BRI蛋白对Aβ产生的影响

摘要

提供了用于减少、抑制或防止细胞产生AB和或AID的方法，以及治疗患有阿耳茨海默病的受试者的方法。还提供了测定化合物是否是BRI2或BRI3的模拟物的方法。另外提供的是BRI2、BRI3或弗林蛋白酶，或编码那些蛋白质的载体的药物组合物。

说明书

关于联邦资助的研究或开发的声明

国政府在本发明中具有付费许可证和在有限的情况中要求本专利 所有者按照由国立卫生研究院资助的基金AG22024-95264562和AG2 1588-95264878的条款提供的合理条款给其它使用者颁发许可证的权 利。

发明背景

(1)发明领域

本发明一般涉及控制阿尔茨海默病中的Aβ产生。更具体地，本发 明是针对使用BRI蛋白来抑制C99的γ-分泌酶剪切和Aβ和/或APP胞 内结构域(AID)的释放。

(2)相关领域的描述

引用的参考文献

Cao，X.，and Sudhof，T.C.(2001)Science 293，115-120.

Cupers，P.，Orlans，I.，Craessaerts，K.，Annaert，W.，and De Strooper，B.(2001)J Neurochem 78，1168-1178.

Deleersnijder，W.，Hong，G.，Cortvrindt，R.，Poirier，C.，Tylzanowski，P.，Pittois，K.，Van Marck，E.，and Merregaert，J.(1996)J Biol Chem 271，19475-19482.

Gandy，S.(2005)J Clin Invest 115，1121-1129.

Gianni，D.，Zambrano，N.，Bimonte，M.，Minopoli，G.，Mercken，L.，Talamo，F.，Scaloni， A.，and Russo，T.(2003)J Biol Chem 278，9290-9297.

Goate，A.，Chartier-Harlin，M.C.，Mullan，M.，Brown，J.，Crawford，F.，Fidani，L.， Giuffra，L.，Haynes，A.，Irving，N.，James，L.，and et al.(1991)Nature 349，704-706.

Holton，J.L.，Lashley，T.，Ghiso，J.，Braendgaard，H.，Vidal，R.，Guerin，C.J.，Gibb，G.， Hanger，D.P.，Rostagno，A.，Anderton，B.H.，Strand，C.，Ayling，H.，Plant，G.，Frangione，B.， Bojsen-Moller，M.，and Revesz，T.(2002)J Neuropathol Exp Neurol 61，254-267.

Kang，J.，Lemaire，H.G.，Unterbeck，A.，Salbaum，J.M.，Masters，C.L.，Grzeschik，K. H.，Multhaup，G.，Beyreuther，K.，and Muller-Hill，B.(1987)Nature 325，733-736.

Kieber-Emmons et al.(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8，435-441.

Kim，S.H.，Wang，R.，Gordon，D.J.，Bass，J.，Steiner，D.F.，Lynn，D.G.，Thinakaran， G.，Meredith，S.C.，and Sisodia，S.S.(1999)Nat Neurosci 2，984-988.

Kimberly，W.T.，LaVoie，M.J.，Ostaszewski，B.L.，Ye，W.，Wolfe，M.S.，and Selkoe， D.J.(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100，6382-6387.

Kopan，R.(2002)J Cell Sci 115，1095-1097.

Levy-Lahad，E.，Wijsman，E.M.，Nemens，E.，Anderson，L.，Goddard，K.A.，Weber，J. L.，Bird，T.D.，and Schellenberg，G.D.(1995a)Science 269，970-973.

Levy-Lahad，E.，Wasco，W.，Poorkaj，P.，Romano，D.M.，Oshima，J.，Pettingell，W.H.， Yu，C.E.，Jondro，P.D.，Schmidt，S.D.，Wang，K.，and et al.(1995b)Science 269，973-977.

Maulik et al.(1997)Molecular Biotechnology：Therapeutic Applications and Strategies， Wiley-Liss，Inc.

Matsuda，S.，Yasukawa，T.，Homma，Y.，Ito，Y.，Niikura，T.，Hiraki，T.，Hirai，S.，Ohno， S.，Kita，Y.，Kawasumi，M.，Kouyama，K.，Yamamoto，T.，Kyriakis，J.M.，and Nishimoto，I. (2001)J Neurosci 21，6597-6607.

Passer，B.，Pellegrini，L.，Russo，C.，Siegel，R.M.，Lenardo，M.J.，Schettini，G.， Bachmann，M.，Tabaton，M.，and D′Adamio，L.(2000)J Alzheimers Dis 2，289-301.

Pickford，F.，Onstead，L.，Camacho-Prihar，C.，Hardy，J.，and McGowan，E.(2003) Neurosci Lett 338，95-98.

Pittois，K.，Deleersnijder，W.，and Merregaert，J.(1998)Gene 217，141-149.

Ripka et al.(1998)Curr.Opin.Chem.Biol.2，441-452.

Rogaev，E.I.，Sherrington，R.，Rogaeva，E.A.，Levesque，G.，Ikeda，M.，Liang，Y.，Chi， H.，Lin，C.，Holman，K.，Tsuda，T.，and et al.(1995)Nature 376，775-778.

Sanchez-Pulido，L.，Devos，D.，and Valencia，A.(2002)Trends Biochem Sci 27，329- 332.

Sanderson(1999)Med.Res.Rev.19，179-197.

Selkoe，D.，and Kopan，R.(2003)Annu Rev Neurosci 26，565-597.

Scheinfeld，M.H.，Roncarati，R.，Vito，P.，Lopez，P.A.，Abdallah，M.，and D′Adamio，L. (2002)J Biol Chem 277，3767-3775.

