一种同步浸提、分项制取丹皮中各活性成分的制备方法

摘要

一种同步浸提、分项制取丹皮中各活性成分的制备方法，是丹皮生药于25～45℃水中浸泡至少4小时，分离得到固相药渣和液相水浸提液；固相加水室温浸泡后用水蒸气蒸馏法制取丹皮酚，液相水浸提液用截留分子量5kDa或10kDa或30kDa的超滤膜对浸提液于压力25～35psi和25～45℃条件下进行超滤分离，分别得到截留液和透过液，截留液用醇沉法制取丹皮多糖，透过液用大孔树脂吸附分离制取丹皮总苷。本方法从中药丹皮中综合提取得到丹皮酚、丹皮多糖和丹皮总苷，实现了对药材最大程度的利用，所得到的丹皮多糖纯度80～84％，丹皮总苷纯度71.8～82.3％，其中芍药苷含量为41.7～47.5％，丹皮酚经纯化后纯度达95～99％。

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种提取中草药中活性成分的方法，具体地说是一种同步浸提、分项制取丹皮中丹皮酚、丹皮多糖和丹皮总苷的制备方法。

二、背景技术

中国传统的中医药学是中华民族大家庭的瑰宝。21世纪，全球正兴起“绿色食物”、“绿色药物”的热潮，发展中华传统中药，实现中药现代化，更具有重大的意义和价值。此外，从化学合成物中发现新药的难度大、成本高、周期长，且毒副作用明显，使得国际市场对天然药物的需求日益扩大，中药和天然药物产业蕴含着巨大的市场潜力与商机。

中药丹皮(Moutan Cortex)是毛茛科(Ranunculaceae)植物牡丹(Paeonia suffruticoas Andr)的干燥根皮，为安徽省的四大名药之一，种植历史已有千年，其性微寒，味辛，苦，凉，入心、肝、肾经，具有清热，凉血，和血，消淤的功效。丹皮炮制最早见于我国梁代陶宏景所撰《集注》中“皆促破，去心。”《本草纲目》等医书记载“丹皮木心不入药，需去之。”

丹皮中的有效活性成分中药包括丹皮酚(又称牡丹酚)、丹皮多糖和丹皮总苷(主要包括：芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮苷、丹皮原苷、丹皮新苷等)。牡丹酚具有活血化瘀、清热凉血、消炎收敛、镇痛解痉等多方面的药理作用，在医药、日化、香料领域有着广泛的用途。例如牡丹酚做成霜剂外涂，对急性湿疹、腊溢性皮炎、接触性皮炎有明显疗效；在牙膏中添加牡丹酚能起到消炎杀菌、抗牙龈过敏的作用；牡丹酚还能消除面部粉刺，对蚊虫叮咬、夏季皮炎、痱子、头皮瘙痒，具有杀菌、祛痱、止痒的作用；此外，其对心血管系统和中枢神经系统等具有多方面的药理作用，可用于开发抗心血管系统疾病的药物。丹皮多糖具有较高的降血糖活性，可用于开发治疗糖尿病药物，具有重要的临床实践价值；此外丹皮多糖还具有增强机体免疫功能及抗炎作用等，有效安全，无药理毒性。丹皮总苷包括芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮苷、丹皮原苷、丹皮新苷等，具有较好的清除氧自由基和肝保护作用，可用于治疗肝炎；其免疫调节和抗炎作用，为其开发成为治疗类风湿性关节炎的新药提供可能。

目前，对于丹皮的开发应用绝大部分局限于其中的某一种活性成分，所使用的技术手段较为陈旧繁琐，生产效率较低，能源消耗大，也浪费了原料丹皮，限制了在工业生产上的应用，且至今尚无报道从丹皮中同时综合提取丹皮酚、丹皮多糖和丹皮总苷三种活性物质的方法。因此，建立一种能够同时提取丹皮中三种活性物质的、经济高效的、节能环保的方法对实现中药现代化具有现实意义。

