一种用于原产地人参保护的HPCE指纹图谱鉴别方法

摘要

本发明提供一种用于原产地人参保护的HPCE指纹图谱鉴别方法，其特征在于包括如下步骤：A.建立原产地人参指纹图谱：以同一产地的人参为标准品，通过毛细管电泳分析建立其电泳指纹图谱；B.检测样品：取待检测的人参样品分别与标准品相同的条件检测，得出检测样品的谱图，将两者的指纹图谱用直接观察法或指纹图谱软件分析作为定性依据。本发明步骤简单，周期短，耗费低，建立的人参药材指纹图谱化学信息比较丰富，获得的特征峰，很容易区别人参的产地、种类，可为原产地人参药材质量控制提供参考。经方法学的考察表明：其仪器精密度及样品稳定性和重现性均具有较好的应用前景，适于在药品安全检测技术领域推广。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于原产地人参保护的HPCE指纹图谱鉴别方法，属于毛细管电泳分析技术领域。

背景技术

人参是多年生草本植物，属于五加科植物的干燥根。主根肉质，圆柱形或纺锤形，须根细长；根状茎(芦头)短，上有茎痕(芦碗)和芽苞。人参主要产于大小兴安岭和长白山。其中，尤以长白山地区出产的人参品质更优。但是由于人参种类和生长的地理环境不同、炮制方法不同，导致价格差别很大，所以鉴别人参的真伪、优劣是当务之急。目前人工种植的人参一般称为“园参”；将园参刺成蜂窝状后用糖水浸泡，晾干后就称为“白参”；将幼小的野山参移植于田间或将幼小的园参移植于山野而成长的人参称为“山参”。目前尚无原产地人参的国标推荐鉴别方法，有报道的人参检测方法主要是高效液相色谱的分析研究，用Zorbax SB-C18色谱柱，在203nm用乙腈-水做流动相进行梯度洗脱，共标示出人参药材指纹图谱中18个共有峰，并对10批人参药材谱图的相似度结果进行了计算。该方法的主要缺点是：高效液相色谱法分析人参的指纹图谱，检测分离的物质较少，仅仅从成分的含量上给出差异，没有各自产地的指纹区，而且该测定方法比较复杂，分析周期长，耗材费用高，色谱柱易污染且不容易清洗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以显著显示指纹区，步骤简单，周期短，耗费低，检测准确的原产地人参指纹图谱的毛细管电泳检测方法。

本发明的技术方案是这样实现的：这种用于原产地人参保护的HPCE指纹图谱鉴别方法，其特征在于包括如下步骤：

A、建立原产地人参指纹图谱

以同一产地的人参为标准品，通过毛细管电泳分析建立其电泳指纹图谱；

B、检测样品

取待检测的人参样品分别与标准品相同的条件检测，得出检测样品的谱图，将两者的指纹图谱用直接观察法或指纹图谱软件分析作为定性依据。

所述的用于原产地人参保护的HPCE指纹图谱鉴别方法，其特征在于包括如下步骤：

A、对标准品人参进行前处理：将人参药材于烘箱内60℃干燥4h，粉碎、过筛收集80mesh以下细粉，称量3.0g，加80％乙醇溶液热回流提取2次，每次3h，合并滤液后自然过滤，然后旋转蒸发后，二次加水定容至10mL，阴冷处放置12h，取上层清液，0.22μm纤维素膜过滤，滤液作为供试品溶液；

B、电泳条件：

分离柱：75cm×75μm，有效长度65cm的未涂层毛细管柱；

缓冲溶液：20mmol/L硼砂溶液；有机添加剂：1％尿素水溶液；

检测波长：243nm；分离电压：18KV；毛细管温度：室温18～22℃；

进样方式：气动进样；

进样时间：3S；

进样压力：8KPa；

冲洗气：空气；

C、指纹图谱建立：按A步骤制备的标准品供试溶液，按B步骤电泳条件测定，记录主组分峰和共有峰在30min之内出现的电泳图，标定36个特征峰。

D、取市售的人参样品分别与标准品相同的条件处理和测定，得出检测样品的电泳图，将两者的指纹图谱相比较将两者的指纹图谱相比较以判定是否为同一产品。

方法学的考察

A、参照物的选择：

取标准品L-赖氨酸用超纯水溶解后定容于容量瓶中，配制成浓度为2.5μmol/L的标准溶液，用孔径0.22μm纤维素膜过滤，按照上述步骤电泳条件进行高效毛细管电泳仪分析，根据L-赖氨酸标准样品的电泳峰的保留时间作为定性标准。同时将人参标准品溶液和L-赖氨酸标准溶液按体积比1:1混合，按照上述电泳条件进行高效毛细管电泳仪分析，峰高加高定性法确定2号峰为L-赖氨酸。由于2号峰(L-赖氨酸峰)与邻组分分离良好，因此作为参照峰。