Scheinfeld，M.H.，Ghersi，E.，Davies，P.，and D′Adamio，L.(2003)J Biol Chem 278， 42058-42063.

Sherrington，R.，Rogaev，E.I.，Liang，Y.，Rogaeva，E.A.，Levesque，G.，Ikeda，M.，Chi， H.，Lin，C.，Li，G.，Holman，K.，and et al.(1995)Nature 375，754-760.

Sisodia，S.S.，and St George-Hyslop，P.H.(2002)Nat Rev Neurosci 3，281-290.

Stagljar，I.，Korostensky，C.，Johnsson，N.，and te Heesen，S.(1998)Proc Natl Acad Sci U S A 95，5187-5192.

Tanzi，R.E.，Gusella，J.F.，Watkins，P.C.，Bruns，G.A.，St George-Hyslop，P.，Van Keuren，M.L.，Patterson，D.，Pagan，S.，Kurnit，D.M.，and Neve，R.L.(1987)Science 235，880- 884.

Thomas，G.(2002)Nature Rev.Mol.Cell Biol.3，753-766.

Vassar，R.，Bennett，B.D.，Babu-Khan，S.，Kahn，S.，Mendiaz，E.A.，Denis，P.，Teplow， D.B.，Ross，S.，Amarante，P.，Loeloff，R.，Luo，Y.，Fisher，S.，Fuller，J.，Edenson，S.，Lile，J.， Jarosinski，M.A.，Biere，A.L.，Curran，E.，Burgess，T.，Louis，J.C.，Collins，F.，Treanor，J.， Rogers，G.，and Citron，M.(1999)Science 286，735-741.

Vidal，R.，Frangione，B.，Rostagno，A.，Mead，S.，Revesz，T.，Plant，G.，and Ghiso，J. (1999)Nature 399，776-781.

Vidal，R.，Revesz，T.，Rostagno，A.，Kim，E.，Holton，J.L.，Bek，T.，Bojsen-Moller，M.，- Braendgaard，H.，Plant，G.，Ghiso，J.，and Frangione，B.(2000)Proc Natl Acad Sci U S A 97， 4920-4925.

Vidal，R.，Calero，M.，Revesz，T.，Plant，G.，Ghiso，J.，and Frangione，B.(2001)Gene 266，95-102.

Zambrano，N.，Buxbaum，J.D.，Minopoli，G.，Fiore，F.，De Candia，P.，De Renzis，S.， Faraonio，R.，Sabo，S.，Cheetham，J.，Sudol，M.，and Russo，T.(1997)J Biol Chem 272，6399- 6405.

淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)是一种 遍在I型跨膜蛋白(Kang等，1987；Tanzi等，1987)，其经历一系列 的内切蛋白酶水解事件(Selkoe和Kopan，2003；Sisodia和St. George-Hyslop，2002)。APP首先由β-分泌酶在质膜或在细胞内的细 胞器中剪切(Vassar等，1999)。外功能区是在细胞外释放(sAPP β) 或释放进细胞内隔室的腔中，而99个氨基酸的COOH-端片段(C99)保 持与膜结合。在第二次，即膜内蛋白水解事件中，C99经γ-分泌酶剪切， 具有稍微不严格的位点特异性。两种肽以1:1的化学计量比释放：淀粉 样蛋白源Aβ肽和称为APP胞内结构域(AID或AICD)的胞内产物，所 述的Aβ肽包括40和42氨基酸这两种主要类型(分别为Aβ 40和Aβ 42)，所述的APP胞内结构域是非常短期存在的并且最近才得以鉴定 (Passer等，2000；Cao和Sudhof，2001；Cupers等，2001)。在一 备选的蛋白水解途径中，APP首先在Aβ序列中受α-分泌酶加工，导致 产生可溶性APP α(sAPP α)外功能区和膜结合的83个氨基酸的COOH- 末端片段(C83)。C83也被γ-分泌酶剪切成P3和AID肽。Aβ涉及阿 尔茨海默病的发病机理，而AID介导大多数的APP信号传导功能。APP 加工在AD中的致病作用已经被这样的发现确定：APP突变(Goate等， 1991)和早老素(γ-分泌酶的主要成分)(Sherrington等，1995； Levy-Lahad等，1995a，b；Rogaev等，1995)导致常染色体显性家族型 AD形成。因此，由于它的生物学和病理学重要性，需要理解APP剪切是 怎样调节的。本发明解决了这一需要。

发明概述

据此，本发明人已经发现BRI2和BRI3抑制从APP产生Aβ和APP 胞内结构域(AID)。

因而，在一些实施方案中，本发明指向减少、抑制或防止细胞产生 Aβ和/或AID的方法。该方法包括让细胞与有效减少、抑制或防止细胞 产生AB和或AID的量的BRI2或BRI3或其模拟物接触。

在其他实施方案中，本发明指向另外的减少、抑制或防止细胞产生 AB和或AID的方法。该方法包括让细胞与有效减少、抑制或防止细胞产 生AB和或AID的量的弗林蛋白酶(furin)接触。

另外，本发明指向治疗患有阿尔茨海默病的受试者的方法。该方法 包括给所述受试者施用有效治疗该受试者的阿尔茨海默病的量的BRI2 或BRI3或其模拟物。

在进一步的实施方案中，本发明指向治疗患有阿尔茨海默病的受试 者的其它方法。该方法包括给所述受试者施用有效治疗该受试者的阿尔 茨海默病的量的弗林蛋白酶。

本发明还指向确定化合物是否是BRI2或BRI3的模拟物的方法。该 方法包括将化合物与功能性γ-分泌酶和含C99的膜结合蛋白组合，随 后测定该化合物是否抑制剪切C99释放Aβ和/或AID。在这些实施方案 中，如果化合物抑制γ-分泌酶剪切C99则它是BRI2或BRI3的模拟物。

