公开/公告号CN101443361A
专利类型发明专利
公开/公告日2009-05-27
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申请/专利权人 艾斯巴技术股份公司;
申请/专利号CN200780017546.6
申请日2007-04-27
分类号
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人罗菊华
地址 瑞士施利伦
入库时间 2023-12-17 22:01:59
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-08-19
授权
授权
2010-01-13
专利申请权、专利权的转移(专利申请权的转移) 变更前: 变更后: 登记生效日:20091211 申请日:20070427
专利申请权、专利权的转移(专利申请权的转移)
2009-07-22
实质审查的生效
实质审查的生效
2009-05-27
公开
公开
相关信息
本申请要求于2006年4月28日提交的美国临时专利申请No. 60/795,831的优先权，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
在此，在本说明书的全文中所引用的任何专利、专利申请以及参 考文献的内容均以引用方式全文并入本文。
技术领域
本发明涉及人ALK(间变性淋巴瘤激酶)的特异性抗体，特别涉 及scFv、编码scFv的核酸序列、scFv的制备方法以及scFv作为药物 或诊断目的的用途。所述抗体适用于肿瘤或癌症、特别是成胶质细胞 瘤的局部治疗。
背景技术
ALK(间变性淋巴瘤激酶，CD246)是受体酪氨酸激酶(RTK) 家族中的一员。作为该家族中具有代表性的一员，ALK是一种基本上 由3个结构域构成的I型跨膜蛋白，所述的3个结构域为：胞外配体 结合结构域(氨基酸19-1038)，其包含1个LDL受体A类结构域和 2个MAM结构域(MAM：跨膜肽酶、A5抗体、蛋白质酪氨酸磷酸 酶μ)；跨膜结构域(氨基酸1039-1059)；以及细胞质结构域(氨基 酸1060-1620)，其包含酪氨酸激酶结构域。信号肽存在于新生蛋白 质的N-末端(氨基酸1-18)，其在分泌时被切断。
在1997年，由2个独立的研究组(Iwahara 1997和Morris 1997) 克隆出了人和小鼠的ALK全长序列。ALK与被称为白细胞酪氨酸激 酶(LTK)的RTK高度相似，并且属于胰岛素受体超家族。在ALK 与LTK的重叠区域中，表现出57％的氨基酸一致性，71％的氨基酸 相似性(Morris 2001)。ALK是高度N-糖基化的，并且包含21个公 认的N-糖基化位点。氨基酸687-1034与LTK具有明显的相似性(其 中氨基酸的一致性达到50％)。但是，在N-末端的第686位附近的氨 基酸序列中，除了一段非常短的序列曾在LDL受体中发现以外，其他 序列都没有显示出与任何已知的蛋白质具有同源性(Duyster 2001/SWISSPROT)。此外，ALK在氨基酸264-427和氨基酸478-636 处含有2个MAM结构域(跨膜蛋白、A5抗体、蛋白质酪氨酸磷酸酶 μ)。由于这些结构域广泛分布在涉及细胞与细胞间的相互作用中的 多种附着蛋白质中，所以被认为具有附着功能(De Juan 2002)。此 外，在对应于氨基酸396-406处为推定的ALK的配体结合位点(Stoica 2001，参见下文)。鼠ALK的激酶结构域的氨基酸序列与人ALK的 氨基酸具有98％的一致性，与小鼠LTK的氨基酸具有78％的一致性， 与小鼠ros具有52％的一致性，与人胰岛素样生长因子受体具有47％ 的一致性，与人胰岛素受体具有46％的一致性(Iwahara 1997和 Ladanyi 2000)。到目前为止，还没有关于ALK剪接变体的描述。但 是，ALK通常与染色体的易位有关(参见下文)。
ALK基因跨越大约315kb，并具有26个外显子。该基因的大部 分由2大段内含子构成，该内含子跨越大约170kb。ALK转录本的长 度为6.5kb(Kutok 2002)。根据Morris，ALK的cDNA跨越6226bp (Morris 2001)。
在小鼠胚胎发育过程中的发育阶段的大约E11天，开始了ALK 的表达，并且持续到发育的新生儿时期，在新生儿时期，ALK在神经 系统中表达。在成人中，ALK的生理学表达局限于CNS的某些神经 元(神经及神经胶质细胞以及可能的内皮细胞)区域低水平表达 (Morris 1997，Duyster 2001，Stoica 2001)。事实上，ALK的富集 程度在出生后发生降低(Morris 2001)。基于ALK的表达模式，提 示了在脑发育过程中的受体的作用(Duyster 2001)。ALK的神经限 制性表达提示，其起到了神经营养因子的受体的作用(参见下文)。 与上文所述的情况相一致，ALK的表达模式与编码神经营养蛋白受体 的TRK家族的基因重叠(Morris 2001)。但是，敲除了ALK基因的 小鼠没有显示出任何明显的表现型(没有公开的数据)，这可能是由 于与TRK家族的成员或其他神经营养受体具有某些功能上的冗余所 致。明显的是，造血组织显示出无可检测到的ALK的表达(参见下 文)(Morris 2001)。
最近，已经描述了2种可能的ALK配体：“多效生长因子”(PTN) 和“中期因子”(MK)(Stoica 2001，Duyster 2001，Stoica 2002)。 通过使用纯化的人多效生长因子蛋白来筛选噬菌体展示肽文库来鉴定 了PTN-ALK间的相互作用。通过这种方法，确定了ALK存在于胞 外结构域中的序列(氨基酸396-406)。重要的是，该序列并非与LTK (其为与ALK最密切相关的RTK)共有。此外，在果蝇的ALK的 潜在的同源染色体中，所述的配体结合区域是保守的(Loren 2001)。 ALK通过与PTN结合而被快速磷酸化(Bowden 2002)。此外，已经 表明，在细胞培养中使用多效生长因子来刺激ALK。根据多效生长因 子所具有的病理含义，使用该多效生长因子来刺激ALK使得多效生 长因子/ALK间的相互作用特别引人关注(Stoica 2001)。此外，缺少 ALK表达的细胞系未能显示出对多效生长因子产生生长应答，反之亦 然(Stoica 2001)。在体内，已经证明在患有各种固体肿瘤的患者血 清中，多效生长因子的含量增高，并且动物研究表明，多效生长因子 有助于肿瘤的生长(Stoica 2001)。在动物模型中，充分地确定了PTN 作为肿瘤生长中起限速作用的血管生成因子的作用(Choudhuri 1997)。1996年，Czubayko等人(Czubayko 1996)证明了PTN在 肿瘤血管发生以及在防止凋亡和转移(通过采用核酶靶向方法来调节 PTN的含量而实现)中的重要性。小鼠PTN的血清含量测量值证明 了其与肿瘤的大小之间存在着明显的关系。PTN在最恶性的人类癌症 种类(例如黑色素瘤和胰腺癌)的某些癌症中具有重要的作用，因此 对ALK抑制剂的其他潜在的应用产生了另人关注的前景(Weber 2000，Stoica 2001)。在人类患者中，在患有胰腺癌(n＝41，P<.0001) 和结肠癌(n＝65，P＝.0079)的患者中，发现血清多效生长因子的 水平增高。在健康个体中，在围生期的器官生长过程中以及在成人的 神经元和神经胶质的选择性群体中，PTN以严格受调节的方式被表达 出来。
如在多种癌症的细胞系中发现的那样，PTN与ALK共表达，这 表明它们可以形成刺激生长的自分泌环(Stoica 2001)。尽管获得了 全部这些数据，但是文献说明，对于PTN的作用是否只受到ALK的 调节和/或受到其他未确定的PTN受体的调节，仍然还不清楚(Duyster 2001)。已经提出了至少2种其他可能的PTN受体：受体酪氨酸磷酸 酶RPTPβ和N-多配体硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。但是，RPTPβ可能起 到PTN/ALK信号传导的信号传导调节剂的作用，而N-多配体蛋白聚 糖起到了用于配体的分子伴侣的作用(Bowden 2002)。
最近，与多效生长因子相关的被称为中期因子(MK)的另一种 分泌型生长因子已经被鉴定出作为用于ALK的第二配体。与PTN相 似，MK的结合和活化功能(例如，在细胞培养中诱导软琼脂上的菌 落形成)能够被抗ALK-ECD的相同的抗体所阻断(Stoica 2001)。 类似于多效生长因子，中期因子在许多肿瘤中是受到正调控的，尽管 其生理表达非常局限于成人的正常组织中(Stoica 2002)。对47例膀 胱肿瘤样品的分析表明，其MK的表达比正常的膀胱组织中MK的表 达显著增强(大约4倍)。此外，这种显著的过表达与低的患者生存 率有关(O′Brien 1996)。
然而，MK与ALK的亲和力比多效生长因子之一与ALK的亲和 力低大约5倍(Stoica 2002)。有趣的是，如与多效生长因子，通过 核酶抑制ALK还会抑制MK在细胞培养中的作用(Stoica 2002)。 这些研究的作者还得出这样的结论：对PTK/MK/ALK途径的抑制作 用开创了用于治疗多种疾病的非常值得关注的可能，其中所述多种疾 病中的一些疾病(例如，成胶质细胞瘤和胰腺癌)到目前为止还具有 极其有限的治疗选择(Stoica 2002)。
在健康个体中，ALK mRNA的表达在新生儿时期达最高峰，并 且在成人神经系统的一些有选择的部分中持续。最近，还在与神经元 和配体细胞相关的内皮细胞中检测到了ALK蛋白质的表达。所描述 的多效生长因子的至少一部分恶性活性是通过ALK来调节的证据得 自通过核酶靶向方法排除ALK的表达的实验。这种ALK的排除阻止 了多效生长因子刺激的抗凋亡蛋白Akt的磷酸化，并使得接受了异种 移植物的小鼠的存活期延长。事实上，当ALK的表达被排除后，肿 瘤移植物中的凋亡细胞的数目显著增多(Powers 2002)。
所描述的MK的恶性活性是通过ALK调节的证据得自使用了针 对ALK ECD的单克隆抗体的实验。加入得自2种抗ALK ECD抗体 的杂交瘤细胞上清液的1:25的稀释液导致SW-13细胞在软琼脂上的 菌落形成显著减少(Stoica 2002)。对10种不同的细胞系进行分析表 明，对PTN产生生长应答的能力完全与ALK mRNA的表达有关(以 下细胞系对PTN产生应答并发现有ALK mRNA表达：HUVEC、 NIH3T3、SW-13、Colo357、ME-180、U87、MD-MB 231，Stoica 2001)。 有趣的是，在一些癌细胞系(Colo357胰腺癌、Hs578T乳癌和U87 成胶质细胞瘤)中，PTN和ALK共表达，这表明PTN和ALK形成 了刺激生长的自分泌环(Stoica 2001)。
