一株可代谢尼古丁的红球菌及其应用

摘要

本发明涉及一株能代谢尼古丁的红球菌及其应用，属应用微生物技术领域。本发明的红球菌(Rhodococcus sp.Y22)，已于2008年9月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2683。红球菌(Rhodococcus sp.Y22)具有较强的尼古丁代谢能力和尼古丁毒性抗性能力，能在高达3g/L尼古丁浓度下生长。通过大量培养该菌株，利用该菌株的完整细胞为生物催化剂将纯烟碱完全降解，同时能降解烟叶中的尼古丁含量。本发明具有能调整烟叶原料的尼古丁含量，提高烟叶可用性，及可分解烟尘中的尼古丁，减少其对环境的污染等优点。

说明书

技术领域：

本发明涉及一株可代谢尼古丁的红球菌及其应用，属应用微生物技术领域。

背景技术：

烟草是我国财政的重要支柱之一，随着我国卷烟和烟叶市场的国际化程度逐步加深，《烟草控制框架公约》对烟草制品的限制愈加严格，中国烟草面临着新的形势与新的挑战。为此，国家烟草专卖局制定了《中国卷烟科技发展纲要》，明确提出中国卷烟发展的方向是：以市场为导向，大力发展中式卷烟。而发展中式卷烟的关键技术就是要在保持高香气的前提下“减害降焦”，开发“低焦油、低危害、高香气”的中式卷烟品牌。因此，降低烟草中尼古丁等有害成分的含量，是促进卷烟工业健康发展的关键技术之一。

尼古丁是烟草生物碱中的主要成分，在烟草中，尼古丁大部分是以有机酸(如柠檬酸和苹果酸)盐的状态存在，也有少量的以自由状态存在。尼古丁进入人体内，90％被肺部吸收，进入血液后6秒钟即可到达大脑。尼古丁对人体最显著的作用是对交感神经产生影响，通常表现为短暂的兴奋，紧接着就是抑制。尼古丁的作用除了增加烟味和感受刺激外，主要还在于它所产生的生理强度，通常称为“劲头”。一般来讲，尼古丁含量高的烟叶，烟气劲头大，反之则小。因此，烟气中含有一定量的尼古丁是必要的，但尼古丁的含量也不能过高，否则不但会增加烟气的刺激性，影响卷烟吸味，而且从安全性的角度来讲也是一个非常不利的因素。

我国部分烟区的烟叶外观质量已接近国际水平，但就其内在质量而言还有一定差距，其中一个较普遍且较突出的问题就是尼古丁含量偏高。目前，我国烤烟尼古丁的平均含量为3％～4％，白肋烟平均高达6％，而美国烤烟的尼古丁含量在1.5％～3.5％之间；一般优质白肋烟的尼古丁含量在1.5％～4.0％之间，以3.0％为佳，美国白肋烟的尼古丁含量为2.9％左右。国内卷烟企业目前贮存的上部烟叶较多，一般因其尼古丁含量较高而难以较多用于叶组配方中，不仅占用了大量的仓储空间，而且也造成了大量的浪费。这个问题已引起有关方面的重视，如何降低这些烟叶中的尼古丁含量是各卷烟企业所面临的一个现实问题。同时由于烟草的连续栽培和大量废弃烟叶的存在使土壤中的尼古丁含量大大提高，对土壤环境和地下水质造成了较大的影响，如何有效的消除尼古丁对环境的污染也是当前人类发展所面临的关键问题。

目前，关于利用微生物降解尼古丁(烟碱)的研究已有报道。但经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于通过对一株能够降解烟草中尼古丁(烟碱)含量的微生物红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)的研究，提供一种降低烟草中尼古丁含量的方法。

本发明从云南省嵩明县杨林镇烟草栽培土壤中分离了一株具有降解尼古丁能力的细菌Y22，对其进行了形态学、生理生化性质和16S rRNA分析，鉴定结果表明该细菌属于红球菌属，该菌株命名为Rhodococcus sp.Y22。本该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2008年9月28日；保藏号为CGMCC No.2683。

红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)菌株的主要形态特征和生理生化性质为：

红球菌Y22菌株在培养早期为分支杆状，中期呈短杆状，后期变为球形。无芽孢，不能运动。革兰氏染色阳性。硝酸盐还原和接触酶试验为阳性。不能液化吲哚，不能水解淀粉。甲基红(MR)实验和乙酰甲基甲醇(VP)实验均为阴性。本菌株对葡萄糖、甘露醇和山梨醇发酵产酸；甘油、麦芽糖、乳糖和蔗糖发酵不产酸。另外本菌株不能在45℃生长。Y22菌株在Luria-Bertani(LB)平板上于28℃下培养48小时的培养特征为圆形，不透明，中间突起，白色，边缘有毛状突起。在以尼古丁为唯一碳氮源的培养基上培养48后会产生灰色色素。

