人肺癌高转移细胞系SPC－A－1sci的建立

摘要

本发明属于细胞生物学领域，公开了一种人肺癌高转移细胞SPC－A－1sci；本发明还公开了该细胞系的用途。所述的人肺癌高转移细胞亚系SPC－A－1sci具有肺癌转移率高且恶性程度高的特点，是一种理想的研究肿瘤转移的模型。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，更具体地，本发明涉及人肺癌小鼠高转移模型及细胞系的建立。

背景技术

肿瘤转移是一个多阶段、多步骤、多因素、多基因相互作用的极其复杂的过程，自癌细胞从瘤母体脱离到转移灶形成要经过黏附与解黏附、蛋白酶水解、运动等各种复杂过程和机制。

在恶性肿瘤患者体内，进入淋巴管或血管的瘤细胞可以有很多，但是只有某些瘤细胞亚群得以优势生长，获得转移表型，这些具有高转移潜能的瘤细胞才易发生转移。动物实验也证明：将T241肉瘤细胞移植于C₅₇BL/6小鼠后，24小时在血液中就可查见活的瘤细胞，但到第7天后方出现转移；将放射性标记的肿瘤细胞注入动物血管中，进入血循环24小时后，能够存活的瘤细胞仅1％，而最后抵达某一部位产生继发灶的不到0.1％。

目前，尽管国内外有学者采用筛选的方法成功建立了高转移模型，例如：Krasagakis等曾经从皮肤神经内分泌细胞癌的淋巴结转移灶中建立了癌细胞系。Lee等从前列腺癌硬脑膜转移灶中建立了癌细胞系。Seki等从人肝癌淋巴结转移灶中建立了一个细胞系。但是，目前少见成功构建理想的人肺癌皮下移植转移模型的报道。因此，本领域还需要进一步研究开发出人肺癌高转移模型及细胞系。

发明内容

本发明的目的在于提供人肺癌小鼠高转移模型及细胞系，以及所述模型或细胞系的用途。

本发明的另一目的还在于提供构建人肺癌小鼠高转移模型及细胞系的方法。

在本发明的第一方面，提供一种人肺癌高转移细胞，所述细胞在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：C200726。

在另一优选例中，该细胞的染色体为近端着丝，异倍体核型，染色体数量为58-72条。

在另一优选例中，该细胞的肺转移率高于90％。更特别的，该细胞的肺转移率为100％。

在另一优选例中，该细胞的自然凋亡率低于2％。

在另一优选例中，所述细胞中，黏附相关的基因表达上调；所述的黏附相关的基因选自：CD44v6，CD54，Timp-2。

在本发明的第二方面，提供所述的人肺癌高转移细胞的用途，用于筛选肺癌转移相关基因。

在本发明的第三方面，提供一种筛选潜在的肺癌转移相关基因的方法，所述方法包括步骤：

将所述的人肺癌高转移细胞中表达的基因与常规肺癌细胞中表达的基因比较，选出人肺癌高转移细胞中在统计学上表达上调的基因，该基因为潜在的肺癌转移相关基因。

在另一优选例中，所述方法还包括：

对所获得的潜在的肺癌转移相关基因进行进一步的细胞试验和/或动物试验，以选出对于肺癌的转移起确切作用的基因。

在另一优选例中，所述的常规肺癌细胞选自：肺癌低转移细胞或原发癌细胞。

在另一优选例中，所述的常规肺癌细胞是SPC-A-1细胞。

在本发明的第四方面，提供所述的人肺癌高转移细胞的用途，用于筛选抗肿瘤转移药物；或用于体外肿瘤转移(优选非治疗性的)的研究。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A显示了移植了皮下移植瘤后，小鼠体内产生的肺转移灶；