有趣的是，PTN和MK都已经显示出能引起抗凋亡的bcl-2蛋白 质产生转录正调控(Stoica 2002)。此外，活化的Akt(其为异常ALK 信号传导的重要的下游靶物)使被称为bad的促凋亡因子磷酸化，由 此导致从bc1 x 1分离，当从bad上释放下来时，其能够通过阻断细胞 色素c的释放来抑制凋亡(参见Bowden 2002以用于参考)。
ALK的异常表达可能涉及若干种癌症的发生。但是，其首先与高 度恶性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)的亚类(即，所谓的间变性大细胞 淋巴瘤(ALCL))有关。非霍奇金淋巴瘤代表了源于淋巴源的多种细胞 的克隆性瘤形成。
大多数患有ALCL的原发性全身性临床亚型的患者具有t2，5易 位，从而表达出将核磷蛋白(NPM)的N-末端连接到ALK的C-末端 的融合蛋白。所述的融合蛋白由NPM的氨基酸1-117与ALK的氨基 酸1058-1620融合形成，并且染色体的断裂位点位于编码TM与ALK 的近膜结构域的外显子之间的内含子中(Duyster 2001)。NPM-ALK 是含有2040bp的ORF的转录本，其编码了含有680个氨基酸的蛋白 质(Morris 2001)。这与NPM的跨越911bp的内含子4和ALK的 跨越2094bp的内含子16的断裂位点相应(Kutok 2002)。最可能的 是，所述融合蛋白中的ALK序列是导致ALCL的蛋白质所需的最短 序列(Duyster 2001)。反转的融合蛋白(即，ALK-NPM)不能被表 达，至少不能在淋巴细胞中表达(Kutok 2002)。野生型NPM蛋白 质显示出普遍存在的表达情况，并且起到了蛋白质在由细胞质进入核 仁过程中的载体的作用。事实上，NPM为染色体5编码的38kDa的 核内蛋白，其含有NLS，能够与核内蛋白质结合并进行细胞质/细胞核 的运输(Duyster 2001)。NPM是最丰富的核仁蛋白质之一，并且通 常以六聚体的形式存在(Morris 2001)。最重要的是，NPM通常发 生自寡聚化(形成六聚体)，以及与NPM-ALK发生异源寡聚化 (Duyster 2001)。2，5易位使得在染色体2上编码酪氨酸激酶的ALK 基因部分处于染色体5上强的NPM启动子的控制之下，从而使得嵌 合的NPM-ALK蛋白质(p80)永久表达(Duyster 2001)。因此， ALK激酶失去调控，并且在细胞种类(淋巴细胞)和细胞的各部分(细 胞核/核仁以及细胞质)中产生异位(Ladanyi 2000)。NPM的定位 (细胞质或细胞核)似乎不会影响其对淋巴瘤生成的影响(Duyster 2001)。所得的异常的酪氨酸激酶活性通过对细胞内靶物的组成型磷 酸化而引发恶变。其他多种稀有的ALK融合蛋白也与ALCL有关。 所有的变体都表明ALK酪氨酸激酶结构域与调节其表达的备择的启 动子相连。
已经报道，全长的ALK还在大约92％的初级成神经细胞瘤细胞 以及一些横纹肌肉瘤中被表达出来(Lamant 2000)。但是，到目前 为止，已经证明ALK的表达与肿瘤生物学之间不具有相关性。上述 这些事实，以及缺乏关于这些肿瘤中内源磷酸化的ALK的有效水平 的证据，提示ALK在成神经细胞瘤中的表达反映了其在未成熟神经 细胞中的正常表达，而非主要的致瘤作用，并且在这些肿瘤中ALK 没有被组成型磷酸化，因此对ALK在这些肿瘤中的重要作用提出质 疑(Duyster 2001，Pulford 2001)。然而，如Miyake等人(其曾经 发现在由成神经细胞瘤衍生出的细胞系中，由于基因扩增而导致ALK 过表达以及组成型磷酸化)提出的那样，ALK信号传导可能在至少某 些成神经细胞瘤中是重要的(Miyake 2002)。但是，其他由成神经细 胞瘤衍生出的细胞系没有显示出ALK的组成型活化，由此对ALK的 普通病理牵连产生争论(Dirks 2002，Pulford 2004)。
最有趣的是，ALK对于多形性成胶质细胞瘤的生长似乎是重要 的，所述的多形性成胶质细胞瘤是一种高度恶性的脑肿瘤，对于该疾 病，仅提出了极其有限的治疗选择(Powers 2002)。在这些破坏性的 肿瘤中，已经显示出发生了多种基因改变，包括PTEN、p53和 INK4a-ARF的缺失或突变。此外，RTK信号传导在所述这些肿瘤的 生长和形成过程中起到了特别重要的作用，这种RTK信号传导使得 诸如PDGF、HGF、NGF和VBGF之类的多种生长因子过表达，提 示存在自分泌RTK信号传导环。Powers等人已经示出，在成胶质细 胞瘤患者的肿瘤样品中存在ALK的mRNA和蛋白质表达，但在正常 的邻近的脑组织中没有检测到所述的信号(Powers 2002)。此外，在 异种移植物的研究中，人U87MG成胶质细胞瘤细胞(该细胞得自患 者，并且代表了经良好表征的、用于研究成胶质细胞瘤中的肿瘤发生 和信号传导的模型系统)显示出ALK依赖的抗凋亡行为。当通过使 用核酶来排除所述肿瘤细胞中的ALK时，注入所述这些肿瘤细胞的 小鼠存活的时间是注入野生型肿瘤细胞的小鼠的存活时间的至少2 倍，并且所述这些肿瘤细胞显示出急剧加快的凋亡过程。因此，ALK 及其配体提供了基本的生存信号，该生存信号用于对体内U87MG细 胞的肿瘤生长进行限速(Powers 2002)。这些发现表明，对ALK信 号传导进行抑制能够成为用于改善成胶质细胞瘤患者的预期寿命的有 前途的方法。
多形性成胶质细胞瘤是到目前为止最常见且最恶性的原发性神 经胶质肿瘤，其发生率为约2/100’000/y(在美国和西欧每年大约15′000 例)。多形性成胶质细胞瘤最先影响大脑半球，而且还能影响脑干(主 要见于儿童中)或脊髓。所述肿瘤可以从头(原发性成胶质细胞瘤) 显现或者可以从低级星形细胞瘤(继发性成胶质细胞瘤)发展而来。 原发性成胶质细胞瘤和继发性成胶质细胞瘤显示出很少的分子重复， 并且在分子水平上构成了不同的疾病实体。它们都含有许多基因异常， 包括p53、EGFR、MDM2、PDGF、PTEN、p16和RB的影响。
近25年来，没有取得明显的治疗进步。多种治疗方法仅仅起缓 解作用，并可以将患者的预期寿命延长3个月至1年。患者通常呈现 出进程缓慢的神经功能缺损(例如运动障碍)、以及颅内压症状(例 如，头痛、恶心、呕吐、认知障碍或癫痫)。性格改变也可能是早期 征兆。成胶质细胞瘤的病原学是未知的，家族性病例仅代表了不到1％ 的情况。所确定的唯一一致的危险因素是暴露于石化产品。其诊断主 要通过成像研究(CT，NMR)和活组织检查来进行。将大多数的成 胶质细胞瘤完全分期是不切实际的也是不可能的，这是因为这些肿瘤 不具有被清楚定义的边界。更好的是，这些成胶质细胞瘤在发生局部 入侵以及在沿着致密的脑白质途径扩散时呈现出熟知的趋势。不可能 进行根治的主要原因是因为当这些肿瘤被诊断出来时其已经超出了进 行局部控制的范围。主要的化学治疗剂为卡莫司汀(一种烷基化试剂) 和顺铂，但是仅有40％的患者显示出一定程度的反应。
虽然关于ALK在成胶质细胞瘤中的作用具有相当的不确定性， 但是这种疾病为定向于ALK的药物提供了不同的途径。事实上，对 于这种破坏性的疾病，即使在当前的治疗选择中取得一小步的进步， 也能够为大量的医疗需要提供服务。重要的是，应该注意由于成胶质 细胞瘤细胞表达了全长的ALK，所以为了治疗这种癌症，ALK不仅 可被认为是用于诱导肿瘤细胞凋亡的小分子的激酶抑制剂的靶物，而 且被认为是用于诱导肿瘤细胞凋亡的抗体和/或抗体片段(例如，scFv) 的靶物。如果成胶质细胞瘤能够被有效地传递到CNS中(由于区室化 而使得成胶质细胞瘤没有被快速清除，此外，由于与IgG相比，成胶 质细胞瘤的体积更小，使得肿瘤的渗透情况更好)，那么成胶质细胞 瘤向CNS的精确定位便支持scFv的用途。抗体和/或抗体片段能够定 向于ALK的配体结合序列(氨基酸396-406)，或者定向于受体胞外 部分的其他部分。
ALK在处于生理条件下的健康组织中的非常有限的表达表明，不 管ALK是否涉及这些肿瘤的发病机理，表达ALK的肿瘤都可能是使 用放射性或毒素标记的抗体和/或抗体片段来对所述疾病进行治疗的 优异的靶物。除了成胶质细胞瘤细胞外，已经在黑色素瘤细胞系和乳 癌细胞系中发现了ALK(其没有被组成型磷酸化)的表达，这具有重 大意义(Dirks 2002)。ALK胞外域的大部分在人类的蛋白质组中是 相当独特的事实会使所述方法具有高度的特异性。
WO 9515331/US5529925公开了对人核酸序列的克隆和测序，其 中所述人核酸序列在人t(2；5)淋巴瘤中发生的t(2；5)(p23；q35)染色体 易位事件中被重排。发现，所述重排过程将位于染色体5q35上的核仁 磷蛋白基因(NPM基因)序列重排到位于染色体2p23上的之前未确 定的蛋白酪氨酸激酶基因(以下简称ALK基因)序列上。也公开了 融合基因和融合蛋白(分别为NPM/ALK融合基因或融合蛋白)的序 列。
全长的ALK序列在题为“Human ALK Protein Tyrosine Kinase” 的US5770421中被授予专利权。此外，题为“Method of detecting a chromosomal rearrangement involving a breakpoint in the ALK or NPM gene”的专利US6174674B1公开了用于检测患者样品中的 NPM-ALK融合序列的引物。在另一份专利申请中，题为“ALK protein tyrosine kinase/receptor and ligands thereof”的US6696548公开了 ALK用于检测ALK配体和与ALK的特定序列结合的抗体的用途。 该专利文献还公开了鉴定能够与分离的ALK多肽相结合的试剂的方 法。WO 0196394/US 20020034768公开了ALK作为多效生长因子的 受体。US 20040234519公开了抗多效生长因子的抗体，WO 2006020684描述了多效生长因子的检测。
发明内容
因此，本发明的总体目标是提供一种稳定且可溶的抗体或抗体衍 生物，该抗体或抗体衍生物在体外和体内能够与人ALK蛋白质结合。 最优选的是，所述抗体特异性地靶向ALK的配体结合结构域(氨基 酸396-406)，因此将阻断MK(其与ALK的Kd为约170pM)的生 物学作用和PTN(其与ALK的Kd为约20-30pM)的生物学作用 (Stoica 2002，Stoica 2001)。在优选的实施方案中，所述抗体或抗 体片段为scFv抗体或Fab片段。在下文中，术语抗体包括全长的抗 体以及其他抗体衍生物。
目前，为了实现上述目标以及本发明的其他目标(这些目标将随 着描述的进行而更容易变得显而易见)，所述抗体可通过以下特征来 表征：所述抗体包含其序列与序列SEQ.ID.No.2具有至少50％的一 致性的可变的重链CDR3。优选的是，所述的序列的一致性为至少 60％、65％、75％和85％，或者更优选的为至少92％。最优选的是， 所述的抗体具有序列SEQ.ID.No.2所示的VH CDR3.