红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)菌株的分子鉴定特征为：利用通用引物20F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1500R(5’-GGTTACCTTGTTACGACT-3’)，以红球菌Y22的基因组DNA作为模板扩增得到1500bp左右的PCR产物，回收测序、校正之后得到的Y22菌株的部分16S rRNA基因序列1485bp，该序列已经递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列索引号为：FJ236510。

本发明按常规方法用常规设备制备。即将红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)扩大发酵培养后得到。

本发明的红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)作为降低烟草中尼古丁含量的的生物催化剂应用。

本发明具有可调整烟叶原料的尼古丁含量，提高烟叶可用性，及可分解烟尘中的尼古丁，减少其对环境的污染等优点。

附图说明：

图1为Rhodococcus sp.Y22耐受尼古丁浓度试验结果。

图2为红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)降解尼古丁的生长曲线。

具体实施方式：

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。

本发明是这样实现的：

1.红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)的培养方法：

1)试管斜面培养

采用Luria-Bertani(LB)培养基，重量百分比配方为：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物，2％琼脂。121℃灭菌25分钟，摆成斜面。接种Rhodococcus sp.Y22，28℃培养48小时，获得试管种。

2)液体扩大培养

A.种子培养(LB培养基)，重量百分比配方为：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物。121℃灭菌25分钟。接种Rhodococcus sp.Y22，28℃培养48小时，获得液体菌种。

B.发酵培养基：1g尼古丁，0.26g K₂HPO₄.3H₂O，0.8g KH₂PO₄，0.41gMgSO₄.7H₂O，0.1g CaSO₄·H₂O，0.0039g NaMoO₄，0.005g FeSO₄·7H₂O，0.3g(NH₄)₂SO₄，加水至1000mL，pH7.0。培养基初始pH7.0，接种量(体积百分比，v/v)2％，转速150rpm，温度28℃。发酵培养24小时。

2.红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)耐受尼古丁浓度试验

将培养12小时的液体菌种(OD600≈0.4)以1％(液体菌种体积百分比，v/v)的接种量接于尼古丁梯度的发酵培养基中，尼古丁的梯度为0gL^-1、0.5gL^-1、1.0gL^-1、1.5gL^-1、2.0gL^-1、2.5gL^-1和3.0gL^-1，转速150rpm，温度28℃，培养48小时离心收集菌体，用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤三次后用等体积缓冲液重悬并测定OD600(图1)。

由图1的试验结果可见：红球菌Y22菌株在本试验条件下，最适生长尼古丁浓度为1.5gL^-1，最高尼古丁耐受浓度为3gL^-1。

3.红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)降解尼古丁的生长曲线

将培养12小时的液体菌种(OD600≈0.4)以1％(液体菌种体积百分比，v/v)的接种量接于发酵培养基中，转速150rpm，温度28℃，每隔4～9小时取菌液，用高效液相测定尼古丁含量，并测定OD600(图2)。

由图2得出如下结果：随着红球菌Y22菌株在发酵液的浓度逐渐增加，尼古丁的浓度逐渐下降。当发酵时间为52小时，尼古丁基本被完全降解。在本试验条件下，尼古丁减少和菌体浓度的增加保持一致，0～20小时为其延滞期，20～47小时为指数生长期，到52小时尼古丁降解完毕细菌生长进入稳定期。

4.红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)降解尼古丁菌制剂的制备

利用发酵培养基制备1000mL的发酵液，8000rpm离心15min收集菌体，把菌体用灭菌的缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)进行悬浮，8000rpm离心15min收集菌体，重复两次，菌体细胞最后用50ml的缓冲液进行悬浮，即能用于降解尼古丁。

5.红球菌Y22(Rhodococcus sp.Y22)制剂的降解烟叶中尼古丁试验

分别称取2g保山B3F烟叶，喷洒5ml菌制剂，并分别喷洒5ml、10ml和15ml缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)作为三个梯度，每个梯度三个重复，以未喷洒菌制剂的烟叶作为对照，置于恒温培养箱中28℃反应3天，每隔12小时摇匀一次。反应完毕后每一组都添加缓冲液至总体积为30ml并放于4℃冰箱中过夜，浸出液经离心和稀释2倍后用高效液相进行尼古丁含量测定(表1)。

表1：Rhodococcus sp.Y22菌制剂降解烟叶中尼古丁的结果

由表1得知：在本试验的条件下，Y22菌株降解烟叶中尼古丁的效果明显；缓冲液的用量对Y22菌株降解烟叶中尼古丁的影响较大，尼古丁的降解率与缓冲液的用量呈正相关。