图1B是图1A的放大显示。

图2显示了肺转移灶的病理分析，其中，

A.SPC-A-1sci皮下瘤(HE×100)；

B.SPC-A-1皮下瘤(HE×100)；

C.SPC-A-1sci肺转移灶(HE×100)；

D.SPC-A-1sci肺转移灶(HE×400)。

图3显示了两个细胞株的细胞形态(光镜×250)，其中，

A.SPC-A-1sci细胞；

B.SPC-A-1细胞。

图4显示了SPC-A-1sci和SPC-A-1两个细胞株的生长曲线。

图5显示了SPC-A-1sci细胞染色体分析的结果。

图6显示了两个细胞株流式细胞术分析的结果，其中，

A.SPC-A-1sci细胞；

B.SPC-A-1细胞。

图7显示了两个细胞株自然凋亡率的流式细胞分析，其中，

A.SPC-A-1sci细胞；

B.SPC-A-1细胞。

图8显示了表达上调的与黏附相关的基因(CD44v6，CD54，Timp-2)的免疫组化检测的结果(×250)。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究和反复的筛选，找到一种肺癌转移率高且恶性程度高的人肺癌高转移细胞。所述的人肺癌高转移细胞是一种理想的研究肿瘤转移的模型。基于此完成了本发明。

人肺癌高转移细胞

肿瘤细胞存在一定的异质性，它们之间的转移潜能存在差异。本发明人进行反复的筛选，旨在找到转移潜能高的瘤细胞亚群。

与原发瘤细胞相比，经筛选后的细胞可能有一些特殊的性状赋予了它们特殊的转移能力。通过寻找这些机制，设计相应的阻断靶点，即可能抑制转移。并且，经过传代筛选后的高转移潜能的肿瘤细胞可以具有更强的侵袭性和转移性，易粘附、高产溶解酶以及具有各种抗宿主免疫防御的特性，因而也更容易发生转移。因此，从肿瘤转移灶中建立相应的肿瘤细胞系，对寻找决定转移性状的分子机制及转移相关基因等具有重要意义。

因此，本发明人从原发性(或低转移)肿瘤细胞出发，经多代筛选，找到了具有特殊高转移能力的肿瘤细胞亚系。具体而言，本发明所述的人肺癌高转移细胞是通过以下方法、经过长期的分析和筛选而获得的：将人肺癌细胞系SPC-A1移植至T细胞、B细胞、NK细胞缺陷的NOD-SCID小鼠的皮下，待肿瘤长至足够大时手术切除肿瘤，从小鼠体内获得肺转移灶，然后按肺转移灶→皮下移植→肺转移反复多代筛选得到自发性高转移动物模型，同时建立相应的高转移细胞系。本发明人将该细胞系定名为人肺癌高转移细胞亚系SPC-A-1sci，其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)的保藏号为CCTCC NO：C200726。

在体外建立人癌细胞株是研究人类肿瘤的一个重要手段。肿瘤细胞的体外培养建株是一项难度较大的工程，原发瘤组织直接用于体外建系的成功机率较低。高活力瘤组织是体外建株的重要因素。本发明人以新鲜的经过体内4次反复筛选得到的人肺癌皮下高转移模型的皮下移植瘤作为体外培养建系的瘤源，一方面可以增强癌细胞的活力，另一方面可以使新建细胞系本身具有较高的转移潜能。在建系的过程中，本发明人不断摸索和调整培养条件和培养方法，同时保证培养环境的相对稳定，成功地建立了人肺癌皮下高转移细胞系SPC-A-1sci，至今已传至22代。

细胞形态学观察显示：所述的SPC-A-1sci细胞形态为典型的上皮样细胞，细胞生长速度较快，倍增时间为28.56小时，而肺癌细胞SPC-A-1的倍增时间为29.19小时。

染色体分析证实：SPC-A-1sci细胞染色体核型变异较大，呈异倍体核型；出现了数目和结构的畸变，染色体范围变化较大为58-72条，以亚三倍体为主，提示该细胞具有人类恶性肿瘤细胞染色体的特点。

流式细胞术结果显示：所述的SPC-A-1sci细胞系均一性较好，处于G2-M期和S期的细胞较多，且凋亡率低，说明肿瘤的恶性程度较高，细胞增殖较旺盛。可以通过检测细胞周期和细胞凋亡率作为模型的一个间接评价指标，判断肺癌的恶性程度。