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分特异性地与 ALK蛋白质的独特的抗原表位结合。所述抗原表位位于ALK蛋白质 的氨基酸(例如)1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、 300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、 650-700、700-750、750-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、 1200-1300、1300-1400、1400-1500或1500-1620之间，或者在其任何 间隔的部分或范围内。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原的结合 部分特异性地与抗原表位结合，其中所述抗原表位包含跨越ALK蛋 白质(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基391±3和406±3(SEQ.ID No： 91，示出了人ALK蛋白质的氨基酸残基388-409)的、优选为跨越氨 基酸残基391-406(SEQ ID NO：1)的区域；或者基本上由跨越ALK 蛋白质(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基391±3和406±3(SEQ.ID No： 91，示出了人ALK蛋白质的氨基酸残基388-409)的、优选为跨越氨 基酸残基391-406(SEQ ID NO：1)的区域构成；或者为跨越ALK蛋 白质(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基391±3和406±3(SEQ.ID No： 91，示出了人ALK蛋白质的氨基酸残基388-409)的、优选为跨越氨 基酸残基391-406(SEQ ID NO：1)的区域的片段。应该理解的是， 所示出的范围不应该被认为是明确的界限，而应该被认为所述的抗体 或其抗原结合部分可以结合或部分结合在与ALK的配体结合结构域 邻近的区域内或在ALK的配体结合结构域内。优选的是，所述抗体 或抗体衍生物与ALK蛋白质的、长度为10至20个氨基酸的抗原表 位结合。
在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分可以表征为以小 于约10 x 10-6M的KD与ALK蛋白质特异性地结合。在一个独特的实 施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分以至少为约10 x 10-7M、至 少为约10 x 10-8M、至少为约10 x 10-9M、至少为约10 x 10-10M、至 少为约10 x 10-11M、或至少为约10 x 10-12M，或者甚至更为有利的 KD与ALK蛋白质(或其片段)特异性地结合。
在多种其他实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分包含这样 的可变的重链区域，该可变的重链区域包含与在SEQ ID NO：4中所 列出的可变的重链区域的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、 98％，或者更优选具有至少99％的一致性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分包含这样的可 变的轻链区域，该可变的轻链区域包含与在SEQ ID NO：5中所列出 的可变的轻链区域的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、 98％，或者更优选具有至少99％的一致性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分既包含可变的 重链区域又包含可变的轻链区域，其中所述的可变的重链区域包含与 在SEQ ID NO：4中所列出的可变的重链区域的氨基酸序列具有至少 80％、85％、90％、95％或98％，或者更优选具有至少99％的一致性 的氨基酸序列；所述的可变的轻链区域含有包含与在SEQ ID NO：5 中所列出的可变的轻链的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％ 或98％，或者更优选具有至少99％的一致性的氨基酸序列。
在某些其他实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分特异性地 与抗原表位结合，其中所述的抗原表位与被ESBA521(Seq.ID.No. 19)抗体或抗体衍生物结合的抗原表位相重叠，和/或所述的抗体或其 抗原结合部分与ESBA521抗体或抗体衍生物竞争结合ALK蛋白质或 其一部分。在相关的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分特异 性地与抗原表位结合，其中所述的抗原表位含有ALK蛋白质的残基 391-406(SEQ ID NO：1)，或ALK蛋白质的一部分。
所述抗体或其抗原结合部分的可变的重链和轻链区域通常含有 一个或多个互补性决定区(CDR)。这些互补性决定区包括CDR1、 CDR2和CDR3区域。在独特的实施方案中，所述的可变的重链CDR 与ESBA521抗体的CDR具有至少80％、85％、90％、95％，或更优 选具有100％的一致性。在其他独特的实施方案中，可变的轻链CDR 与ESBA521抗体的可变的轻链区域的CDR具有至少80％、85％、 90％、95％，或更优选具有100％的一致性。
因此，本发明的独特的抗体或其片段含有：可变的重链区域，其 含有与ESBA521的可变的重链区域的CDR具有至少80％、85％、90％ 和95％，或更优选具有100％的一致性的一个或多个互补性决定区 (CDR)；可变的轻链区域，其含有与ESBA521抗体的可变的轻链 区域的CDR具有至少80％、85％、90％、95％，或更优选具有100％ 的一致性的一个或多个CDR。
所述的抗体或其抗原结合部分的可变的重链区域还可以含有与 ESBA521抗体的可变的重链区域的CDR具有至少80％、85％、90％ 和95％，或更优选具有100％的一致性的所有3个CDR；和/或与 ESBA521抗体的可变的轻链区域的CDR具有至少80％、85％、90％、 95％，或更优选具有100％的一致性的所有3个CDR。
在本发明的另一个实施方案中，所述的抗体或其抗原结合部分含 有(a)由人VH基因(例如，H3类型)编码或得到(即，基因的产 物)的重链可变区；和/或含有(b)由人Vκ或λ基因(例如，γ型) 编码或得到的轻链可变区。
本发明的抗体包括全长的抗体(例如，单克隆抗体，其含有效应 结构域(例如，Fc结构域))以及抗体部分或其片段(例如单链抗体 和Fab片段)。所述抗体还可以与多种治疗剂(例如，抗癌剂、化疗 剂或毒素)和/或标记(例如，放射性标记)连接。
在另一个方面中，本发明的特征在于这样的分离的核酸，该核酸 含有编码与SEQ ID NO：22具有至少75％、80％、85％、90％、95％， 或更优选具有至少99％的一致性的抗体重链可变区的序列。本发明的 特征还在于这样的分离的核酸，该核酸含有编码与SEQ ID NO：21 具有至少75％、80％、85％、90％和95％，或更优选具有至少99％ 的一致性的抗体轻链可变区的序列。
本发明的特征还在于表达载体，该表达载体包括之前所述的单独 的核酸或者这些核酸的组合(例如，由1个载体或多个载体表达)中 的任何一种形式，以及含有所述这些表达载体的宿主细胞。
用于表达本发明的抗体的合适的宿主细胞包括多种真核细胞(例 如，酵母细胞)、哺乳动物的细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、 NS0细胞和骨髓瘤细胞)或植物细胞。本发明的分子还可以在原核细 胞(例如，E.coli)中表达出来。
本发明的特征还在于用于通过在宿主细胞中使编码抗体的核酸 (例如，编码抗体的抗原结合部分的核酸)表达来制备所述抗体或其 抗原结合部分的方法。在另一方面中，本发明的特征在于含有上文所 述核酸的杂交瘤或转染瘤。
在另一实施方案中，本发明提供了这样的抗原，该抗原含有ALK 蛋白质的抗原表位，优选PTN配体结合结构域，更优选包含跨越氨基 酸残基391±3和406±3(见SEQ ID NO：91，显示人ALK蛋白的氨 基酸残基388-409)最优选氨基酸391-406(SEQ ID NO：1)的区域 的片段；或基本上由跨越氨基酸残基391±3和406±3(见SEQ ID NO： 91，显示人ALK蛋白的氨基酸残基388-409)最优选氨基酸391-406 (SEQ ID NO：1)的区域构成的片段；或为跨越氨基酸残基391±3 和406±3(见SEQ ID NO：91，显示人ALK蛋白的氨基酸残基388-409) 最优选氨基酸391-406(SEQ ID NO：1)的区域的片段的片段。所述 抗原可用于引起抗ALK的抗体的产生、对抗ALK的抗体进行筛选或 对抗ALK的抗体的存在情况进行检测，或者可以在主动免疫治疗中 用作试剂，即，用作疫苗。
所述抗原可以作为疫苗单独使用或者与合适的佐剂或半抗原组 合(例如，混合的或以化学或基因工程方法接合的)使用。当将所述 抗原用于主动免疫治疗时，该抗原还可以与被动免疫治疗组合(例如， 与本文所公开的任何抗ALK的抗体组合)使用，或者与抗ALK的抗 体的单克隆或多克隆制剂(例如，得自血清反应阳性供应者的血清丙 种球蛋白)组合使用。
在另一实施方案中，所述的抗体分子(或VL和VH的结合结构 域)是完全人源的。使用人单克隆抗体对人进行治疗具有许多优点。 例如，所述抗体在人体中可能要比非人源抗体在人体中具有更小的免 疫原性。所述的治疗方法还是快速的，这是因为一旦所述抗体到达癌 症位点(在该位点处，ALK被表达出来)，可发生ALK失活。因此， 在相关的实施方案中，所述抗体为scFv抗体(即，ESBA521)，或含 有ESBA521的VL和/或VH区域(或其CDR，例如，VL CDR3(SEQ ID NO：3)和/或VH CDR3(SEQ ID NO：2))的抗体。
与非人抗体相比，人抗体在人体中还可以更有效地定位于合适的 位点。此外，所述治疗剂是特异性地针对ALK的，是经过重组及高 度纯化，与传统的治疗不同，所述治疗剂能够避免被外来试剂污染的 可能。可供选用的是，本发明的抗体和抗体衍生物可以通过化学合成 方法制备。
在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症(或是用于制备 起所述作用的药物)的组合物，该组合物通过与诸如中期因子(MK) 和/或多效生长因子(PTN)之类的ALK配体竞争并由此阻断由所述 配体介导的ALK信号传导来预防受试者的瘤形成。所述组合物可单 独给药，或者与本领域认可的抗癌剂(例如，甲氨蝶呤等)组合给药。
本发明的抗体和/或ALK疫苗可单独使用或者与已知的治疗剂 (例如，抗癌剂，如氨甲蝶呤等)组合使用。
本发明的其他特征和优点将通过以下的发明详述和权利要求而 变得显而易见。
附图简要说明
在思考了下文给出的发明详述后，将会更好地理解本发明，并且 除了上文列出的目标以外的其他目标也将变得显而易见。所述的发明 详述参考了附图，其中：
图1示出了所用的人ALK蛋白质的图。PTN结合位点(虚线所 示)的16个氨基酸肽在用于scFv结合体的双杂交筛选中被用作抗原 表位。
图2示出了为了获得作为第二结合体的ESBA521和作为第三结合 体的一组scFv而对VH CDR3、VL CDR3和VH CDR2部分所进行的 逐步随机化(参见表1)。X代表任意的氨基酸残基。
图3示出了ELISA实验，其中将经改良的scFv的结合特征与它 们所发源而来的框架的结合特征做比较。
图4示出了用ESBA521(左图)和多克隆ALK特异性抗体(右 图)瞬时转染的HeLa细胞的免疫染色图。中图：光学显微镜下的同 一细胞。
图5示出了将ESBA521与经改良的第三结合体相比较的ELISA 实验。
发明详述
为了可以更容易地理解本发明，首先定义一些术语。
定义
术语“ALK”和“Alk-1”包括由ALK(间变性淋巴瘤激酶)基因编 码的人ALK蛋白质，该蛋白质为跨膜蛋白酪氨酸激酶(PTK)/受体。
