基于脉冲超声波技术的油菜籽蛋白水解肽制备方法及用途

摘要

基于脉冲超声波技术的油菜籽蛋白水解肽的酶解制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：先将油菜籽饼粕粉碎加水溶解，然后脉冲超声处理，再将所得油菜籽蛋白溶液加入蛋白酶，对酶解体系施加脉冲超声处理，最后经过过滤、真空浓缩，再经过冷冻干燥或者喷雾干燥得到粉状的产品。该方法可以提高蛋白水解效率、提高酶的利用率、降低生产成本。利用该方法制得的油菜籽蛋白水解肽可以用于制备抑制体内血管紧张素转换酶活性的药物或者保健食品。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，具体涉及保健食品生产和生物制药技术，特指高效酶解制备油菜籽蛋白水解肽的方法。

背景技术：

来源于食品蛋白的血管紧张素转化酶抑制肽由于可以平稳降低高血压患者血压，且安全性高、毒副作用小，已成为近年来的研究热点之一。已报道有以牛奶、乳酪、大豆、鱼肉、蔬菜、小麦及大米蛋白等为原料，经蛋白酶酶解产生了具有较好血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。菜籽饼粕含有30～40％的优质蛋白，几乎不存在限制性氨基酸，营养价值优于任何其他植物蛋白，是一种理想的、潜在的优质蛋白资源，但原来一般仅作为生产饲料的原料，未作深加工开发利用，如果以其作为制备血管紧张素转化酶抑制肽的原料，不仅可以开发一种天然降血压产品，还可以延伸菜籽加工产业链，大幅提高经济效益。

目前血管紧张素转化酶抑制肽的生产主要是采用蛋白酶水解的方法。但是，常规酶解存在水解效率低、水解速度慢、水解度低、酶利用率低、生产成本较高等缺点。

超声波是一种纵波，在介质中传播时，会产生热效应、机械效应和空化效应，引起介质的一些特性变化。因为上述特性，超声波技术对有效成分的提取、高分子的降解、酶解反应等都有较好的促进作用。其中超声波酶促反应具有高效、廉价、无污染、操作简单、技术易推广应用等特点，可提高酶促反应速度和有效成分的产率。Atequad等研究发现，超声空化对木瓜蛋白酶构象、紫外光谱以及催化活性都有不同程度的影响。Sakaklbara等等观察到，在3种不同的超声强度下蔗糖酶水解蔗糖水解速度均高于对照；宿哲然等研究发现，40kHz、125W的超声波能有效地促进蛋清蛋白的酶解，使其水解度提高13％～35.48％；郭诗静等用超声处理猪胰脂肪酶，表明酶分子能更好地结合底物，加快酶促反应；于淑娟等的研究结果表明，超声波辅助酶解的灵芝多糖得率明显多于常规方法；MasanaoImai等将超声波预处理纤维素然后再酶解，酶解速度显著提高。然而，利用超声与酶解过程相结合的技术制备血管紧张素转化酶抑制肽的研究仅有本研究课题组的报道。

利用脉冲超声辅助酶解法制备血管紧张素转化酶抑制肽，可以提高蛋白水解效率、提高酶的利用率、降低生产成本。脉冲超声辅助酶解法制备油菜籽蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的研究，国内外未见报道。

发明内容：

本发明的目的是将脉冲超声波技术应用于油菜籽蛋白酶解反应，制备具有抑制体内血管紧张素转化酶活性的油菜籽饼粕水解肽的方法及用途。

本发明上述目的是通过以下技术手段实现的：先对油菜籽饼粕进行粉碎、用脉冲超声波进行处理溶解，其次用蛋白酶水解进行血管紧张素转化酶抑制肽的制备，在水解过程前期施加脉冲超声波，最后通过过滤、浓缩并再经喷雾干燥或冷冻干燥得到粉状的产品。

