重组人HER2胞外域的制备及其特异性VHH纳米抗体的筛选

摘要

HER2与乳腺癌的发生、发展密切相关，是重要的乳腺癌预后判断因子。HER2在肿瘤细胞中过度表达，介导癌形成作用，并且定位于细胞表面，这些特征使其成为一个理想的抗肿瘤治疗靶点。目前HER2抗体的筛选多以整个胞外域作为抗原来进行，本文利用VHH纳米抗体的小分子优势，基于现有的对于HER2结构和功能的系统研究，选取HER2胞外结构域中的关键区作为靶点。并以其作为抗原，通过噬菌体展示技术，来初步获取具有靶点亲和特异性的VHH纳米抗体，以期未来应用于肿瘤的临床诊断和治疗。
　　本文从HER2高表达的人乳腺癌细胞MCF-7中提取总RNA，经RT-PCR扩增HER2胞外域基因，将其克隆至pGEX-4T-1表达载体中。随后，以重组质粒为模板，PCR扩增HER2-II和HER2-IV基因，分别构建重组表达载体pGEX-4T-1-HER2-II和pGEX-4T-1-HER2-IV，并利用E．coliBL21高效表达。经优化，GST-HER2-II和GST-HER2-IV融合蛋白诱导表达条件确定为OD600=0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，20-28℃诱导9-16h。收集菌体，超声破菌，将上清液进行亲和色谱纯化。对纯化的重组抗原进行脱盐、浓缩，并检测其纯度和浓度。将重组抗原结合于固相上，加入经大规模扩增后的VHH抗体噬菌体文库，经3轮“吸附-洗脱-扩增”选择后，随即挑取单克隆进行ELISA实验，鉴定出1个具有特异性抗原亲和力的VHH抗体。本课题最终有望为临床治疗提供一种新的效价高、副作用低、成本低廉的小分子抗体药物。

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第一章 文献综述

1.1引言

1.2乳腺癌与HER2研究概述

1.3抗体技术及VHH纳米抗体概述

1.4本文主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 结果与讨论

3.1抗原重组表达载体的构建

3.2重组抗原蛋白的表达及纯化

3.3抗原特异性VHH抗体噬菌体的筛选

3.4本章小结

第四章 结论与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