Hz)，7.04(1H，s)，7.74(1H，s)；¹³C NMR(D₂O)：δ(ppm)24.6，25.2，28.1，29.1，29.5，48.0，51.8，56.7，60.6，117.2，132.7，136.2，171.5，174.5，176.9，182.3；ESI-MS(m/z)：363[M+H]⁺，385[M+Na]⁺。