在另外的实施方案中，本发明指向包含可药用赋形剂中的纯化的 BRI2或BRI3的组合物。

在进一步的实施方案中，本发明指向包含可药用赋形剂中的纯化的 弗林蛋白酶的组合物。

本发明还指向包含可药用赋形剂中的编码BRI2或BRI3的载体的组 合物。

在其他实施方案中，本发明指向包含可药用赋形剂中的编码弗林蛋 白酶的载体的组合物。

附图简述

图1是蛋白质印迹的图示和照片，确定了BRI2是APP的配体。图a 是所使用的BRI2构建体的示意图。将构建体编号为1(氨基酸1-266， 全长)和2(氨基酸1-131)。图b-d显示了来自HeLa细胞的抗-FLAG 免疫沉淀物(IP α FLAG)和总溶解产物(TL)的蛋白质印迹(WB)，所 述的HeLa细胞表达显示BRI2/APP结合的特异性并作图相互作用位点的 标明的蛋白质。pc表示空载体(pcDNA3.1)；数字1和2表示a中显示 的BRI2构建体；*表示未减少的抗-FLAG抗体；m.表示成熟的、糖基化 形式的APP，而i.表示未成熟的、非糖基化的APP。对于蛋白质印迹， α APP表示单克隆抗体22C11而α APPct是抗APP的C-末端的兔多克隆 抗体。图e是其中将用APP和BRI2转染的HeLa细胞的裂解物用兔多克 隆对照(RP)或α APP-ct沉淀的试验的蛋白质印迹。将免疫沉淀物和总 溶解产物用α APP单克隆抗体22C11或α FLAG进行印记。将BRI2，以及～ 17kDa的BRI2 N-末端片段(BRI2nt)和APP一起用α APPct沉淀。

图2是蛋白质印迹的照片，确定了内源性APP和BRI2在成人脑中 相互作用。在图a中，将来自用FLAG-BRI2转染的HeLa细胞的溶解产 物用鸡对照抗体(泳道3)、可商业获得的鸡α BRI2抗体(泳道6)、 单独的蛋白质A/G珠(泳道9)、对照兔多克隆抗体(泳道12)、兔多 克隆EN3 α BRI2抗体(泳道15)、一种独特的兔α BRI2血清(泳道18) 和小鼠α BRI2多克隆抗体(泳道21)沉淀。将总溶解产物(L)、上清 液(S)和沉淀物(P)进行凝胶分离并用α FLAG探测。只有EN3能够使 BRI2沉淀。～17和14kDa的BRI2nt片段未沉淀，因为由EN3识别的 表位是Brichos结构域的C-末端。在图b中，将总脑匀浆物用对照兔多 克隆(RP)、α APPct或EN3免疫沉淀。将总脑溶解产物(T.L.)和免 疫沉淀物用α APP单克隆抗体22C11(上图)或α APPct(下图)印记。

图3是蛋白质印迹的图表和照片，确定了BRI2调节通过分泌酶的 APP加工。图a-c中，BRI2减少了HeLa、N2a和HEK293细胞中的APP-Ga14- 驱动的萤光素酶活性。将这些细胞用APP-Ga14与pcDNA3.1(pc)或 FLAG-BRI2、BRI21-131或BACE一起共转染。数据表示为用空载体转染 的细胞中测量的萤光素酶活性的百分比。BRI2、BACE和pc转染的细胞 表达类似水平的APP-Ga14(未显示)。误差线表示3次独立试验的±SD。 图d，将细胞用APP-Ga14、pcDNA3.1(pc)或BRI2转染。随后将用APP-Ga14 转染的细胞以标明的比例与BRI2或pc.DNA3.1转染的细胞混合。在转 染和混合24小时后如上描述的分析样品的萤光素酶活性。图e-f，BRI2 抑制Aβ 40/Aβ 42的产生。将稳定表达APP的HEK293细胞(HEK293APP) 用空载体(pc)、BACE或FLAG-BRI2转染，并且通过ELISA测量培养基 中分泌的Aβ 40和Aβ 42。通过所述的转染细胞的溶解产物的蛋白质含 量来标准化测量Aβ的量。误差线表示3次独立试验的±SD。图g，转 染的HeLa细胞的脉冲-追踪试验，表示4个独立的试验。将HEK293APP 细胞用空载体(载体)或FLAG-BRI2转染。将经代谢标记的细胞的溶解 产物用α APPct沉淀。每条泳道上方的数字表示细胞被追踪的时间(c)。 BRI2表达减少了C83产生同时显著增加了C99的产生。图h，在标记4 小时后收集经类似转染的HEK293APP细胞的条件培养基并用p21或6E10 沉淀。虽然BRI2减少了sAPP α的量，但总sAPP(sAPP α+sAPP β)没 有显示出显著变化，这表明sAPP β产生增加以及APP从α分泌酶加工转 变成了β分泌酶。图i，将细胞用APLP2与pc.DNA3.1或BRI2一起转染。 在转染24小时后，通过蛋白质印迹分析细胞的BRI2和APLP2肽。

图4是蛋白质印迹的照片，确定了BRI2的前102个氨基酸是抑制 C99的有效剪切所必需的，并且确定相同区域是BRI2结合至APP的C99 所需要的。左图显示来自γ30细胞的总溶解产物(TL)的蛋白质印迹， 所述γ30细胞稳定表达APP并用空载体(vec)、myc-标签的全长BRI2 1-266(BRI2)或多种myc-标签的BRI2C-末端缺失型构建体(通过由 所述构建体编码的氨基酸表示)转染。右图显示相应溶解产物的抗-myc 免疫沉淀物(myc IP)。HC表示用于免疫沉淀中的myc抗体的重链。