术语“抗体”是指全抗体和任意的抗原结合片段(即，“抗原结合部 分”、“抗原结合多肽”或“免疫结合体”)或其单链。“抗体”是指包含由 二硫键相连接的至少2条重链(H)和2条轻链(L)的糖蛋白，或其 抗原结合部分。每条重链都由重链可变区(在本文中简写为VH)和重 链恒定区。重链恒定区由3个结构域构成，分别为CH1、CH2和CH3。 每条轻链都由轻链可变区(在本文中简写为VL)和轻链恒定区。轻链 恒定区由1个结构域构成，其为CL。VH和VL区可以进一步细分为被 称为互补性决定区(CDR)的高变区，该高变区分散在更保守的被称 为框架区(FR)的区域中。每条VH和VL都由3个CDR和4个FR 构成，并从氨基末端向羧基末端按照以下的次序排列：FR1、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区都含有与抗 原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主 的组织或因子的结合，其中所述的宿主的组织或因子包括免疫系统的 多种细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一成分(Clq)。
术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指一个或 多个保持了与抗原(例如，ALK)的特异性结合能力的抗体片段。已 经表明，全长抗体的片段可执行抗体的抗原结合功能。涵盖在术语抗 体的“抗原结合部分”范围内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段， 其为由VL、VH、CL和CH1结构域构成的一价片段；(ii)F(ab′)2片 段，其为包含由二硫键在铰链区连接的2个Fab片段的二价片段；(iii) Fd片段，其由VH和CH1结构域构成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂 上的VL和VH结构域构成；(v)单个结构域或dAb片段(Ward et al.， (1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域构成；以及(vi)分离 的互补性决定区(CDR)或(vii)可以可选地由合成的连接子连接的 2个或多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的2个结构域(VL和VH)由单独的基因所编码，但是可以采用重组方法通过合成的连接 子将它们连接起来，其中所述的合成的连接子能够将所述的2个结构 域被制备成单一一条蛋白质链，在该蛋白质链中，VL和VH区成对， 从而形成单价分子(已知为单链Fv(scFv)；例如参见Bird et al.(1988) Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85：5879-5883)。认为，这种单链抗体也被涵盖在术语抗体的“抗 原结合部分”中。可以采用本领域的技术人员已知的常规技术来获得上 述这些抗体的片段，并且与完整的抗体相同的方式对这些片段进行筛 选来以进行利用。可以通过重组DNA技术或对完整的免疫球蛋白进 行酶切或化学裂解来制备抗原结合部分。抗体可以是不同型的，例如 IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、 IgE或IgM抗体。
术语“框架”是指本领域的技术人员所公认的存在于更加趋异的 CDR区域之间的抗体可变区的部分。所述的框架区域通常是指框架1 至4(FR1、FR2、FR3和FR4)，并且在三维空间中提供了用于支持 在重链或轻链抗体可变区中发现的3个CDR的支架结构，这样CDR 能够形成抗原结合表面。当这种框架提供了用于呈递更加趋异的CDR 的支持时，其还可以被称为支架。诸如锚蛋白重复序列和纤连蛋白之 类的免疫球蛋白超家族的其他CDR和框架也可以用作抗原结合分子 (还可参见例如美国专利No.6,300,064和6,815,540，以及美国专利公 开No.20040132028)。
术语“抗原表位”或“抗原决定簇”是指在抗原上免疫球蛋白或抗体 特异性地结合的位点(例如，ALK，如人ALK-1的氨基酸残基391-406 (参见例如SEQ ID NO：1))。抗原表位在独特的空间构象中通常包含 至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。例 如参见Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology， Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特定地结 合”是指抗体与预定抗原上的抗原表位结合。通常，抗体以大约小于 10-7M(例如大约小于10-8M、10-9M或10-10M，或者更小)的亲和力 (KD)结合。
术语“KD”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常， 本发明的抗体以小于约10-7M(例如小于约10-8M、10-9M或10-10M， 或者更小)的解离平衡常数(KD)来与ALK结合，其中所述的解离 平衡常数可以利用(例如)表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE 装置中测定。
术语“中和ALK”、“抑制ALK”和“阻断ALK”可互换使用，这些 术语是指本发明的抗体防止ALK与1种或多种目标配体相互作用的 能力以及(例如)防止ALK引发信号转导的能力。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单 链的或双链的，但是优选双链DNA。当核酸与另一核酸序列处于功能 关系中时，所述核酸可被“可操作地连接”。例如，当启动子或增强子 影响编码序列的转录时，其使启动子或增强子与所述序列可操作地连 接。
就核酸而言，术语“基本同源”是指当将2段核酸或其指定的序列 进行最佳比对和对比时，这2段核酸或其指定的序列都具有适当的核 苷酸插入或缺失，并且它们的核苷酸的一致性至少为约80％、通常至 少为约90％至95％、更优选至少为约98％至99.5％。可供选用的其 他方式是，当所述片段在选择性杂交条件下与互补链发生杂交时，则 存在基本的同源性。所述的杂交条件是本领域已知的，并且在(例如) Sam-book等人的文献中有所描述，参见下文。
考虑到为了对2条序列进行最佳比对而需要引入的间隙的数量以 及每个间隙的长度，则2条序列之间所达到的一致性的百分比为相同 位置被所述的2条序列所共有的数量的函数。可以采用数学算法来进 行序列的对比和2条序列之间所达到的一致性的百分比的确定，这将 在下文的非限定性实施例中进行描述。
利用NWSgapdna.CMP矩阵，以及为40、50、60、70或80的间 隙权值和为1、2、3、4、5或6的长度权值，利用GCG软件包中的 GAP程序，可以确定2条核苷酸序列之间所达到的一致性的百分比。 此外，还可以利用被引入到ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和 W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法，再利用PAM120残基 权值表(weight residue table)并采用间隙长度罚12分、间隙罚4分， 来确定2条核苷酸或核酸序列之间所达到的一致性的百分比。此外， 可以利用被并入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch (J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法，再利用Blossum62矩阵或 PAM250矩阵并采用为16、14、12、10、8、6或4的间隙权值以及为 1、2、3、4、5或6的长度权值，来确定2条氨基酸序列之间所达到 的一致性的百分比。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，从而对 照公共数据库进行搜索，以便(例如)识别相关序列。可以利用Altschul 等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0 版)进行所述的搜索。可以使用NBLAST程序、分值＝100且字长＝12 来进行BLAST核苷酸搜索，从而得到与本发明的核酸分子同源的核 苷酸序列。可以使用XBLAST程序、分值＝50且字长＝3来进行BLAST 蛋白质搜索，从而得到与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为 了得到带有间隙的比对以用于进行对比，按照Altschul等人的(1997) Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述的方式来使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序 (例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
本发明还涵盖了在本发明的SEQ ID NO中列出序列的“保守序列 的修改序列”，即，核苷酸和氨基酸序列的修改序列，该修改序列没有 消除由所述的核苷酸序列编码或含有所述氨基酸序列的抗体与抗原的 结合能力。所述的这种保守序列的修改序列包括核苷酸和氨基酸的取 代、加入和删除。例如，所述的修改序列可以通过诸如定点突变和PCR 介导的突变之类的本领域已知的标准技术来引入。保守的氨基酸的取 代包括这样的取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代 替。在本领域中，已经对具有相似侧链的氨基酸残基家族做出定义。 这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组 氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有 不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的 氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙 氨酸、甲硫氨酸)，具有β侧枝的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异 亮氨酸)，以及具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸、组氨酸)。因此，优选的是，人抗ALK的抗体中的预知的 非必须氨基酸残基被来自具有相同侧链家族的另一氨基酸残基所代 替。用于鉴别其不会消除抗原结合能力的核苷酸和氨基酸保守取代基 的方法是本领域的技术人员所公知的(例如参见：Brummell等人， Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人.Protein Eng.12(10)： 879-884(1999)；和Burks等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417 (1997))。
可供选用的其他方式是，在另一实施方案中，(例如)通过饱和 诱变方法沿着抗ALK的抗体的编码序列的全长或一部分随机引入突 变，并且可以对所得的经修饰的抗ALK的抗体的结合活性进行筛选。 “共有序列”是指由相关序列的家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸) 所形成的序列(例如参见：Winnaker，From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987))。在蛋白质家族中， 共有序列中的每个位点都由所述家族中该位点处最频繁出现的氨基酸 所占据。如果2个氨基酸出现的频率相等，则任何1个氨基酸都可以 被包含在所述的共有序列中。