B、方法精密度的测定：

取长白山生晒园参同一供试品溶液，按照上述实验条件，平行测定5次，计算其中8个主组分峰相对于内标物峰的相对迁移时间和相对峰高值，结果见表1，指纹图谱见图2。

表1 仪器精密度的测试结果

结果显示，相对峰高的RSD为1.9％～3.4％，相对迁移时间的RSD为1.4％～2.3％，表明精密度良好。

C、方法重现性测定：

取长白山生晒移植山参同一样品五份，按1-B实验条件，每份分别平行测定5次，计算其中8个主组分峰相对于内标物峰的相对迁移时间和相对峰高值，结果见表2，指纹图谱见图1。

表2 方法重现性的测试结果

结果显示，相对峰高的RSD为1.2％～2.8％，相对迁移时间的RSD为1.7％～3.3％，说明方法重现性良好。

D、样品稳定性测定：

取保定药店生晒园参同一供试品溶液，按照1-B实验条件，分别在0，4，8，12，24h平行测定2次，计算其中8个主组分峰相对于内标物峰的相对迁移时间和相对峰高值，结果见表3，指纹图谱见图3。

表3 样品稳定性的测试结果

结果显示，相对峰高的RSD为1.1％～3.5％，相对迁移时间为RSD为1.3％～3.1％，说明样品至少在24h内稳定。

本发明采用毛细管区带电泳法对人参进行了指纹图谱研究，步骤简单，周期短，耗费低，建立的人参药材指纹图谱化学信息比较丰富，获得的特征峰，很容易区别人参的产地、种类，可为原产地人参药材质量控制提供参考。经方法学的考察表明：其仪器精密度及样品稳定性和重现性均具有较好的应用前景，适于在药品安全检测技术领域推广。

附图说明

图1是生晒移植山参的HPCE指纹图谱(产地：长白山)

图2是生晒园参的HPCE指纹图谱(产地：长白山)

图3是生晒园参的HPCE指纹图谱(来源：保定药店)

图4是白参的HPCE指纹图谱(来源：长白山)

图5是生晒园参的HPCE指纹图谱(来源：辽宁)

图6是生晒园参的HPCE指纹图谱(来源：吉林)

具体实施方式

本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明这种用于原产地人参保护的HPCE指纹图谱鉴别方法具体操作和应用方向，而不对本发明的范围构成任何限制。

1、建立原产地人参指纹图谱

A、以市售产地长白山的生晒移植山参为标准品做出HPCE指纹图谱

人参进行前处理：将人参药材于烘箱内60℃干燥4h，粉碎、过筛收集80mesh以下细粉，称量3.0g，加80％乙醇溶液热回流提取2次，每次3h，合并滤液后自然过滤，然后旋转蒸发后，二次加水定容至10mL，阴冷处放置12h，取上层清液，0.22μm纤维素膜过滤，滤液作为供试品溶液；

B、电泳条件：

分离柱：75cm×75μm，有效长度65cm的未涂层毛细管柱；

缓冲溶液：20mmol/L硼砂溶液；有机添加剂：1％尿素水溶液；

检测波长：243nm；分离电压：18KV；毛细管温度：室温18～22℃；

进样方式：气动进样；

进样时间：3S；

进样压力：8KPa；

冲洗气：空气；

C、指纹图谱建立：按A步骤制备的标准品供试溶液，按B步骤电泳条件测定(平行测定5次，重现性良好好)，记录其中一次电泳图记录主组分峰和共有峰在30min之内出现的电泳图如图1所示，标定36个特征峰。

2、样品检测

取市售的其它5种人参样品：长白山移植园参、保定药店购置人参、长白山白参、辽宁移植园参、吉林移植园参(人工种植的人参一般称为“园参”；将园参刺成蜂窝状后用糖水浸泡，晾干后就称为“白参”；将幼小的野山参移植于田间或将幼小的园参移植于山野而成长的人参称为“山参”，由于他们种类和生长的地理环境不同、炮制方法不同，化学成分有很大差异。)分别与标准品相同的条件处理和测定，得出被检测样品的电泳图，如图2、图3、图4、图5、图6所示。将两者的指纹图谱目测相比较，很容易区别人参的产地、种类，可为原产地人参药材质量控制提供参考。

由表5可知，不同的人参药材由于生长的地理环境、气候条件、种类和炮制方法不同而导致其主要化学成分的差异。虽然某些经处理过的养殖参中主要组分含量反而高于原产地人参，但是总组分不如原产的多，该方法可以很好的检测人参，为原产地人参药材质量控制提供参考。

表5 不同产地人参指纹图谱检测结果