人肺癌高转移细胞的应用

本发明还提供了人肺癌皮下移植瘤高转移模型或人肺癌高转移细胞SPC-A-1sci的用途，包括(但不限于)用于：研究肿瘤(特别是肺癌)转移和/或侵袭的机制；筛选潜在的肺癌转移相关基因；筛选抗肿瘤(特别是肺癌)转移的药物等。

本发明还提供了一种筛选潜在的肺癌转移相关基因的方法，所述方法包括步骤：将所述的人肺癌高转移细胞中表达的基因与常规肺癌细胞(如肺癌原发癌细胞或肺癌低转移细胞)中表达的基因比较，选出人肺癌高转移细胞中在统计学上表达上调的基因，该基因为潜在的肺癌转移相关基因。

在细胞中检测相关基因的表达情况(如上调或下调)是本领域技术人员熟知的技术，包括(但不限于)：基因芯片技术、免疫组织化学技术等。例如，可将SPC-A-1sci细胞的基因表达情况与原发性(或低转移)肿瘤细胞的相关基因表达情况进行比较，从而找出具有统计学意义差异表达的基因。

作为本发明的优选方式，本发明人利用cDNA芯片技术对比分析筛选前(低转移或不转移细胞，SPC-A-1)、筛选后(高转移，SPC-A-1sci)肿瘤细胞中差异表达基因。获得7649条差异表达基因，其中上调基因3891个，下调基因3758个；2⁴倍以上差异基因共3244个，上调2698个，下调546个；2⁶倍以上差异基因共365个，上调178个，下调187个；2¹⁰倍以上差异基因共20个，上调10个，下调10个。上述基因的基因功能涉及细胞黏附、凋亡、转录、信号传导、细胞周期和代谢等，并且这些基因中相当一部分至今没有报道与肺癌转移相关。

这些初步筛选出的潜在的肺癌转移相关基因可构成一个筛选库，可对这些基因进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以便于最终可以从中筛选出能够对于肺癌的转移起确切作用的基因。

本发明的主要优点在于：

(1)通过反复的体内筛选，成功建立了人肺癌皮下移植瘤高转移模型及高转移细胞系，其转移率高、转移稳定、直观性好、靶向性强。

(2)利用本发明的肺癌高转移细胞系，为肺癌的防治研究及抗转移治疗提供了理想的模型。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

实验动物和细胞株

SPF级NOD-SCID小鼠(T、B、NK细胞联合免疫功能缺陷)，鼠龄6～7周，体重18-22g，雄性，生产许可证号为SCXK(沪)2002-0001，使用许可证号为SYXK(沪)2002-0009。所用垫料、饮水、全价颗粒饲料及其它与动物接触的物品均经高压灭菌处理。实验和饲养条件严格按照SPF动物的规范要求。

人肺癌细胞株SPC-A-1购自中国科学院上海生化细胞研究所。

试剂

Dulbecco MEM(DMEM)培养基购自SIGMA-ALDRICH公司；胎牛血清购自PAAlaboratories GmbH公司；胰蛋白酶购自GIBCO BRL公司；生理盐水，庆大霉素，10％中性甲醛溶液，Giemsa染色液，PBS缓冲液，秋水仙素等均为进口分装或国产分析纯试剂。Affymetrix U133 plus2.0基因芯片由上海生物芯片有限公司提供。

抗CD44v抗体，抗CD54抗体，抗Timp-2抗体均购自SANTACROZ公司。

仪器与设备

CO₂培养箱为Heraeus产品，型号为BB16UV；超净工作台由苏州净化设备有限公司生产，型号为SW-CJ-2FD；倒置显微镜为重庆光电仪器有限公司产品，仪器型号为XDS-1B；流式细胞仪由美国Becton Dickinson公司生产，仪器型号为FACS Calibur。