通过参考本文所提供的表格和附图，可以通过对所述抗体的可变 区CDR的氨基酸序列进行优化比对来得到所述抗体的重链/轻链可变 区CDR的共有序列，其中所述抗体对人ALK-1蛋白质的氨基酸 390-406的抗原表位具有反应性。
术语“载体”是指能够对与其连接的另一段核酸进行转运的核酸分 子。一种类型的载体为“质粒”，其是指其中可以连接有其他DNA片 段的环状双链DNA环。另一种类型的载体为病毒载体，其中其他DNA 片段可以被连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入的宿主细 胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)中 自主复制。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以通过在引 入到宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，并由此随着宿主基因 组进行复制。
术语“宿主细胞”是指其中已经引入了表达载体的细胞。宿主细胞 可以包括细菌、微生物、植物或动物细胞。容易进行转化的细菌包括： 肠杆菌科(enterobacteriaceae)中的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株或沙门氏菌(Salmonella)菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae) 中的成员，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌 (Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)；以及流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)。合适的微生物包括酿酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)。 合适的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细 胞。
术语“治疗”是指本文所述的治疗或预防措施。为了预防和治疗由 ALK介导的紊乱、或延缓和减轻由ALK介导的紊乱的严重程度，或 者改善由ALK介导的紊乱的一种或多种症状或改善这种复发的紊乱， 或者为了将受试者的生命延长至在没有进行治疗时所期望的时间，“治 疗”的方法采用了向受试者实施本发明的抗体，其中所述的受试者需要 进行上述治疗，并且所述的受试者是例如有患有ALK介导的紊乱的 受试者或最终可能会患有这种紊乱的受试者。
术语“ALK介导的紊乱”是指与ALK介导的癌症或肿瘤有关的疾 病状态和/或症状。术语“ALK介导的紊乱”一般是指需要ALK参与的 任何紊乱，以及需要ALK参与的症状的发生、进行或持续。示例性 的ALK介导的紊乱包括(但不限于)(例如)癌症，特别是成胶质 细胞瘤。
术语“有效剂量”是指足以取得或至少部分取得所需效果的量。术 语“治疗有效剂量”被定义为足以治愈或至少部分抑制所述疾病，以及 足以治愈或至少部分抑制已经患有所述疾病的患者的并发症。用于所 述用途的有效量将取决于所述的待治疗的紊乱的严重程度，以及患者 本身的免疫系统的总体状态。
术语“受试者”是指任何人或非人的动物。例如，本发明的方法和 组合物可用于治疗患有癌症(例如，成胶质细胞瘤)的受试者。
除非另作说明，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都与本 发明所属技术领域的任一普通技术人员通常所理解的意义相同。虽然 在实施本发明或对本发明进行检验的过程中可以使用与本文所述的方 法和材料相似或等同的方法和材料，但是在下文中对合适的方法和材 料还有所描述。在发生分歧的情况下，将以本说明书(包括定义)为 主。此外，材料、方法和实施例仅是示例性的，并且无意于限定本发 明。
在以下部分中将进一步详细地描述本发明的各个方面。应该理解 的是，各种实施方案、优选条件和范围可以随意结合。此外，根据具 体的实施方案，可以不使用所选的定义、实施方案或范围。
在第一方面中，本发明提供了一种与人ALK蛋白质结合的抗体， 所述抗体包含其序列与SEQ.ID.No.2所示的序列具有至少50％的序 列一致性的可变重链CDR3。优选的是，所述的序列一致性为至少 60％、70％、75％、80％，或者更优选的为至少90％。最优选的是， CDR3就具有SEQ.ID.No.2所示的序列。
在本发明的优选的实施方案中，所述抗体特异性地与人ALK蛋 白质结合，即，该抗体不与小鼠ALK蛋白质结合，其中与人ALK蛋 白质的PTN结合位点(SEQ.ID.No.1)相比，小鼠的ALK蛋白质的 PTN结合位点只有2个氨基酸残基不同。在位置3处，人为异亮氨酸， 而在相应的小鼠序列中，位置3为缬氨酸；而在人为天冬氨酸的相应 位置小鼠序列为丙氨酸。
本发明的抗体可以为全长的抗体，但也可以为抗体片段，例如scFv 或Fab片段。抗原结合片段是本领域公知的。优选使用scFv抗体。
所述的重链和轻链由框架序列构成，每个框架序列都包含3个 CDR，分别是CDR1、CDR2和CDR3，它们主要涉及抗原结合。本 发明的抗体包含H3类型的VH结构域和λ类型的VL结构域。
本发明抗体的VH和VL框架是稳定的并且是可溶的，从而在细 胞内的还原环境中是具有功能的。所述的框架优选为之前已经通过被 称为“质量控制系统”的酵母筛选系统分离出来的框架4.4.(Auf der Maur et al.，2001；Auf der Maur et al.2004)。所述框架的序列可以 由(例如)SEQ.ID.No.20(参见下文)推出，其中所述的框架部分 由无下划线的并且是正体字母表示，而所述的CDR序列具有下划线， 并且连接序列为斜体字。
本发明的抗体能够与具有16个氨基酸的ALK抗原表位肽结合， 其中所述具有16个氨基酸的ALK抗原表位肽与SEQ.ID.No.1所示 的序列具有至少75％、优选80％、85％、90％、95％，或更优选的 100％的一致性。该序列还被称为PTN结合位点，并且在整个人基因 组中是特有序列。在相应的小鼠的序列中，16个氨基酸中有2个氨基 酸发生变化，即，即在位置3V代替I，且在位置7的A代替D。本 发明的抗体优选与人ALK结合，但不与小鼠ALK结合，即，本发明 的抗体对人的蛋白质具有特异性。含有约残基391-406或者由残基 391-406构成的ALK抗原表位特别适用于选择抗体或抗原结合片段， 其中所述抗体或抗原结合片段能够特异性地与ALK结合，并且阻断 或抑制ALK介导的活性。所述的抗原表位还适用于筛选或产生特异 性地阻断ALK活性的抗体。因此，此抗原表位，特别是含有约残基 391-406或者由残基391-406构成的抗原表位，特别适用于作为主动免 疫治疗剂或疫苗，这将在本文中进一步说明。
本发明的抗体与ALK抗原表位肽具有Kd为30nM或更小，优选 为10nM或更小，最优选为小于3nM的亲和力。
在本发明的另一实施方案中，所述抗体含有其序列与SEQ.ID.No. 3所示的序列具有至少50％的序列一致性的可变轻链CDR3。优选的 是，所述的序列一致性为至少60％、70％、80％、85％，更优选至少 为90％。最优选的是，CDR3与SEQ.ID.No.3一致。此外，所述抗 体能够与具有16个氨基酸的ALK抗原表位肽结合，其中所述具有16 个氨基酸的ALK抗原表位肽与SEQ.ID.No.1所示的序列具有至少 75％、优选80％、85％、90％、95％，或最优选的100％的氨基酸一 致性。此外，所述抗体与ALK抗原表位肽具有Kd小于10nM，优选 小于7nM的亲和力。
在本发明优选的实施方案中，所述抗体含有如SEQ.ID.No.4所 示的VH序列和如SEQ.ID.No.5所示的VL序列。此外，所述抗体 在至少1个CDR中可以具有至少1个突变，由此产生更高的亲和力， 该亲和力可表征为Kd小于约3nM。所述的至少1个突变优选存在于 VH和/或VL的CDR1或CDR2中，最优选存在于VH的CDR2中。
在本发明的另一优选实施方案中，所述抗体含有可变的重链 CDR2，其含有选自SEQ.ID.No.7、SEQ.ID.No.8、SEQ.ID.No.9、 SEQ.ID.No.10、SEQ.ID.No.11、SEQ.ID.No.12、或SEQ.ID.No. 13中的序列。如此定义的CDR2序列优选在氨基酸残基AI之后，在 如SEQ.ID.No.17所示的序列之前，这样定义出完整的CDR2。
本发明的优选抗体含有SEQ.ID.No.4所示的VH序列以及SEQ. ID.No.5所示的VL序列。在scFV抗体中，所述结构域的结构可以 是NH2-VL-连接子-VH-COOH或NH2-VH-连接子-VL-COOH；优选 的是，所述连接子具有序列SEQ.ID.No.16。可供选用的其他方式是， 由SEQ ID NOS：4和5所示的可变区可以采用基因工程的方法整合到 诸如IgG或IgM之类的全长抗体中。适用于与本发明的可变区结合的 恒定区是本领域已知的。
所述抗体或抗体衍生物作为药物或作为诊断工具的用途也在本发 明的范围内。优选包含用于治疗癌症或肿瘤的药物的制备进行设想。 为了达到这一目的，将抗体采用放射性核素或放电金属标记法来进行 放射性标记。这对于肿瘤靶向、成像以及生物分布研究是特别有价值 的。此外，重组DNA技术使得将可变V基因的编码区基因融合到经 修饰的毒素结构域中成为可能。例如，scFv-毒素融合蛋白(其中scFv 对肿瘤标志物蛋白是特异性的)可以使毒素靶向肿瘤，其中所述毒素 会引起细胞毒性。这种靶向性的治疗可以对肿瘤中的细胞毒性剂或放 射性核素的浓度进行选择，从而能够减轻对正常组织产生的毒性。
在本发明的优选实施方案中，所述抗体用于治疗癌症或肿瘤，优 选用于治疗成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、横纹肌肉瘤、乳腺癌、黑 色素瘤、胰腺癌、B细胞非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、小细胞肺癌、 视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、前列腺癌、结肠癌、或胰腺癌，优选 用于治疗成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤和横纹肌肉瘤。在许多软组织 肿瘤中，已经检测到ALK的表达以及ALK蛋白质(Li等人，2004)。 已经在所述这些人类肿瘤中发现了全长的ALK。此外，所述抗体优选 用于局部治疗。最优选用于成胶质细胞瘤的局部治疗。
本发明的另一方面提供了编码本发明抗体的DNA序列。用于 ESBA512(SEQ.ID.No：19)的合适的原核表达载体为pTFT74(参见 SEQ.ID.No：90，其为含有ESBA512编码序列的序列)。其中，ESBA512 编码序列处于T7启动子的控制之下，并且所得的重组基因产物通常 通过包涵体进行纯化。另一优选的原核表达载体为pAK400，其中 ESBA512序列为his-标签的，以用于简化的纯化(参见SEQ.ID.No： 89，其为含有ESBA512编码序列的序列)。该基因产物被宿主细胞 分泌到外周胞质中。
此外，本发明提供了含有所述DNA序列的表达载体以及用所述 表达载体转化的合适的宿主细胞。优选的是，所述宿主细胞为E.coli 细胞。
本发明的另一方面为本发明抗体的制备方法，该方法包括：在允 许合成所述抗体的条件下，对所述宿主细胞进行培养，其中所述的宿 主细胞被用于所述抗体的表达载体所转化；以及从所得培养物中回收 所述的抗体。
本发明的另一方面提供了ALK的抗原表位，其基本上含有如SEQ ID NO：1所示的残基391-406，或基本上由SEQ ID NO：1所示的残基 391-406组成。所述的抗原表位适用于鉴定、筛选或产生抗ALK的抗 体或其片段。优选的是，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地与 分离的ALK蛋白质或其片段的残基391-406(SEQ ID No：1)结合。 更优选的是，所述抗体为单链抗体(scFv)、Fab片段、IgG或IgM。
在另一方面中，本发明提供了ALK疫苗，其含有分离的ALK蛋 白质或其片段、或者编码ALK的抗原表位的核酸。优选的是，所述 疫苗含有分离的ALK蛋白质的残基391-406。所述疫苗优选与载体、 佐剂和/或半抗原配制形成，以增强免疫应答。