对粉碎后的油菜籽饼粕以与水1:4～1:20的比例加入水中形成混悬液，采用功率为10mW/mL～100mW/mL、工作/间歇比0.5:1～5:1的脉冲超声处理30～120min，使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽饼粕重量1％～15％的蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液进行酶解，酶解的温度为40-55℃，pH5.0-9.5，在酶解开始后对酶解体系采用频率为20kHz～40kHz、功率为1mW/mL～20mW/mL、工作/间歇比0.5:1～5:1的脉冲超声处理20～60min，停止超声处理，继续酶解，总共酶解时间2～5小时。酶解结束后，将酶解液加热到90℃保持15秒钟灭酶，再自然冷却到室温，用布袋式离心机过滤酶解液并把滤液真空浓缩到干物质浓度为30％(w/w)，再喷雾干燥或冷冻干燥得到油菜籽蛋白水解肽产品。以产品的质量占原料菜籽饼粕质量的百分比来表示油菜籽蛋白水解肽的得率。同时测定油菜籽蛋白水解肽对血管紧张素转化酶产生抑制作用的IC₅₀值(就是对ACE抑制率达到50％时的多肽水溶液的浓度，产物的IC₅₀值越小表示其对ACE的抑制活性越高)来反映油菜籽蛋白水解肽对血管紧张素转化酶抑制肽的抑制活性。

本发明所具有的优点是：

本发明采用脉冲超声波进行处理油菜籽饼粕后加酶水解，与经过同样酶解过程但不施加超声的对照试验相比，可以使酶解产物的肽得率提高30％到54％，IC₅₀值降低34％～46％，大大提高了酶解效率和产物的活性。

附图说明

图1是本发明制备油菜籽多肽方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1

对粉碎后的油菜籽饼粕以与水1:20的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，采用频率为20kHz功率为100mW/mL工作/间歇比1:1的脉冲超声处理90min，使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽饼粕重量1％(w/w)的碱性蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液进行酶解，酶解的温度为40℃，pH为9.5，在酶解开始后对酶解体系采用频率为20kHz、功率为10mW/mL、工作/间歇比0.5:1的脉冲超声处理30min，停止超声处理，继续酶解，总共酶解时间3h；酶解结束后，将酶解液加热到90℃保持15秒钟灭酶，再自然冷却到室温，用布袋式离心机过滤酶解液并把滤液真空浓缩到干物质浓度为30％(w/w)，再经喷雾干燥得到油菜籽蛋白水解肽产品。测定多肽产品的得率(多肽产品与原料的重量比率)和对ACE抑制率与IC₅₀值，具体测定方法如下：先将5μL的ACE加入10μL多肽样品在37℃下恒温5min，然后加入50μL的6.5mmol/L Hip-His-Leu(用100mmol/L的硼酸盐缓冲液配制，含300mmol/L的NaCl，pH为8.3)，在37℃下恒温反应30min后加入85μL的1mol/L HCl溶液终止反应。用HPLC进行分析，记录对应组分峰面积，同时用10μL 100mmol/L、pH为8.3的硼酸盐缓冲液作空白试验。

水解肽对ACE的抑制率可用下式计算：

$>R=\frac{A-B}{A}\times 100\%$>

式中：R——多肽对ACE的抑制率；

A——空白对照组Hip的峰面积；

B——多肽组Hip的峰面积。

IC₅₀测定方法是将要测定的水解肽分别稀释成几个梯度浓度的溶液，按照上述方法反应后分别测定溶液对ACE的抑制率，得出水解肽浓度与抑制率关系图，根据图确定50％抑制率所对应的这一水解肽样品的浓度即为IC₅₀。

对照试验：以粉碎的相同的菜籽饼粕以与水1:20的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下不施加超声提取5h，再按照上述相同酶解过程处理，但不施加超声，酶解结束后，将酶解液加热到90℃保持15秒钟灭酶，再自然冷却到室温，用布袋式离心机过滤酶解液并把滤液真空浓缩到干物质浓度为30％(w/w)，再经喷雾干燥得到油菜籽蛋白水解肽产品，测定多肽产品的得率和对ACE抑制率与IC₅₀值。

经过测定，无超声处理过程的酶解产物多肽得率和IC₅₀值分别为3.47％(w/w)和4.16mg/mL，有超声处理过程的酶解产物多肽得率和IC₅₀值分别为5.34％(w/w)和2.75mg/mL，可见，在同等过程条件下采用超声波的酶解产物肽得率提高54％，IC₅₀降低34％。