眼科剪，眼科镊，显微剪刀，显微镊，培养皿及培养瓶，20号套管针，电热真空灭菌器。

皮下移植瘤模型的建立

采用穿刺法，将SPC-A-1细胞移植在NOD-SCID小鼠的右侧近腋部皮下部位，从而形成皮下移植瘤。当皮下移植瘤长至直径10mm左右时，颈椎脱臼法处死NOD-SCID小鼠，剥取出移植瘤，清除外周血块及结缔组织，用含抗菌素的生理盐水冲洗，切取生长良好、淡红色、鱼肉状的瘤组织，将其剪切成直径约1.5mm的小块，用20号套管针移植至其它NOD-SCID小鼠皮下，建立皮下移植瘤模型。

皮下移植肺靶向转移模型的筛选

建立皮下移植瘤模型后，待瘤径长至1.5cm时手术切除肿瘤，动物处于濒死状态时进行系统解剖，取肉眼明显可见的肺转移灶移植至另外NOD-SCID小鼠皮下，按肺转移灶→皮下移植→肺转移灶→皮下移植的体内筛选方式进行鼠间反复筛选。

原代10只NOD-SCID小鼠，其它每代7～9只NOD-SCID小鼠，筛选至肺转移率达100％，建立相应细胞系。

人肺癌高转移细胞系的建立及传代

将荷瘤小鼠颈椎脱臼法处死，无菌条件下取出皮下移植瘤，剔除坏死组织、纤维包膜及血管。用含双抗(青霉素和链霉素)的PBS洗2次，向组织滴1-2滴含10％胎牛血清的DMEM培养液，用显微剪刀和显微镊将其尽量剪成小块。用吸管将剪切好的组织块送入25cm培养瓶并在瓶壁上均匀放置，每一小块间距0.5cm左右。然后将培养瓶轻轻翻转，瓶底朝上，瓶内注入适量培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在37℃、含5％ CO₂的培养箱内。4h后待组织小块贴壁后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。以后所建立的原代细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液进行常规培养和传代。

在筛选肺癌高转移细胞系时的观察和分析项目

1.NOD-SCID小鼠皮下移植瘤生长情况

人肺癌组织块皮下移植后定期观察小鼠一般活动、营养状态及移植瘤的潜伏期、成瘤率和生长情况。

2.NOD-SCID小鼠解剖学和组织病理学观察

动物濒死状态时处死，进行详细的解剖学检查。皮下移植瘤及主要脏器用10％中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察。

3.细胞生长曲线测定

筛选获得的人肺癌高转移的单细胞悬液加入24孔板培养，每孔含4×10⁴个细胞。次日消化计数3孔细胞，连续计数5天，绘制生长曲线，按下列公式计算细胞倍增时间：TD＝T×log2/log(N/N₀)(TD：倍增时间，T：时间间隔；N₀：起点细胞数，N：终点细胞数)。

未经筛选的人肺癌细胞株SPC-A-1以同样方法进行测定作为对照。

4.染色体分析

筛选获得的人肺癌高转移细胞用胰蛋白酶消化，1000rmp/min离心10min，吸弃上清液。逐滴加入4ml预温37℃的0.4％的KCL、4ml的0.4％柠檬酸钠和40μl秋水仙素(终浓度0.1μg/ml)，低渗处理120分钟，其间每隔20分钟吹打一次，加入1ml固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)混匀预固定，1000rmp/min离心10min，吸弃上清液。加入8ml固定液固定30min，1000rmp/min离心10min，吸弃上清液，再重复固定1次，最后用适量固定液制成细胞悬液，制片，Giemsa染色，封片，拍照。挑选分散良好的30个分裂中期细胞进行染色体分析。

5.流式细胞术分析

SPC-A-1sci及SPC-A-1细胞各取两个样本，用PBS洗一遍，调整浓度到1×10⁶/ml左右；离心去掉上清液，加入1800μl A溶液(胰酶消化液)充分作用；加入1500μl B溶液(胰酶抑制酶液，RNase)数分钟；加入1500μl C溶液(PI-碘化丙锭)作用15分钟以上；用200目尼龙网再次过滤；上机(FCM)，做DNA细胞周期采样分析。

6.SPC-A-1sci及SPC-A-1细胞基因差异分析

利用基因芯片技术进行细胞基因差异分析。采用的基因芯片是AffymetrixU133 plus2.0(购自上海生物芯片有限公司)。由上海生物芯片有限公司提供实验支持及数据处理。主要如下：