本发明的序列如下所示：
SEQ.ID.No.1：GRIGRPDNPFRVALEY
人ALK抗原表位肽(所述ALK蛋白质的氨基酸391-406)；带 有下划线的残基为小鼠同源序列中不同的氨基酸残基。
SEQ.ID.No.2：RDAWLDVLSDGFDY
VH的ESBA521 CDR3。带有下划线的残基为经过随机化后所得 的残基。
SEQ.ID.No.3：ATWDNDKWGVV
VL的ESBA521 CDR3。带有下划线的残基为经过随机化后所得 的残基。
SEQ.ID.No.4：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS
TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDAWLDVLSDGFDYWGQ
GTLVTVSS
ESBA521的VH。带有下划线的为CDR。
SEQ.ID.No.5：
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPS
GIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCATWDNDKWGVVFGGGTKLEVLG
ESBA521的VL。带有下划线的为CDR。
SEQ.ID.No.6：
AISGSGGSTYYADSVKG
ESBA521的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.7：
AINMKGNDRYYADSVGK
scFv 265.1的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.8：
AIRTNSKEYYADSVKG
scFv43.2的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.9
AIKTDGNHKYYADSVKG
scFv 100.2的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.10：
RTDSKEQYYADSVKG
scFv 2.11的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.11：
ETSSGSTYYADSVKG
scFv 28.11的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.12：
NTGGGSTYYADSVKG
scFv 33.11的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.13：
NTRGQNEYYADSVKG
scFv 4.12的VH CDR 2。
SEQ.ID.No.16
GGGGSGGGGSGGGGSSGGGS
连接VL和VH的连接子
SEQ.ID.No.17
YYADSVKG.
ESBA521及其衍生物的CDR2的C-末端部分。
SEQ.ID.No.18
DAGIAVAGTGFDY
FW4.4的VH CDR3
SEQ.ID.No.19
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPS
GIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCATWDNDKWGVVFGGGTKLEVLGGGG
GSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA
PGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RDAWLDVLSDGFDYWGQGTLVTVSS
scFv ESBA521，带有下划线的是CDR，斜体的部分为连接子。
SEQ.ID.No.20
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPS
GIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGGTKLTVLGGGG
GSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA
PGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RDAGIAVAGTGFDYWGQGTLVTVSS
FW4.4，带有下划线的是CDR，斜体的部分为连接子。
SEQ ID No.21
cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccagga
cagaaggtcaccatctcctgctccggaagcacctccaacattggcgataattatgta
tcctggtaccaacaactcccaggaacagccccccaactcctcatttatgacaatact
aaacgaccctcagggattcctgaccggttctctggctccaagtctggcacgtcagcc
accctgggcatcaccggactccagactggggacgaggccgattattactgcgcgacc
tgggataatgataagtggggtgtggttttcggcggagggaccaagctcgaggtcc-
taggt
ESBA521 VL的核酸序列。
带有下划线的为CDR。
SEQ ID No.22
gaggtgcagctggtggagtccgggggaggcttggtacagcctggg
gggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatg
agctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggt
agtggtggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccaga
gacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacg
gccgtatattactgcgcgcgtgatgcgtggttggatgtgctttcggatggctttgac
tactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg
ESBA521 VH的核酸序列。
带有下划线的为CDR。
SEQ ID No.23
cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccagga
cagaaggtcaccatctcctgctccggaagcacctccaacattggcgataattatgta
tcctggtaccaacaactcccaggaacagccccccaactcctcatttatgacaatact
aaacgaccctcagggattcctgaccggttctctggctccaagtctggcacgtcagcc
accctgggcatcaccggactccagactggggacgaggccgattattactgcgcgacc
tgggataatgataagtggggtgtggttttcggcggagggaccaagctcgaggtccta
ggtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccagtggtggt
ggatccgaggtgcagctggtggagtccgggggaggcttggtacagcctggggggtcc
ctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgg
gtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggt
ggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaat
tccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgta
tattactgcgcgcgtgatgcgtggttggatgtgctttcggatggctttgactactgg
ggccagggaaccctggtcaccgtctcctcg
ESBA521的核酸序列。
带有下划线的为CDR，斜体的部分为连接子。
现在通过实施例来进一步描述本发明。
材料和方法
总体而言，除非另作说明，否则本发明的实施过程采用了化学、 分子生物学、重组DNA技术、免疫(特别是例如抗体技术)和多肽 制备中的标准技术的常规技术。例如，参见Sambrook、Fritsch和 Maniatis的《Molecular Cloning》：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(分子生物学方法)，510， Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(实施方法系列，169)，McCafferty，Ed.，Irl Pr(1996)； Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow et al.，C.S.H.L.Press， Pub.(1999)；以及Current Protocols in Molecular Biology，eds. Ausubel et al.，John Wiley & Sons(1992)。
实验1：进行筛选以鉴定出与ALK结合的scFv
在对抗体-抗原相互作用的大量结构研究中，发现，重链的互补性 决定区3(CDR-H3)中的残基通常与抗原发生最实质性的接触 (Chothia and Lesk，1987；Chothia et al.，1985；Padlan，1994)。我们 采用我们最近描述过的酵母双杂交抗原-抗体相互作用筛选技术，通过 筛选随机合成的CDR-H3序列的4个scFv文库来直接分离与抗原结 合的scFv(Auf der Maur et al.，2002)。所述的4个文库基于4种不 同的、稳定的人scFv框架，其中可变重链的第3个CDR(VH-CDR3) 环中的7个氨基酸是随机化的。通过标准的PCR克隆技术引入随机化 的部分。采用被称为“质量控制”的酵母筛选系统，针对由人酪氨酸受 体激酶间变性淋巴瘤激酶(ALK)的胞外结构域衍生的含有16个氨 基酸的肽来筛选scFv文库(Auf der Maur等人.，2001；Auf der Maur 等人.，2004)。简言之，所述的质量控制技术是用于从人可变轻链(VL) 和可变重链(VH)的天然集合物中鉴定具有有利的生物物理学性质的 (例如，稳定性、可溶性和表达产率)VL和VH组合的抗原依赖性 胞内抗体选择系统。在经过第1次筛选循环之后，从所述的4种scFv 文库之一分离出一种有希望的特异性结合体。这种特别的scFv衍生自 框架FW4.4文库。FW4.4(SEQ.ID.No.20)由VL结构域(λ)通过 传统的柔性甘氨酸-丝氨酸连接子(GGGGS)4与VH3结构域连接而成。 FW4.4的VH CDR3包含13个氨基酸(DAGIAVAGTGFDY；SEQ.ID. NO.18)。为了构建所述的文库，VH CDR3的中心部分 (DAXXXXXXXGFDY)是通过标准的PCR克隆方法使用简并寡核 苷酸而随机构成的。最后的2个残基(Asp和Tyr)保持不变，这是 因为在许多情况中已经证实了这2个残基在结构上的重要性(Chothia and Lesk，1987)。其余残基没有被修饰，以将文库的复杂性保持在可 控的范围内。将scFv文库作为融合到Gal4的转录活化结构域的C末 端克隆到酵母表达载体(pLibl)中(Auf der Maur et al.，2002)。
选择人AlK的配体结合结构域(LBD)作为所述的相互作用的筛 选中的抗原(Stoica et al.，2001)。将该含有16个氨基酸的肽作为融 合到DNA结合蛋白LexA的C末端克隆到另一酵母表达载体(pBait1) 中。