三、发明内容

本发明目的在于综合利用丹皮以充分发挥其药用价值，所要解决的技术问题是自从丹皮中同步提取、分项获得丹皮酚、丹皮多糖和丹皮总苷各活性成分。

本发明所称的丹皮同步提取是指丹皮生药用温水浸提后分离，得到主要含丹皮酚的固相(药渣)和主要含丹皮多糖和丹皮总苷的液相(水浸提液)；分项制取是指自固相中制取丹皮酚，自液相中分别制取丹皮多糖和丹皮总苷。工艺流程见图1。

本制备方法包括浸提、分离以及固相和液相的处理，所述的浸提是指丹皮生药于25～45℃水中浸泡至少4小时，丹皮与水的重量比不小于1：5，然后分离得到固相药渣和液相水浸提液；所述的固相处理是药渣加水室温浸泡至少3小时，药渣与水的重量比不小于1：5，然后用2.0～2.5kg/cm³压力的蒸气进行水蒸气蒸馏，控制釜温110～120℃，收集蒸馏液并冷却，分离、得到的沉淀便是丹皮酚；所述的液相处理是根据丹皮多糖和丹皮总苷分子量大小不同，选择截留分子量5kDa或10kKDa或30kDa的超滤膜对浸提液于压力25～35psi和25～45℃条件下进行超滤分离，大分子丹皮多糖被截留，小分子丹皮总苷及少量丹皮酚则通透，也就是说丹皮多糖存在于截留液中，用醇沉法制取丹皮多糖；丹皮总苷等存在于透过液中，用大孔树脂吸附分离法制备丹皮总苷；醇沉法是向截留液中加入至少两倍体积浓度50～90％(重量百分比，下同)的乙醇溶液，搅拌均匀后静置、沉淀，待沉淀析出完全后分离，收集沉淀冻干便是丹皮多糖；对透过液减压浓缩，浓缩液用大孔树脂吸附分离，水洗脱4～10柱体积(BV)除杂后用浓度20～50％的乙醇溶液洗脱3～10BV，收集乙醇洗脱液，经真空脱溶、干燥后得到丹皮总苷；减压浓缩时的馏出液返回固相中回收丹皮酚，因为丹皮酚不溶于冷水，但在温水中有一定的溶解度，实验表明，约有总量的15％～20％溶在温水中。

优选丹皮生药于30～45℃水中浸泡至少6小时，丹皮与水的重量比不小于1：8，进一步优选于35～40℃水中浸泡8小时，丹皮与水的重量比1：10。

优选截留分子量10KDa的超滤膜于压力30psi和35℃条件下进行超滤膜分离。

所述的大孔树脂选自型号为D201或宝恩3号或ASD-8或AB-8或HP16等大孔树脂。

优选型号为AB-8型大孔树脂。

浓缩液用大孔树脂吸附分离时，优选先水洗脱5～8BV，再用30～50％乙醇洗脱3～5BV，进一步优选水洗脱6BV，再用30％乙醇洗脱4BV。

分项制取时得到的各活性成分可通过重结晶等公知的方法进一步纯化。比如丹皮酚可用70％乙醇溶液重结晶，即85℃水浴加热溶解，冷冻结晶至少一次。经重结晶后得到纯品如图2所示。

本发明的优点是：

(1)本方法能从中药丹皮中综合提取获得丹皮酚、丹皮多糖和丹皮总苷，实现了对药材的最大程度的利用。

(2)本方法使用水蒸气蒸馏法获得丹皮酚，设备简单，成本较低，此过程中使用间歇加热、循环加水的方法，提高了丹皮酚的得率。纯化精制过程中采用乙醇多次洗涤和速冻结晶技术，缩短结晶时间，减少乙醇消耗，大大提高产品的纯度与品质。