图5是APP-Ga14-驱动的萤光素酶活性的图，确定了BRI2的前102 个氨基酸都是抑制AID产生所需的。将HEK293细胞用APP-Ga14与空载 体或myc-标签的全长BRI2或多种BRI2 C-末端缺失型构建体(通过由 所述构建体覆盖的氨基酸范围表示)转染。数据表示为用空载体转染的 细胞中测量的萤光素酶活性的百分比。误差线表示3次独立试验的±SD。

图6是蛋白质印迹的照片，确定了BRI2抑制sAPP α、sAPP β的分 泌。将HEK293APP细胞用空载体(-)或FLAG-BRI2(+)转染。从在Opti-MEM 中适应4小时的转染细胞的培养基中检测sAPP α和sAPP β。APP和BRI2 表达通过转染细胞的总溶解产物的蛋白质印迹确定。APP表达没有显著 变化。

发明详述

本发明部分基于本发明人的发现：BRI2和BRI3抑制从APP产生Aβ。 由于APP胞内结构域(AID)是与Aβ相伴产生，抑制Aβ的产生也抑制 了AID的产生。不受任何特别的机制束缚，据认为这种Aβ产生的抑制 是由于BRI2和BRI3对β-分泌酶剪切APP和γ-分泌酶剪切C99的抑制， 抑制了C99的产生和从C99释放Aβ。参见实施例。

因而，在一些实施方案中，本发明指向减少、抑制或防止细胞产生 AB和或AID的方法。该方法包括让细胞与足以减少、抑制或防止细胞产 生AB和或AID的量的BRI2或BRI3或其模拟物接触。

在这些实施方案中，BRI2和BRI3是脊椎动物的膜内在蛋白质，也 分别称为“膜内在蛋白质2B”和“膜内在蛋白质2C”。人野生型形式 的这些蛋白质分别具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列，提 供的cDNA序列为GenBank登记号NM 021999(BRI2)和NM 030926、NM 001012516及NM 001012514(BRI3的三种转录物变体)。此外，猕猴的 BRI2氨基酸序列和小鼠的BRI3氨基酸序列分别已知为GenBank登记号 Q60HC1和NP071862。有了这些和其他已知的BRI2和BRI3信息，熟练 的技术人员可以用常规的方法确定任何脊椎动物的BRI2和BRI3序列。 任何脊椎动物的BRI2和BRI3蛋白将期望分别具有与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2至少80％同源的氨基酸序列。

本发明人还已经通过基因合成BRI2蛋白的部分而确定，仅由氨基 酸1-102组成的BRI2蛋白足以减少、抑制或防止Aβ和/或AID产生。 见实施例1和2。

用于本发明方法的BRI2或BRI3还可包含拟肽(peptidomimetic)。 如在此使用的，拟肽是能够模拟蛋白质中的天然母体氨基酸的化合物， 这样用拟肽取代氨基酸不会显著影响所述蛋白质的活性。与天然蛋白质 比较，含拟肽的蛋白质通常是蛋白酶的差的底物并且可能在体内更长时 期内是有活性的。许多不可以水解的肽键类似物，以及用于合成含这种 键的肽的方法是本领域已知的。不可以水解的键包括-CH₂NH、-COCH₂、 -CH(CN)NH、-CH₂CH(OH)、-CH₂O、CH₂S。而且，含拟肽的肽可以是较少抗 原性的并显示出总体更高的生物利用度。熟练的技术人员将了解，含拟 肽的蛋白质的设计和合成应该不需要过多的实验。参见，例如Ripka等， (1998)；Kieber-Emmons等，(1997)；Sanderson(1999)。

因此，在这些方法的优选实施方案中，让细胞与含有这样的氨基酸 和/或拟肽的BRI2或BRI3接触：所述氨基酸和/或拟肽等价于具有SEQ ID NO：1的序列的人BRI2蛋白或具有SEQ ID NO：2的序列的人BRI3 蛋白的氨基酸1至102，其中所述的BRI2蛋白和BRI3蛋白分别具有与 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2至少80％同源的氨基酸序列。

在其他优选的实施方案中，BRI2或BRI3是天然存在的蛋白质。在 一些优选实施方案中，BRI2或BRI3与人BRI2或BRI3有大于80％同源 性的相似。在那些实施方案中，BRI2或BRI3优选分别具有与SEQ ID NO：1 或SEQ ID NO：2的至少部分至少90％同源的氨基酸序列；更优选与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少部分至少95％同源的氨基酸序列；并且 甚至更优选的，BRI2或BRI3分别具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2 的至少部分至少98％同源的氨基酸序列。在最优选的实施方案中，BRI2 或BRI3分别与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少部分100％的同源。

由于这些方法中的BRI2或BRI3可以由少至那些蛋白质的前102个 氨基酸组成，如在此使用的，“BRI2”或“BRI3”包括小于全长的BRI2 或BRI3蛋白的蛋白质，例如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中提供的蛋 白质。因此，该蛋白质可少于250、200、150或125个氨基酸和/或拟 肽。在其他的优选实施方案中，BRI2或BRI3分别含有等价于具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的人BRI2或BRI3的氨基酸1至102的氨 基酸和/或拟肽。

BRI2或BRI3在此还可进一步包含另外的有用的部分，例如使得能 缓释该蛋白质或减少该蛋白质的降解的部分，如支架(scaffolding) 或PEG，或使得能靶向至特殊细胞类型的部分如核酸序列。