使用表达与LexA融合的AlK LBD以及与Gal4活化结构域融合 的随机化CDR-H3 scFv文库的诱饵载体来转化报告酵母菌株 YDE173，该报告酵母菌株YDE173含有处于6个LexA结合位点控制 下的、稳定整合的报告基因HIS3和lacZ(Auf der Maur et al.，2002)。 在不含有组氨酸但含有2.5mM的3-氨基三唑(3-AT)的平板上选择 转化细胞，其中所述的3-氨基三唑是HIS3基因产物的竞争性抑制剂。 经过6天，挑出生长克隆，并分离文库质粒。用回收的质粒转化相同 的报告菌株，从而证实了抗原依赖性的基因活化。进行液态β-半乳糖 苷酶的定量检测，以测量AlK LBD(即，16个氨基酸的ALK肽)与 所选的scFv之间的结合强度。并且在ELISA中scFv具有报告基因的 最大活化也证实了对AlK LBD肽的最大亲和力(-31nM)(数据未示 出)。
在下表1a中，提供了被确定为有助于ALK结合的其他VH CDR3 序列的序列。
在下表1b中，提供了其他合适的框架的序列。
实验2：亲和力成熟
为了得到亲和力更高的scFv，通过突变和在酵母中的第二次筛选 循环来对初级结合体进行进一步的亲和力成熟过程。为了能够进行亲 和力成熟，需降低LexA AlK LBD肽融合蛋白的表达水平，以降低由 于初级结合体与AlK LBD肽的相互作用而驱动的报告基因的活化。将 pBait1载体上的强的肌动蛋白基因启动子用截短的并由此活性降低的 ADH(醇脱氢酶)启动子替换，从而得到pBait3。在初级结合体存在 的条件下，这种诱饵表达水平的降低足以抑制细胞在不含有组氨酸但 含有5mM的3-AT的平板上的生长。通过对可变轻链中的部分CDR3 进行随机化来完成用于亲和力成熟的、初级结合体的突变。通过同源 重组直接在酵母中实施上述过程(Schaerer-Brodbeck and Barberis， 2004)。FW4.4的VL CDR3含有11个氨基酸(SEQ.ID.No.14： GTWDSSLSGVV)。最开始的2个位置被部分随机化，这样第1个 位置处编码Gly、Ala或Gln，而第2个位置处编码Thr、Ser或Ala。 在VL CDR3的位置5至8处，所有氨基酸残基允许被随机化。其他 位置处保持不变。通过PCR引入随机化。所得的PCR产物的大小为 356bp，并且含有上游为267bp且下游为27bp的框架序列的、经随机 化的CDR盒。该产物即为所谓的供体PCR片段，其与目标载体具有 同源性。所述的目标载体为酵母质粒(pLib1)，该酵母质粒编码与 Ga14的活化结构域融合的初级结合体。为了提高同源重组的效率以及 排除随后筛选中的假阳性结果，对所述目标载体中的CDR-L3稍微进 行修饰。在VL CDR3的中部引入独特的SacI限制性酶切位点，这会 导致在所述融合蛋白的scFv编码部分中发生移码，并导致被截短的蛋 白质不能与AlK LBD结合。此外，SacI位点能够使目标载体发生线 性化，这会增强在酵母中的重组效率。
通过用表达LexA AlK LBD(其处于截短的ADH启动子的控制之 下)的质粒(pBait3)对报告酵母菌株YDE173进行预转化，从而开 始筛选过程。使这种经预转化的酵母细胞再一次处于感受态，并用线 性化的目标载体以及供体PCR片段进行共转化，其中所述的供体PCR 片段与VL CDR3的上游和下游具有同源性。在PCR产物与目标载体 之间发生同源重组之后，将新的VL CDR3序列整合到目标载体的相 应位点处。上述过程的最终结果是，原始VL CDR3与随机化的VL CDR3互换。这将重新构成环状质粒，该质粒表达具有新的VL CDR3 序列的全功能性融合蛋白，该全功能性融合蛋白将活化报告基因的表 达并能够通过与AlK LBD肽发生相互作用而使细胞在选择性平板上 生长。
通过6天的观察，在选择性平板上共生长出119个克隆。挑出这 些克隆，并分离出文库质粒，然后将其再次转化到相同的报告酵母菌 株中。进行液态β-半乳糖苷酶的定量检测，从而测量出AlK LBD(抗 原)与亲和力成熟的scFv之间的结合强度。也用ALK-LBD肽通过 ELISA方法测定了具有最大lacZ活化的20个克隆。最佳候选显示出 KD为约7nM(参见图3)，并被命名为ESBA521。
在下表1c中，提供了被确定为有助于ALK结合的其他VL CDR3 序列的序列。
实验3：scFv ESBA521与跨膜形式的人ALK特异性结合
为了检测新确定的scFv是否也能够识别活细胞表面上的跨膜人 ALK蛋白质，要对瞬时转染的HELA细胞进行了免疫染色实验。 ESBA521与ALK蛋白质反应，并以多克隆抗体作为对照(参见图4)。 在对照实验中，显示出框架4.4scFv没有与人ALK发生反应。另人 惊奇的是，虽然小鼠ALK抗原肽序列与人ALK抗原肽序列只有2个 位置处的氨基酸不同，但是ESBA521只与人AlK蛋白质结合，而不 与相应的小鼠的AlK蛋白质结合。与此不同的是，多克隆ALK抗体 既识别人的ALK蛋白质，又识别小鼠的ALK蛋白质。因此，在细胞 表面，ESBA521与人ALK蛋白质的结合是特异性的。
实验4：分离通过VH CDR2的PCR突变而得以改善的结合体
为了进一步改进与抗原的结合，ESBA521被用作亲和力成熟的进 一步循环中的起始scFv，其中所述的亲和力成熟的进一步循环使用了 与在亲和力成熟的第一个循环中所述的相同的双杂交方法，不同之处 在于，在这种情况下，VH的CDR2是通过PCR突变来改变的并且被 转化到酵母受体中，其中CDR2的同源重组以类似的方式增强。此外， 将限制性酶切位点引入到CDR2中，以能够使目标质粒线性化。CDR2 中引入的突变在表2中给出。
在上述过程之后得到的分离的scFv中，其中的7种表现为亲和力 显著增强，其Kd为2-3nM(参见图5)，其中最佳的是28.11。
实验5：通过实施抗ALK的抗体来预防肿瘤生长
选择抗体ESBA521的祖蛋白(progenitor)来与ALK的氨基酸 391-406结合，其中所述的ALK包含已知与多效生长因子结合的氨基 酸(396-406)(Stoica 2001)。通过使ESBA521的祖蛋白的CDR中 的其他氨基酸随机化并通过选择与由天然ALK的胞外结构域(ECD) 所含有的氨基酸391-406的序列相结合的结合体，来得到ESBA521。 这些程序得到了这样的抗体，该抗体在与PTN结合的相同的位点处以 高的亲和力与ALK的ECD结合。据我所知，这是第一个特异性地靶 向ALK的PTN结合位点的单克隆抗体。因此，预测ESBA521与ALK 的ECD具有高亲和力，并且能够高效地与多效生长因子(PTN)和 中期因子(MK)竞争来结合ALK受体，由此，ESBA521抗体适用 于抑制MK和PTN配体与ALK蛋白质结合。
由于ALK及其配体涉及瘤形成、肿瘤侵袭和血管发生，所以抑 制ALK与其关联配体间的相互作用会破坏ALK介导的肿瘤发生。
可以通过以下描述的2种检测方法来确定ESBA521对特定肿瘤的 效果。
在第一种检测方法中，准备异种移植，以便确定ALK在限制癌 的生长速率中的作用(Powers 2002)。简言之，以2千万个细胞/ml 介质的量制备U87MG细胞的悬浮液，其中所述介质含有10％的牛血 清。将该悬浮液注入NU/NU小鼠中，并测量所得的肿瘤。引入测试 抗体，优选为全长的抗体，更优选为聚乙二醇(pegylated)修饰的抗 体，并评价肿瘤的生长。
在目前对本发明的优选实施方案进行示出以及描述的同时，应该 清楚地理解，本发明不限于这些实施方案，而且在以下权利要求的范 围内，除了上述的实施方案以外，本发明还可以具有多种实施方案和 实施方式。
参考文献
Auf der Maur，A.，Escher，D.，and Barberis，A.(2001).Antigen-independent selection of stable intracellular single-chain antibodies.FEBS Lett 508，407-412.
Auf der Maur，A.，Tissot，K.，and Barberis，A.(2004).Antigen-independent selection of intracellular stable antibody frameworks.Methods 34，215-224.
Auf der Maur，A.，et al.，Direct in vivo screening of intrabody libraries constructed on a highly stable single-chain framework.J Biol Chem，277(47)：p. 45075-85，2002.
Bai RY.et al.Nucieophosmin-anaplastic lymphoma kinase associated with anaplastic large-cell lymphoma activates the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt an- tiapoptotic signalling pathway.Blood 96(13)，4319-4327，2000.
Bowden et.et al.Anti-apoptotic signaling of pleiotrophin through its receptor， anaplastic lymphoma kinase.The Journal of Biological Chemistry 277(39)， 35862-35868，2002.
Chothia，C，and Lesk，A.M.(19B7).Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins.J.Mol.Biol.196，901-917.
Chothia，C7 Novotny，J.，Bruccoleri，R..，and Karplus，M.(1985).Domain association in immunoglobulin molecules.The packing of variable domains.J.Mol. Biol.186，651-663.
Choudhuri et al.，An Angiogenic Role for the Neurokines Midkine and Pleiotrophin in Tumorigenesis.Cancer Res.57，1814-1B19，1997.
Czubayko et al.，Melanoma angiogenesis and metastasis modulated by ribozyme targeting of the secreted growth facator pleiotrophin.PNAS 93， 14753-14758，1996.
De Juan C.et al.Genomic organization of a novel glycosylphosphatidylinositol MAM gene expressed in human tissues and tumors.Oncogene 21，3089-3094， 2002.
Delsol G.et al.A new subtype of large B-cell lymphoma expressing the ALK kinase and lacking the 2；5 translocation.Blood 89(5)，1483-1490，1997.
Dirks WG.et al.Expression and functional analysis of the anaplastic lymphoma kinase(ALK)gene in tumor cell lines.International Journal of cancer 100， 49-5S，2002.
Duyster J.et al.Trans locations involving anaplastic lymphoma kinase(ALK). Oncogene 20，5623-5S37，2001.
Ergin M.et al.Inhibition of tyrosine kinase activity induces caspase-dependent apoptosis in anaplastic large cell lymphoma with NPM-ALK(p80)fusion protein. Experimental Hematology 29，1062-1090，2001.