A.总RNA的提取(TRIzol法)

(1)均质化：每2×10⁶细胞加入1ml TRIzol，移液器反复吹打。

(2)均质化的样品在15～30℃放置5分钟，然后加入0.2倍体积的氯仿，盖子盖紧后剧烈振摇15秒使混匀，在15～30℃放置2～3分钟，4℃ 7000rpm离心15分钟，离心后形成下层红色的酚氯仿相，中间相和上层无色水相。

(3)将上层水相转移至一个新的离心管，加入0.8倍体积的异丙醇，剧烈振摇使混匀，4℃ 7000rpm离心15分钟，弃上清。

(4)加入70％酒精，颠倒离心管数次以洗去沉淀所含盐分。如沉淀较大可用Tip头先将沉淀打散。然后4℃ 7000rpm离心10分钟，弃上清。

(5)重复以上步骤1次。

(6)15～30℃晾干，然后加入适量的无RNase的水溶解。

(7)用分光光度计分析RNA浓度，在260nm 1OD值约等于40μg/ml的RNA。

(8)需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度。

(9)A₂₆₀/A₂₈₀应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)。

(10)1％琼脂糖电泳或Agilent BioAnalyzer。

(11)利用QIAGEN RNeasy Total RNA Isolation kit)纯化总RNA，具体方法参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册。

B.准备Poly-A RNA Control

(1)取2μL Poly-A RNA Control Stock，加入38μL的Poly-A Control DilBuffer(1:20稀释)。混匀，离心将液体收集在管底。

(2)从第一次稀释液中取2μL再加入98μL的Poly-A Control Dil Buffer(第二次1:50稀释)。混匀，离心将液体收集在管底。

(3)从第二次稀释液中取2μL再加入18μL的Poly-A Control Dil Buffer(第三次1:10稀释)。加2μL第二次稀释液至5μg总RNA样品中。

C.第一链cDNA合成

(1)引物杂交：在Eppendorf管中加入5×First strand cDNA buffer 4μl，0.1MDTT 2μl，10mM dNTP mix 1μl，然后70℃温浴10分钟，稍微离心，立即放置冰上至少2分钟。

(2)温度调节：在相应Eppendorf管中加入T7-(d7)24 primer 50μM2μl(100pmol)，RNA 1-8μg/8.1-16μg，稀释的Poly-A Control 2μl，加入DEPC水到12μl/11μl混合均匀，42℃温浴2分钟。

(3)第一链合成：在反应管中加入相应体积的SuperScript II(1-8μg总RNA+1μL SuperScript II；8.1-15μg总RNA+2μL SuperScript II)，混合均匀，42℃温浴1小时，反应结束放置冰上至少2分钟。

D.第二链DNA合成和双链DNA纯化

(1)第一链反应完毕放置冰上。稍微离心甩下管壁试剂。

(2)在第一链合成的管中加入下列第二链反应试剂(终体积130μl)：DEPC处理水91μl，5×Second strand cDNA buffer 30μl(1×)，10mM dNTP 3μl(200μMeach)，10U/μl E.coli DNA连接酶1μl(10U)，10U/μl E.coli DNA聚合酶I4μl(40U)，2U/μl E.coli Rnase H 1μl(2U)。

(3)混匀。稍微离心，16℃放置2小时。

(4)加2μl 10U/μl T4 DNA聚合酶，6℃放置5分钟，加10μl 0.5M EDTA终止反应。

(5)继续纯化cDNA步骤，或-20℃储存。

(6)常规方法纯化双链DNA。

E.生物素标记cRNA合成

(1)在Eppendorf管中加入：模板DNA，10×IVT Labeling Buffer 4μl，IVTLabeling NTP Mix 12μl，IVT Labeling Enzyme Mix 4μl，加水至终体积40μl。

(2)37℃温浴16小时，每隔30～45分钟600rpm振荡10秒

(3)QIAGEN RNeasy Total RNA Isolation kit纯化生物素标记的cRNA，具体方法参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册。