在这些方法中，可将细胞与BRI2、BRI3或BRI2或BRI3的模拟物 接触。如在此使用的，模拟物指能模拟天然存在的肽(在此为BRI2或 BRI3)的生物作用的任意肽或非肽化合物，通常是由于该模拟物具有模 拟所述天然存在的肽的基本结构的基本结构和/或具有天然存在的肽的 显著生物学特性。所述模拟物可包括，但不限于：具有对原型的重大修 饰例如与天然存在的肽无侧链相似性的肽(这种修饰，例如可减少它对 降解的敏感性)、抗-独特型抗体和/或抗-催化抗体或其片段、分离的蛋 白质的非蛋白质性部分(例如碳水化物结构)，或合成的或天然的有机 分子，包括例如通过组合化学确定的核酸和药物。这种模拟物可用本领 域已知的多种方法设计、选择和/或确定。多种可用于设计在本发明中 有用的模拟物或其他治疗用化合物的药物设计方法在Maulik等，1997 中公开，将其在这里通过全文引入作为参考。

这些方法不限于使用任何特殊细胞，只要所述细胞能够产生Aβ和/ 或AID。这些方法可使用的细胞的非限制性实例是神经元细胞和基本上 任何其他天然表达APP或通过基因操作表达APP的哺乳动物细胞(见实 施例)。所述细胞还可以是类似神经元细胞的或者能够分化成神经元细 胞(例如干细胞)。在一些优选的实施方案中，该细胞是在活的哺乳动 物内。优选地，所述哺乳动物是阿尔茨海默病的试验模型或人。在其他 的优选实施方案中，该细胞是活的哺乳动物，优选人体内的神经元细胞。 在最优选的实施方案中，所述的人患有阿尔茨海默病或处于患阿尔茨海 默病的风险中，例如具有阿尔茨海默病遗传倾向的人。

可通过任意的已知方法让细胞与BRI2或BRI3或模拟物接触。实例 包括直接应用BRI2或BRI3或模拟物，或施用BRI2或BRI3或模拟物给 含有所述细胞的哺乳动物，这样BRI2或BRI3或模拟物将例如通过循环 系统或通过穿透血脑屏障运送至所述细胞。如果所述BRI2或BRI3或模 拟物是蛋白质(即BRI2或BRI3蛋白)，则可将细胞与含有编码至少一 部分BRI2或BRI3蛋白的核酸序列的载体，例如病毒载体接触，其中由 所述核酸编码的BRI2或BRI3的翻译实现了接触。后面的方法是优选的 方法，特别是在所述载体能够进入细胞时(例如，病毒感染细胞)。

BRI2和BRI3受弗林蛋白酶加工并且产物导致对C99加工的抑制。 因而，细胞中弗林蛋白酶的增加也减少、抑制或防止Aβ和/或AID产生。

因此，本发明还指向减少、抑制或防止细胞产生AB和或AID的另 外的方法。该方法包括让细胞与足以减少、抑制或防止细胞产生AB和 或AID的量的弗林蛋白酶接触。

弗林蛋白酶(或成对碱性氨基酸裂解酶)是细胞I型跨膜蛋白的前 蛋白转化酶(Thomas，2002)。人野生型形式的前原弗林蛋白酶(prepro 弗林蛋白酶)具有氨基酸序列SEQ ID NO：3，具有GenBank Accession NM002569的cDNA序列。成熟蛋白质具有SEQ ID NO：3的序列或氨基酸 108-794。此外，已知小鼠的弗林蛋白酶氨基酸序列为GenBank Accession NP035176。有了关于脊椎动物弗林蛋白酶的这些和其他已知 信息，熟练的技术人员能用常规方法确定任何脊椎动物的弗林蛋白酶序 列。任何脊椎动物的弗林蛋白酶蛋白将期望具有与SEQ ID NO：3的氨基 酸序列108-794至少80％同源的氨基酸序列。在优选的实施方案中，弗 林蛋白酶含有与具有SEQ ID NO：3的氨基酸108-794的序列的人弗林蛋 白酶至少95％一致的氨基酸序列，在最优选的实施方案中，所述弗林蛋 白酶是人弗林蛋白酶。

所述弗林蛋白酶在此还可进一步包含另外的有用的部分，例如使得 能缓释该蛋白质或减少该蛋白质的降解的部分，如支架或PEG，或使得 能靶向至特殊细胞类型的部分如核酸序列。

在这些方法中，可将细胞与增加天然弗林蛋白酶的活性的化合物接 触，例如将原弗林蛋白酶转化成弗林蛋白酶的肽酶，或增加弗林蛋白酶 运输至其中存在有BRI蛋白质的位点的化合物。然而，在优选的实施方 案中，例如通过施用弗林蛋白酶蛋白给含有所述细胞的哺乳动物，这样 弗林蛋白酶将例如通过循环系统或通过穿透血脑屏障运送至所述细胞 而让细胞与弗林蛋白酶蛋白接触。在更优选的实施方案中，弗林蛋白酶 从含有编码弗林蛋白酶蛋白的氨基酸序列的载体表达。优选地，这些载 体是感染细胞，因而在原位产生弗林蛋白酶蛋白的病毒载体。

这些方法不限于使用任何特殊细胞，只要细胞能够产生Aβ和/或 AID。这些方法可使用的细胞的非限制性实例是神经元细胞和基本上任 何其他天然表达APP或通过基因操作表达APP的哺乳动物细胞(见实施 例)。所述细胞还可以是类似神经元细胞的或者能够分化成神经元细胞 (例如干细胞)。在一些优选的实施方案中，所述的细胞是在活的哺乳 动物内。优选地，所述哺乳动物是阿尔茨海默病的试验模型或人。在其 他的优选实施方案中，该细胞是活的哺乳动物，优选人体内的神经元细 胞。在最优选的实施方案中，所述的人患有阿尔茨海默病或处于患阿尔 茨海默病的风险中，例如具有阿尔茨海默病遗传倾向的人。