Fang et al.，Pleiotrophin stimulates fibroblasts and endothelial and epithelial cells and is expressed in human cancer.JBC vol.267 p.25889，1992.
Fiorani C.et al.Primary systemic anaplastic large-cell lymphoma(CD30+)： advances in biology and current therapeutic approaches.Clinical Lymphoma 2(1)， 29-37，2001.
lwahara T.et al.Molecular characterization of ALK，a receptor tyrosine kinase expressed specifically in the nervous system.Oncogene 14，439-449，1997.
Kutok JL.and Aster JC.Molecular biology of anaplastic lymphoma kinase-positive anaplastic large-cell lymphoma.Journal of Clinical Oncology 20(17)， 3691-3702，2002.
Ladanyi M.Aberrant ALK tyrosine kinase signalling.Different cellular lineages， common oncogenic mechanisms？American Journal of Pathology 157(2)，341-345， 2000.
Lamant et al.Expression of the ALK tyrosine kinase gene in neuroblastoma. Am.J.Pathol.156，1711-1721，2000.
Li，X.-Q.，Hisaoka，M.，Shi，D.-R.，Zhu，X-Z.，and Hashimoto，H.Expression of Anaplastic Lymphoma Kinase in soft tissue tumors：an immunohistochemical and molecular study of 249 cases.Human pathology 35，711-721，2004.
Loren CE.et al.Identification and characterization of Dalk：a novel Drosophila melanogaster RTK which drives ERK activation in vivo.Genes to cells 6(6)，531-544， 2001.
Miyake l.et al.Activation of anaplastic lymphoma kinase is responsible for hyperphosphorylation of ShcC in neuroblastoma cell lines.Oncogene 21，5823- 5834，2002.
Morris SW.et al.ALK，the chromosome 2 gene locus altered by the t(2；5)in non-Hodgkin′s lymphoma，encodes a novel neural receptor tyrosine kinase that is highly related to leukocyte tyrosine kinase(LTK).Oncogene 14，2175-2188，1997.
Morris SW.et al.ALK+CD30+lymphomas：A distinct molecular genetic subtype of non-Hodgkin′s lymphoma.British Journal of Haematology 113，275-295， 2001.
O′Brien et al.，The angiogenic factor midkine is expressed in bladder cancer and overexpression correlates with a poor outcome in patients with invasive cancer. Cancer Res.56，2515-2518，1996.
Padlan，E.A.(1994)-Anatomy of the antibody molecule.Mol Immunol 31， 169-217.
Powers C.et al.Pleiotrophin signalling through anaplastic lymphoma kinase is rate-limiting for glioblastoma growth.The Journal of biological chemistry 277(16)， 14153-14158，2002.
PulfordK.et al.Anaplastic lymphoma kinase proteins and malignancy. Current Opinion in Hematology Bl，231-236，2001.
Pulford K.et al.Anaplastic lymphoma kinase proteins in growth control and cancer.J Cell Physiol 199，330-358，2004.
Schaerer-Brodbeck，C.and A.Barberis，Coupling homologous recombination with growth selection in yeast：a tool for construction of random DNA sequence libraries.Biotechniques，37(2)：p.202-206，2004.
Stoica GE.et al.Identification of anaplastic lymphoma kinase as a receptor for the growth factor pleiotrophin.The Journal of Biological Chemistry 275(20)， 16772-15779，2001.
Stoica GE.et al.Midkine binds to anaplastic lymphoma kinase(ALK)and acts as a growth factor for different cell types.The Journal of Biological Chemistry 277 (39)，35990-35998，2002.
Weber D.et al.Pleiotrophin can be rate-limiting for pancreatic cancer cell growth.Cancer Research 60，5284-5288，2000.
Wellstein et al.，A Heparin-binding Growth Factor Secreted from Breast Cancer Cells Homologous to a Developmentally Regulated Cytokine.JBC Vol 267，p2582， 1992.
SWISSPROT：www.expasy.org
www.Emedicine.com/med/topic2692，htm(成胶质细胞瘤)
www.emedicine.com/MED/topic3205.htm(ALCL)
序列表
<110>ESBATech AG
<120>与受体酪氨酸激酶ALK的胞外域结合的抗体
<130>P100661PC
<150>US 60/795,831
<151>2006-04-28
<160>91
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>ESBA512的重链可变区的CDR3
<400>2
<210>3
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<223>ESBA512的轻链可变区的CDR3
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<210>4
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<220>
<223>ESBA512的重链可变区
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<400>5
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<220>
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<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 100.2的重链可变区的CDR2
<400>9
<210>10
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 2.11的重链可变区的CDR2
<400>10
<210>11
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 28.11的重链可变区的CDR2
<400>11
<210>12
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 33.11的重链可变区的CDR2
<400>12
<210>13
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 4.12的重链可变区的CDR2
<400>13
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>框架4.4的轻链可变区的CDR3
<400>14
<210>15
<211>248
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>框架5.2的序列
<400>15
<210>16
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>ESBA512中连接VH和VL的连接子
<400>16
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>ESBA512的CDR2的C-末端部分及其衍生物
<400>17
<210>18
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>框架4.4的重链可变序列的CDR3
<400>18
<210>19
<211>253
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>单链抗体片段ESBA512
<400>19
<210>20
<211>253
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv用作框架
<400>20
<210>21
<211>333
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ESBA512的轻链可变区
<400>21
<210>22
<211>366
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ESBA512的重链可变区
<400>22
<210>23
<211>759
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>单链抗体
<400>23
<210>24
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>框架4.4的重链可变区的CDR3
<400>24
<210>25
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 2.1的重链可变区的CDR3
<400>25
<210>26
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 4.1的重链可变区的CDR3
<400>26
<210>27
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 5.1的重链可变区的CDR3
<400>27
<210>28
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 2.3的重链可变区的CDR3
<400>28
<210>29
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 3.3的重链可变区的CDR3
<400>29
<210>30
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 5.3的重链可变区的CDR3
<400>30
<210>31
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>H5 SH 14.3的重链可变区的CDR3
<400>31
<210>32
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>WT FW4.4的轻链可变区的CDR3
<400>32
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-9.1的轻链可变区的CDR3
<400>33
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-21.1的轻链可变区的CDR3
<400>34
<210>35
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-22.1的轻链可变区的CDR3
<400>35
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-25.1的轻链可变区的CDR3
<400>36
<210>37
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-27.1的轻链可变区的CDR3
<400>37
<210>38
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-28.1的轻链可变区的CDR3
<400>38
<210>39
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-29.1的轻链可变区的CDR3
<400>39
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-46.1的轻链可变区的CDR3
<400>40
<210>41
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-53.1的轻链可变区的CDR3
<400>41
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-57.1的轻链可变区的CDR3
<400>42
<210>43
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-86.1的轻链可变区的CDR3
<400>43
<210>44
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-94.1的轻链可变区的CDR3
<400>44
<210>45
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-107.1的轻链可变区的CDR3
<400>45
<210>46
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-112.1的轻链可变区的CDR3
<400>46
<210>47
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-113.1的轻链可变区的CDR3
<400>47
<210>48
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-117.1的轻链可变区的CDR3
<400>48
<210>49
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-118.1的轻链可变区的CDR3
<400>49
<210>50
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-6.1的轻链可变区的CDR3
<400>50
<210>51
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-7.1的轻链可变区的CDR3
<400>51
<210>52
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-8.1的轻链可变区的CDR3
<400>52
<210>53
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-9.1的轻链可变区的CDR3
<400>53
<210>54
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-12.1的轻链可变区的CDR3
<400>54
<210>55
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-13.1的轻链可变区的CDR3
<400>55
<210>56
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-21.1的轻链可变区的CDR3
<400>56
<210>57
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-48.1的轻链可变区的CDR3
<400>57
<210>58
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>14.3-49.1的轻链可变区的CDR3
<400>58
<210>59
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-24.，1的轻链可变区的CDR3
<400>59
<210>60
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-3.1的轻链可变区的CDR3
<400>60
<210>61
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-8.1的轻链可变区的CDR3
<400>61
<210>62
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>5.3-19.1的轻链可变区的CDR3
<400>62
<210>63
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv WT(ESBA521)的重链可变区的CDR2
<400>63
<210>64
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 1.1的重链可变区的CDR2
<400>64
<210>65
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 17.1的重链可变区的CDR2
<400>65
<210>66
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 35.1的重链可变区的CDR2
<400>66
<210>67
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 64.1的重链可变区的CDR2
<400>67
<210>68
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 130.1的重链可变区的CDR2
<400>68
<210>69
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 152.1的重链可变区的CDR2
<400>69
<210>70
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 167.1的重链可变区的CDR2
<400>70
<210>71
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 214.1的重链可变区的CDR2
<400>71
<210>72
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 225.1的重链可变区的CDR2
<400>72
<210>73
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 262.1的重链可变区的CDR2
<400>73
<210>74
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 265.1的重链可变区的CDR2
<400>74
<210>75
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 43.2的重链可变区的CDR2
<400>75
<210>76
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 70.2的重链可变区的CDR2
<400>76
<210>77
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 99.2的重链可变区的CDR2
<400>77
<210>78
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 100.2的重链可变区的CDR2
<400>78
<210>79
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 109.2的重链可变区的CDR2
<400>79
<210>80
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 146.2的重链可变区的CDR2
<400>80
<210>81
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 173.2的重链可变区的CDR2
<400>81
<210>82
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 199.2的重链可变区的CDR2
<400>82
<210>83
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 2.11的重链可变区的CDR2
<400>83
<210>84
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 19.11的重链可变区的CDR2
<400>84
<210>85
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 28.11的重链可变区的CDR2
<400>85
<210>86
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 33.11的重链可变区的CDR2
<400>86
<210>87
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 4.12的重链可变区的CDR2
<400>87
<210>88
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>scFv 6.12的重链可变区的CDR2
<400>88
<210>89
<211>2520
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>含有ESBA521编码序列的表达载体pAK400
<400>89
<210>90
<211>3319
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>含有ESBA521编码序列的pTFT74表达载体
<400>90
<210>91
<211>22
<212>PRT
<213>智人
<400>91
机译： 核酸编码抗体，结合受体酪氨酸激酶ALK的胞外域
机译： 抗体与受体酪氨酸激酶ALK的胞外域结合
机译： 与ALK受体酪氨酸激酶胞外域结合的抗体