(3)根据丹皮多糖与丹皮总苷分子量大小的差异(丹皮多糖分子量在10kDa以上，丹皮总苷分子量小于1000Da)，使用切向流超滤技术进行分离，设备简单、可连续生产、速度快，大大提高分离效率，减少能量与乙醇等试剂的消耗，生产成本大幅降低，克服了传统多糖生产过程使用的水提醇沉法乙醇消耗大、成本高以及色谱法载样量小，效率低等缺点，适合工业化应用。

(4)丹皮总苷纯化过程中使用AB-8大孔树脂，吸附量大、再生简单、效果可靠，取代了传统的乙醚、正丁醇等有机试剂萃取，大大提高了产品的质量与安全性，同时降低成本并减轻对环境的污染。

(5)本发明可以使用中药丹皮出口加工或饮片加工产生的边角料、细毛须、皮屑、细茎碎末作原料进行提取，从而进一步实现对中药材的充分利用，降低成本，获得更大的经济效益。

(6)原药废渣处理：使用后的废渣可以制成高档蚊香，(提取后的原药废渣主要成份是碳和一些树脂类胶原，是制作蚊香最理想的原料)，把提取后的残液参入燃烧后的粉煤灰吸收后可以制作成特殊用途的粘土砖，既提高了原材料的综合利用率，也符合循环经济的环保要求。

(7)本发明首次建立了从中药丹皮中综合提取丹皮酚、丹皮多糖和丹皮总苷的方法，设计合理，成本低、易操作、得率高，适合工业化生产，应用前景广泛。

四、附图说明

图1为中药丹皮同步浸提、分项制取各活性成分工艺路线图

图2为丹皮酚在HPLC-UV色谱图

图3为丹皮多糖HPLC-ELSD色谱图

图4为丹皮总苷HPLC-UV色谱图

五、具体实施方式

实施例一：

取丹皮生药500g，洗净烘干，加入5L水，35℃温水浸提8小时。过滤得到药渣和浸提液。浸提液(滤液)使用截留分子量10kDa的超滤膜，在压力30psi，温度35℃条件下切向流超滤分离，得含大分子丹皮多糖的截留液和含小分子丹皮总苷的透过液。丹皮多糖截留液使用3倍体积70％乙醇沉淀12小时，收集沉淀冷冻干燥，得丹皮多糖部分。丹皮总苷透过液减压浓缩，馏出液保留，浓缩液上大孔树脂柱AB-8(3.5g芍药苷/kg湿树脂)，先用水冲洗6个柱体积(6BV)除杂，再用30％乙醇洗脱4BV，收集洗脱液并减压蒸馏至无醇味，冷冻干燥，即得丹皮总苷部分。药渣加入9.5倍水室温浸泡5小时后，于蒸馏罐内用2.3kg/cm³压力的蒸气进行水蒸气蒸馏，控制釜温115℃(并入上一步浓缩透过液时的馏出液)，间歇加热，循环加水，至罐内排出的原药液体澄清并伴有少量珠点油花止，收集蒸馏液，冷却后沉淀得丹皮酚粗品。粗品使用3倍体积70％乙醇于85℃水浴中溶解，完全溶解后移至冷柜中结晶，第一次结晶时间较短，至刚有晶体析出，再重复以上操作3次至彻底结晶，得丹皮酚纯品。经液相色谱测定，丹皮多糖的得率为3.0％，纯度为80％；丹皮总苷的得率为3.3％，纯度为(以芍药苷计)82.3％，其中芍药苷含量为47.5％；丹皮酚的提取率为2.47％，纯度为99％。