在其他的实施方案中，本发明指向治疗患有阿尔茨海默病的受试者 的方法。该方法包括施用给所述受试者有效治疗该受试者的阿尔茨海默 病的量的BRI2或BRI3或其模拟物。

在这些方法中，优选施用给所述受试者含有等价于具有SEQ ID NO： 1的人BRI2蛋白质序列或具有SEQ ID NO：2的人BRI3蛋白质序列的氨 基酸1至102的氨基酸和/或拟肽的BRI2或BRI3。在这些实施方案中， BRI2蛋白和BRI3蛋白分别具有与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2至少 80％同源的氨基酸序列。在其他的优选实施方案中，BRI2或BRI3是天 然存在的蛋白质。

在这些方法中，BRI2或BRI3或其模拟物可直接施用至受试者的脑 内。备选地，BRI2或BRI3或其模拟物以允许BRI2或BRI3或其模拟物 穿透哺乳动物的血脑屏障的方式施用。也可以将BRI2或BRI3或其模拟 物配制成增强BRI2或BRI3或其模拟物穿透受试者血脑屏障的能力的药 物组合物。

除非另外限制，可以配制在此描述的任何实施方案中的药物组合物 而不需要过多的试验，用于施用给哺乳动物，包括人，视情况而定用于 特殊的应用。此外，所述组合物的合适剂量可用标准的剂量-反应方法 确定而不需要过多试验。

因此，设计用于经口、经舌、舌下、口颊和颊内施用的组合物可通 过本领域熟知的手段，例如用惰性稀释剂或用可食用载体制备而不需要 过多试验。组合物可包封于胶囊中或压缩成片剂。为经口治疗施用目的， 可将本发明的药物组合物与赋形剂组合并且以片剂、锭剂、胶囊剂、酏 剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafers)、口香糖剂(chewing gums) 等形式施用。

片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等还可包含粘合剂、赋形剂、崩解剂、 润滑剂、甜味剂和调味剂。粘合剂的一些实例包括微晶纤维素、黄蓍胶 或明胶。赋形剂的实例包括淀粉或乳糖。崩解剂的一些实例包括褐藻酸、 玉米淀粉等。润滑剂的实例包括硬脂酸镁或硬脂酸钾。助流剂的实例是 胶体二氧化硅。甜味剂的一些实例包括蔗糖、糖精等。调味剂的实例包 括薄荷、冬青油、橙味香料等。用于制备这些多种组合物的材料应该是 药学上纯的并且使用的量是无毒的。

本发明的组合物可容易地进行肠胃外施用，例如通过静脉内、肌内、 胸内或皮下注射。肠胃外施用可通过将本发明的组合物组合成溶液剂或 混悬剂实现。这种溶液剂或混悬剂还可包含无菌稀释剂例如注射用水、 盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂。 肠胃外制剂也可包含抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂 例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠以及螯合剂例如EDTA。也可加入缓冲液例如 醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张度的试剂如氯化钠或葡萄糖。 肠胃外制剂可以包含于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性使用注射器或 倍剂量药瓶中。

直肠施用包括将药物组合物施用进直肠或大肠内。这可用栓剂或灌 肠剂完成。栓剂制剂可以容易地通过本领域已知的方法制备。例如，栓 剂制剂可这样制备：加热甘油至约120℃，将组合物溶解于甘油中，混 合加热的甘油，之后可加入纯净水，并且将该热的混合物倾注入栓剂模 中。

经皮肤施用包括通过皮肤经皮吸收组合物。经皮肤制剂包括贴剂 (例如众所周知的烟碱贴剂)、软膏剂、乳剂、凝胶剂、油膏剂等。

本发明包括经鼻施用给哺乳动物治疗有效量的组合物。如在此使用 的，经鼻施用或鼻内施用包括将组合物施用至患者的鼻道或鼻腔的粘 膜。如在此使用的，用于鼻内施用组合物的药物组合物包含治疗有效量 的通过熟知的方法制备的组合物，以例如作为鼻腔喷雾剂、滴鼻剂、混 悬剂、凝胶剂、软膏剂、乳剂或粉剂施用。该组合物的施用还可用鼻塞 或鼻用海绵进行。

在进一步的实施方案中，本发明指向治疗患有阿尔茨海默病的受试 者的其他方法。该方法包括施用给所述受试者有效治疗该受试者的阿尔 茨海默病的量的弗林蛋白酶。在这些实施方案中受试者优选施用弗林蛋 白酶，所述弗林蛋白酶含有等价于具有SEQ ID NO：3的氨基酸108-794 的序列的人弗林蛋白酶的氨基酸和/或拟肽，其中所述的弗林蛋白酶具 有与SEQ ID NO：3至少80％同源的氨基酸序列。在其他的优选实施方案 中，弗林蛋白酶是天然存在的蛋白质，例如人弗林蛋白酶。

这些实施方案中弗林蛋白酶可直接施用至受试者的脑内。备选地， 弗林蛋白酶可以以允许化合物穿透哺乳动物的血脑屏障的方式施用。也 可以将弗林蛋白酶配制成增强所述弗林蛋白酶穿透受试者血脑屏障的 能力的药物组合物。

使用建立了的用于鉴定模拟物的方法，熟练的技术人员可通过鉴定 化合物抑制剪切C99释放出Aβ和/或AID来确定BRI2或BRI3的模拟物。 因此，本发明还指向确定化合物是否是BRI2或BRI3的模拟物的方法。 该方法包括将化合物与功能性γ-分泌酶和含C99的膜结合蛋白组合， 随后测定该化合物是否抑制C99被剪切而释放Aβ和/或AID。在这些实 施方案中，如果该化合物抑制γ-分泌酶剪切C99则它是BRI2或BRI3 的模拟物。