(4)cRNA质控：用分光光度计分析RNA浓度。

(5)按下面的计算公式确定调整cRNA的含量：

调整cRNA含量＝mRNA-(total RNA_i)(y)；

mRNA＝IVT后测得cRNA量(μg)；

total RNA_i＝开始总RNA的量(μg)；

y＝在IVT过程中使用的cDNA的倍数。

F.杂交

(1)片断化cDNA

a)在新的1.5mL RNase-free离心管中加入：20μg cDNA 1-32μl，5×Fragmentation Buffer 8μl，RNase-free水到40μl。

b)94℃，35分钟。反应结束后放置冰上。

c)变性凝胶电泳，至少需要1μg cDNA。

(2)杂交

a)芯片使用前需平衡至室温。

b)确定芯片的类型(Micro/Mini Array，Midi Array，Standard Array)。

c)在新的1.5mL RNase-free离心管中配制杂交液。

d)杂交液先99℃，5分钟，然后45℃，5分钟。

e)在进行上述步骤的同时通过加样孔加入适量体积1×杂交缓冲液湿润芯片。

f)杂交炉中45℃，60rpm预杂交芯片10分钟。

g)步骤d处理过的样品最大速离心5分钟。

h)从芯片中取出杂交缓冲液，加等体积处理好的杂交液。

i)杂交炉中45℃，60rpm杂交芯片16小时。

G.洗脱、染色、扫描芯片

芯片结果采用Affymetrix扫描仪进行扫描，GCOS软件读取、处理数据。

H.差异基因表达情况的检测

取SPC-A-1(T)及SPC-A-1两种细胞的皮下移植瘤以10％中性甲醛固定，石蜡切片常规脱蜡水化，内源性过氧化物酶阻断10min，一抗孵育过夜(4℃)，二抗孵育20min(室温)，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶孵育20min(室温)，DAB显色，苏木素衬染后常规脱水，透明，封片。检测差异基因在两种细胞中的表达情况。判断标准：阳性为棕黄色或棕褐色着色。检测结果使用IMS细胞图象分析系统及医学图象分析软件进行分析(上海申藤信息技术有限公司)，测量结果为免疫组化图像中阳性区域面积，阳性比率处理公式：总面积＝351000像素点；1素点＝0.095μm²；阳性率＝阳性面积/总面积。

II.实施例

实施例1.高转移动物模型的建立

经体内反复筛选，成功地建立了人肺癌高转移模型。筛选传代的NOD-SCID小鼠，皮下100％成瘤，肺转移率1至3代分别为66.7％(6/9)，71.4％(5/7)，77.8％(7/9)，第4代起肺转移率保持100％(9/9)，见表1和图1。

表1 人肺癌高转移模型肺转移情况

^*：中间因不明原因死亡一只小鼠

随着筛选次数的增加，肉眼可见肺转移的动物数也随之增加，病理检测出肺转移的动物数也相应增加。

实施例2.组织病理学观察

光镜下皮下移植瘤细胞呈巢状或条索状排列，肿瘤细胞呈圆形、椭圆形或不规则形，细胞分化差，核大，深染，核质比大，核分裂相多见；肺转移灶的肿瘤细胞形态与皮下瘤的细胞形态基本一致，多散在分布于肺实质内，以支气管周围为主，部分转移灶分布于肺小血管周围，镜下可见肿瘤细胞呈浸润性生长，部分肺组织结构被破坏，肺泡消失，见图2C-D。

本发明人还发现，成瘤后期，SPC-A-1肿瘤细胞的坏死要多于筛选后的SPC-A-1，见图2A-B。

实施例3.高转移细胞系的建立和分析

将体内4次筛选后的瘤组织取出后静置培养。第2天部分细胞开始贴壁，小组织块周围有少许细胞向外游出，第4天细胞已经牢固贴壁，更换培养液。此后，根据细胞生长情况传代，随着传代次数的增加成纤维细胞可完全去除。此后每2-3天传代一次，中间更换培养液一次，细胞生长良好，命名为SPC-A-1sci，目前已传至22代。所述的SPC-A-1sci在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：C200726。