实施例2

对粉碎后的油菜籽饼粕以与水1:6.67的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，采用频率为22kHz功率为80mW/mL工作/间歇比5:1的脉冲超声处理20min，使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽饼粕重量2％(w/w)的中性蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液进行酶解，酶解的温度为55℃，pH为5.5，在酶解开始后对酶解体系采用频率为30kHz、20mW/mL、工作/间歇比1:1的脉冲超声处理60min，停止超声处理，继续酶解，总共酶解时间5h；酶解结束后，将酶解液加热到90℃保持15秒钟灭酶，再自然冷却到室温，用布袋式离心机过滤酶解液并把滤液真空浓缩到干物质浓度为30％(w/w)，再经喷雾干燥得到油菜籽蛋白水解肽产品。对照试验参见实施例1。

经过测定，酶解产物多肽得率和IC₅₀值分别为4.82％(w/w)和2.41mg/mL，与对照试验相比，酶解产物肽得率提高39％，IC₅₀降低42％。

实施例3

对粉碎后的油菜籽饼粕以与水1:4的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，采用频率为40kHz功率为10m W/mL工作/间歇比0.5:1的脉冲超声处理120min，使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽饼粕重量5％(w/w)的木瓜蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液进行酶解，酶解的温度为50℃，pH为6.5，在酶解开始后对酶解体系采用频率为28kHz、功率为5m W/mL、工作/间歇比2:1的脉冲超声处理45min，停止超声处理，继续酶解，总共酶解时间4h；酶解结束后，将酶解液加热到90℃保持15秒钟灭酶，再自然冷却到室温，用布袋式离心机过滤酶解液并把滤液真空浓缩到干物质浓度为30％(w/w)，再经喷雾干燥得到油菜籽蛋白水解肽产品。对照试验参见实施例1。

经过测定，酶解产物多肽得率和IC₅₀值分别为4.51％(w/w)和2.62mg/mL，与对照试验相比，酶解产物肽得率提高30％，IC₅₀降低37％。

实施例4

对粉碎后的油菜籽饼粕与水1:10的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，采用频率为24kHz功率为60m W/mL工作/间歇比3:1的脉冲超声处理40min，使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽饼粕重量1％(w/w)的碱性蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液进行酶解，酶解的温度为40℃，pH为9.0，在酶解开始后对酶解体系采用频率为40kHz、1m W/mL、工作/间歇比3:1的脉冲超声处理20min，停止超声处理，再继续酶解100min，调节pH值到6.0，同时调节酶解体系温度到50℃，加入占原料油菜籽饼粕重量1％(w/w)的中性蛋白酶继续酶解，总共酶解时间4h；酶解结束后，将酶解液加热到90℃保持15秒钟灭酶，再自然冷却到室温，用布袋式离心机过滤酶解液并把滤液真空浓缩到干物质浓度为30％(w/w)，再经喷雾干燥得到油菜籽蛋白水解肽产品。对照试验参见实施例1。

经过测定，酶解产物多肽得率和IC₅₀值分别为5.17％(w/w)和2.58mg/mL，与对照试验相比，酶解产物肽得率提高49％，IC₅₀降低38％。

实施例5

对粉碎后的油菜籽饼粕与水1:12.5的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，采用频率为33kHz功率为90m W/mL工作/间歇比2:1的脉冲超声处理80min，使蛋白溶解到水中，形成油菜籽蛋白水溶液；以占原料油菜籽饼粕重量2.5％(w/w)的中性蛋白酶加入油菜籽蛋白水溶液进行酶解，酶解的温度为50℃，pH为6.5，在酶解开始后对酶解体系采用频率为22kHz、功率为5m W/mL、工作/间歇比2:1的脉冲超声处理50min，停止超声处理，继续酶解，总共酶解时间2.5h；酶解结束后，将酶解液加热到90℃保持15秒钟灭酶，再自然冷却到室温，用布袋式离心机过滤酶解液并把滤液真空浓缩到干物质浓度为30％(w/w)，再经冷冻干燥得到油菜籽蛋白水解肽产品。对照试验参见实施例1。

经过测定，酶解产物多肽得率和IC₅₀值分别为4.89％(w/w)和2.70mg/mL，与对照试验相比，酶解产物肽得率提高41％，IC₅₀降低35％。

实施例与对照试验的效果对比见表1。

表1 实施例与对照试验的产物多肽得率和对ACE抑制的IC₅₀值比较

 

对照试验实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5多肽得率(％)3.475.344.824.515.174.89IC₅₀(mg/mL)4.162.752.412.622.582.70