对剪切C99释放出Aβ和/或AID的抑制可通过任何已知的方法测 定，例如实施例中描述的方法。这种方法包括例如用Aβ和/或AID-特 异性抗体测量Aβ和/或AID的释放，其中BRI2或BRI3模拟物将导致Aβ 和/或AID减少。C99的抑制也可通过测量C99的变化测定，其中模拟物 将导致C99增加(见实施例)。

同样如实施例中确定的，BRI2或BRI3对C99的剪切的抑制导致C83 和sAPP α的存在减少，而sAPP β的存在增加。因此，BRI2或BRI3模拟 物应该引起C83和sAPP α减少而sAPP β增加。

上述测定可通过任何已知的方法进行。优选的方法包括ELISA、质 谱或蛋白质印迹。如本领域已知的，蛋白质印迹使得能比ELISA更明确 地鉴定化合物，但它是一种更耗时且麻烦的方法。

这些方法不限于将要评估的任何特殊化合物。例如，可以评估随机 化合物的库。然而优选地是，将化合物设计成模拟BRI2或BRI3蛋白的 部分，所述BRI2或BRI3蛋白的部分含有等价于分别具有SEQ ID NO：1 或SEQ ID NO：2的序列的人BRI2或BRI3蛋白的氨基酸1至102的氨基 酸。例如，可以设计这种化合物来模拟BRI2或BRI3蛋白的所述部分的 三维结构和/或电荷。备选地，所述化合物可包含拟肽这样该化合物可 模拟BRI2或BRI3氨基酸序列。

在优选的实施方案中，含C99的膜结合蛋白是淀粉样前体蛋白 (APP)，例如将在表达APP的细胞中出现的蛋白质。

这些方法可在体外(例如在试管内)进行。然而优选地是，功能性 γ-分泌酶和含C99的膜结合蛋白是在活的细胞中。这些活细胞的非限 制性实例是含有基因构建体的那些细胞，所述的基因构建体在γ-分泌 酶剪切转基因APP时激活报告基因(例如，萤光素酶)的转录，如实施 例1中的描述的。在这些实施方案中，所述的转基因APP优选进一步在 该转基因APP的胞质结构域上含有Ga14(见实施例)。

如果所述方法使用活细胞，则表达功能性γ-分泌酶和APP的任何 细胞都可使用。非限制性实例包括神经元细胞或产生转基因APP的细胞， 例如HEK293细胞、HeLa细胞或N2a细胞。参见实施例。

在另外的实施方案中，本发明指向包含可药用赋形剂中的BRI2或 BRI3的组合物。优选地，BRI2或BRI3含有这样的氨基酸和/或拟肽： 所述氨基酸和/或拟肽等价于具有SEQ ID NO：1的序列的人BRI2蛋白 或具有SEQ ID NO：2的序列的人BRI3蛋白的氨基酸1至102，其中BRI2 蛋白和BRI3蛋白分别具有与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2至少80％同 源的氨基酸序列。BRI2或BRI3可以包含从全长蛋白质下至102个氨基 酸和/或拟肽的任意数目的氨基酸和/或拟肽，包括，例如少于250个氨 基酸和/或拟肽、少于200个氨基酸和/或拟肽、少于150个氨基酸和/ 或拟肽或少于125个氨基酸和/或拟肽。

在一些实施方案中，可药用赋形剂增强了BRI2或BRI3穿透受试者 的血脑屏障的能力。在其他实施方案中，将组合物配制成单位剂量形式 用于治疗阿尔茨海默病。

本发明另外指向包含可药用赋形剂中的纯的弗林蛋白酶的组合物。 优选地，所述弗林蛋白酶包含等价于具有SEQ ID NO：3的氨基酸108-794 的序列的人弗林蛋白酶的氨基酸和/或拟肽，其中该弗林蛋白酶具有与 SEQ ID NO：3至少80％同源的氨基酸序列。优选地，该弗林蛋白酶是天 然存在的蛋白质。

在一些实施方案中，可药用赋形剂增强了弗林蛋白酶穿透受试者的 血脑屏障的能力。在其他实施方案中，将组合物配制成单位剂量形式用 于治疗阿尔茨海默病。

本发明还指向包含可药用赋形剂中的编码BRI2或BRI3的载体的组 合物。优选地，BRI2或BRI3包含这样的氨基酸：所述氨基酸等价于具 有SEQ ID NO：1的序列的人BRI2蛋白或具有SEQ ID NO：2的序列的人 BRI3蛋白的氨基酸1至102，其中所述的BRI2蛋白和BRI3蛋白分别具 有与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2至少80％同源的氨基酸序列。在一 些实施方案中，可药用赋形剂提高了BRI2或BRI3穿透受试者的血脑屏 障的能力。在其他实施方案中，将组合物配制成单位剂量形式用于治疗 阿尔茨海默病。这些实施方案不限于任何特殊载体。然而，在优选的实 施方案中，该载体是病毒。

本发明还指向包含可药用赋形剂中的编码弗林蛋白酶的载体的组 合物。优选地，所述弗林蛋白酶包含等价于具有SEQ ID NO：3的氨基酸 108-794的序列的人弗林蛋白酶的氨基酸，其中该弗林蛋白酶具有与SEQ ID NO：3至少80％同源的氨基酸序列。在其他优选实施方案中，该弗林 蛋白酶是天然存在的蛋白质。在一些实施方案中，可药用赋形剂提高了 弗林蛋白酶穿透受试者的血脑屏障的能力。在其他实施方案中，将组合 物配制成单位剂量形式用于治疗阿尔茨海默病。优选地，所述载体是病 毒。