细胞形态学

SPC-A-1与SPC-A-1sci细胞均为典型的多角形上皮样细胞，贴壁生长，细胞之间紧密相靠、互相衔接，排列紧密，界线清楚，胞浆丰富，胞核大而圆，见图3。

细胞生长曲线

SPC-A-1sci与SPC-A-1细胞倍增时间分别为28.56小时和29.19小时，前者生长略快于后者。前期细胞生长速度较慢，第4天进入对数生长期，细胞数呈指数级增加，见图4。

染色体分析

SPC-A-1sci染色体为近端着丝，呈异倍体核型，以亚三倍体为主。染色体范围为58-72条，见图5。

染色体的分析结果显示，SPC-A-1sci细胞具有人类恶性肿瘤细胞染色体的特点。

流式细胞术分析

流式细胞分析结果见表2，以及图6、图7，SPC-A-1sci与SPC-A-1细胞周期各时相的比例及自然凋亡率均存在差异。SPC-A-1sci处于G2-M和S期的细胞占52.65％，自然凋亡率为1.42％；SPC-A-1处于G2-M和S期的细胞占36.08％，自然凋亡率为5.70％。SPC-A-1sci处于活跃期的细胞较多，且细胞的自然凋亡率较低。

表2 NOD-SCID小鼠人肺癌高转移细胞系细胞周期及凋亡率分析

实施例4.差异基因分析

通过cDNA芯片筛选出与肿瘤转移相关的基因按照功能分类主要分为：细胞凋亡相关基因、细胞粘连相关基因、细胞代谢相关基因、细胞周期相关基因、细胞运动相关基因、细胞信号传导相关基因、细胞骨架相关基因、血管生成相关基因以及可能具有研究价值的新基因等几大类。其中，SPC-A-1sci与SPC-A-1相比，2倍以上差异基因共7649个，其中上调基因3891个，下调基因3758个；2⁴倍以上差异基因共3244个，其中上调2698个，下调546个；2⁶倍以上差异基因共365个，其中上调178个，下调187个；2¹⁰倍以上差异基因共20个，其中上调10个，下调10个。在表达上调的基因中包括黏附相关的基因CD44v6、CD54、与Timp-2。

通过功能分类对差异基因(2²倍以上)进行综合分析，其分类结果如表3所示。

表3 差异表达基因的功能分类

 

基因种类SPC-A-1sci与SPC-A-1相比上调基因数目SPC-A-1sci与SPC-A-1相比下调基因数目SPC-A-1sci与SPC-A-1相比差异表达基因数目细胞黏附15144195细胞凋亡564096血管生成261440代谢221400621信号传导307249556细胞周期12784211转录翻译423531954蛋白修饰及运输301308609细胞运动444892细胞骨架362763未知功能122613342560其它9736791652

根据基因芯片分析结果，本发明人选取表达上调的与黏附相关的基因进行免疫组化分析，结果发现CD44v6、CD54、与Timp-2蛋白在SPC-A-1中的平均阳性率分别为：47.00％、58.83％、64.83％，在SPC-A-1sci中的平均阳性率为：55.08％、80.80％、68.17％。CD44v6、CD54、与Timp-2在SPC-A-1sci中的表达高于SPC-A-1，经X²检验，结果显示二者有极显著统计学意义，P<0.001，见表4，图8。与基因芯片结果相符。

表4 免疫组织化学分析

                                    [x，A/μm²]

* SPC-A-1sci与SPC-A-1相比，P<0.001。

综上所述，本发明人通过反复筛选的方法成功建立了人肺癌皮下移植瘤高转移模型，同时从中分离出了一个高转移亚系SPC-A-1sci，并进行了相关生物学特性的深入研究。结果证明该模型是一个转移率高、转移稳定、直观性好、靶向性强并具备一定人肺癌生物学特性的模型，为深入研究人肺癌转移的分子机制提供了较为理想可靠的模型。

生物材料保藏

本发明涉及的人肺癌高转移细胞亚系SPC-A-1sci已经保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏号为CCTCC NO：C200726，保藏日为2007年9月5日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。