实施例二：

取丹皮生药500g，洗净烘干，加入5L水，35℃温水浸提8小时。过滤，得到药渣和浸提液。浸提液(滤液)使用截留分子量30kDa的超滤膜，在压力25psi，温度30℃条件下切向流超滤分离，得含大分子丹皮多糖的截留液和含小分子丹皮总苷的透过液。丹皮多糖截留液使用3倍体积80％乙醇沉淀12小时，收集沉淀冷冻干燥，得丹皮多糖部分。丹皮总苷透过液减压浓缩后上大孔树脂柱AB-8(3.5mg芍药苷/g湿树脂)，先用水冲洗6BV除杂，再用50％乙醇洗脱3BV，收集洗脱液并减压蒸馏至无醇味，冷冻干燥，即得丹皮总苷部分。药渣加入9.5倍水浸泡5小时后，于蒸馏罐内用2.4kg/cm³压力的蒸气进行水蒸气蒸馏，控制釜温115℃(并入上一步浓缩透过液时的馏出液)，至罐内排出的原药液体澄清并伴有少量珠点油花止，收集蒸馏液，冷却后沉淀得丹皮酚粗品。粗品使用3倍体积70％乙醇于85℃水浴中溶解，完全溶解后移至冷柜中结晶，得丹皮酚纯品。经液相色谱测定，丹皮多糖的得率为2.3％，纯度为84％；丹皮总苷的得率为3.6％，纯度(以芍药苷计)为71.8％，其中芍药苷含量为41.7％；丹皮酚的提取率为2.16％，纯度为95％。

实施例三：

(1)实施例一中丹皮酚纯度的测定(紫外检测-高效液相色谱法)

色谱条件：色谱柱Restek pinnacle C₁₈柱(4.6×250mm，5μm)；检测器Waters2487紫外检测器(美国Waters公司)；Waters515色谱泵(美国Waters公司)；检测波长274nm；流动相甲醇:水＝45:55(v/v)；流速1mL/min；进样量20μL。

供试品溶液的制备：精密称取相同质量的实施例一中丹皮酚样品和标准品适量，分别用甲醇溶于容量瓶中，摇匀，即得。

测定方法：分别精密吸取样品溶液和标准品溶液，注入液相色谱仪，以峰面积归一化法计算，测定，结果参见图2。

分析结果：图2中，丹皮酚峰的相对保留时间为14.018，峰形单一对称，峰面积占总峰面积的99％，几乎不含其他杂峰，说明此方法制备的丹皮酚纯度很好。

(2)实施例一中丹皮多糖纯度的鉴定(蒸发光散射-高效液相色谱法)

色谱条件：色谱柱TSK-GEL G4000PW_XL凝胶色谱柱(7.8×300mm)(日本TOSOH公司)；检测器Waters 2420 ELS Detecter(美国Waters公司)；Waters515色谱泵(美国Waters公司)；流动相超纯水；喷雾器级别60％；漂移管温度55℃；气压25psi；流速1mL/min；进样量20μL。

供试品溶液的制备：精密称取一定量实施例一中丹皮多糖样品，用超纯水溶于容量瓶中，摇匀，即得。

测定方法：精密吸取样品溶液，注入液相色谱仪，测定，结果参见图3。

分析结果：图3中，丹皮多糖主要含有三个活性组分——组分1、组分2和组分3，为进一步纯化开发提供依据。

(3)实施例一中丹皮总苷纯度的测定(紫外检测-高效液相色谱法)

色谱条件：色谱柱Restek pinnacle C₁₈(18下标)柱(4.6×250mm，5μm)；检测器Waters2487紫外检测器(美国Waters公司)；Waters515色谱泵(美国Waters公司)；检测波长230nm；流动相 乙腈:超纯水:磷酸(85％)＝100:400:1(v/v)；流速1mL/min；进样量20μL。

供试品溶液的制备：精密称取相同质量的实施例一中丹皮总苷样品和芍药苷标准品适量，分别用甲醇溶于容量瓶中，摇匀，即得。

测定方法：分别精密吸取样品溶液和标准品溶液，注入液相色谱仪，以峰面积归一化法计算，测定，结果参见图4。

分析结果：图4中，芍药苷峰的相对保留时间为6.937，峰形单一对称，峰面积占总峰面积的70％。