本发明的优选实施方案在下面的实施例中描述。根据在此公开的本 发明说明书或实践的描述，在这里权利要求书范围内的其他实施方案对 本领域的技术人员来说将是显而易见的。旨在说明，所述的说明书与实 施例一起仅作为示例考虑，本发明的范围和精神在实施例后面的权利要 求书中说明。

实施例1.由家族性痴呆BRI2基因编码的蛋白质结合APP并抑制A β产生

实施例概述

阿尔茨海默病(AD)是最普遍的老年性痴呆，表征为淀粉样蛋白斑、 血管淀粉样蛋白、神经原纤维缠结和进行性神经变性。淀粉样蛋白主要 由Aβ肽组成，Aβ肽源自分泌酶对β-淀粉样前体蛋白(APP)的加工。 与Aβ一起释放的APP胞内结构域(AID)具有信号传导功能，因为它调 节调亡和转录。尽管它在生物学和病理学上很重要，调节APP加工的机 制仍缺乏了解。膜结合蛋白促使Notch受分泌酶剪切并释放出转录-活 性的细胞内片段。考虑到APP和Notch信号之间的显著相似性，我们假 定APP加工受类似调节。

这里，我们显示BRI2(一种II型膜蛋白)与APP相互作用。有趣 地是，对应Aβ NH₂-末端部分的17个氨基酸是这种相互作用所需的。 而且，BRI2表达调节了APP的加工，导致Aβ和AID水平降低。总而言 之，这些发现鉴定了BRI2-APP相互作用为抑制Aβ产生的APP加工的调 节机制。值得注意地是，BRI2突变导致临床上和病理学上类似于AD的 家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)。BRI2病原性突 变改变了BRI2对APP加工的调节功能这一发现将确定APP剪切的调节 失调为AD、FDD和FBD共有的致病机制。

介绍

由于其他γ-分泌酶底物的剪切是通过膜结合的配体调节，我们假 定存在结合APP并调节其加工的膜内在蛋白质。在这里，我们描述了 BRI2(Deleersnijder等，1996)，其为一种实现这种描述的II型膜蛋 白。

试验步骤

按描述的将γ30细胞维持在补充有抗生素和10％胎牛血清的DMEM (Kimberly等，2003)中。

分裂-泛素化酵母双杂交筛选分裂-泛素化系统提供了一种有吸引 力的备选方案用以分析膜内在蛋白质之间的相互作用(Stagljar等， 1998)。分裂-泛素化系统和人脑文库可购自Dualsystems Biotech (Zurich，Switzerland)。筛选依照生产商的方法进行。简而言之， 将人APP(氨基酸1-695)、人APP(氨基酸1-664；APPNcas)或人APLP2 分别克隆进pTMV4、pAMBV4、pAMBV4诱饵载体(bait vector)中，以 获得融合至泛素的C-端部分(Cub)的APP家族诱饵蛋白，之后将报告 片段(LexA，一种DNA-结合蛋白，融合至VP16(一种转录激活物)) 克隆进载体。人脑文库表达融合在突变泛素的N-端部分处的蛋白质 (NubG)。对于每个文库，我们筛选约5×10⁶个转化体。编码可以与 APP/APLP2-Cub相互作用的蛋白质的克隆将促进NubG:Cub相互作用，之 后募集泛素-特异性蛋白酶，剪切APP/APLP2-Cub诱饵蛋白，释放 LexA-VP16转录因子并转录激活两种报告基因(LacZ和HIS3)。从HIS3 和LacZ阳性酵母转化体回收文库质粒并克隆进具有N-末端FLAG标记的 pcDNA3.1中，并且通过如下面描述的免疫沉淀法直接检测它与APP相互 作用的能力。对这两种报告基因的辅激活因子的筛选导致鉴定了已知的 APP/APLP2-结合蛋白，例如Fe65(Zambrano等，1997)。

质粒.从这两种杂交克隆PCR-扩增全长的BRI2和BRI2^1-131并克隆进 pcDNA3.1-FLAG中(Matsuda等，2001)。哺乳动物的表达载体APP、 APPNcas已有描述(Scheinfeld等，2002)。将myc-标签插入ApoER2 的信号序列后并克隆进pEF-BOS中。从小鼠脑cDNA克隆BACE并将其通 过克隆进pcDNA3mycHisB(Invitrogen)进行C-末端myc标记。

抗体使用了下面的抗体：αFLAG(小鼠单克隆M2，Sigma)；α APP 小鼠单克隆22C11(Chemicon)、6E10(Signet labs)和p2-1 (Biosource)；α myc(小鼠单克隆9E10，Santa Cruz Biotechnology)； 兔多克隆抗体α APPct(ZMD.316，Zymed)(Scheinfeld等，2002)；鸡对 照抗体(IgY，Southern Biotechnology)；鸡α BRI2(IgY，BMA Biomedicals)；兔多克隆对照抗体(IgG，Southern Biotechnology)； EN3(Pickford等，2003)(兔多克隆抗体)；兔α BRI2(Dr.Jorge Ghiso 馈赠)、对抗包含人BRI2的胞质尾区的肽的小鼠多克隆抗体。兔多克隆 抗-APLP1和抗APLP2 C-末端抗体购自Calbiochem公司。

细胞培养和转染.将HEK293、稳定表达APP的HEK293(HEK293APP)、 HeLa、N2a细胞在37℃下于5％的CO₂中维持在Dulbecco氏改良的 Eagle氏培养基(DMEM)中，所述培养基补充有青霉素、链霉素和10％ 的胎牛血清。FuGENE 6(Roche Applied Science)或Metafectene (Biontex)用于转染。

免疫沉淀和蛋白质印迹.除非另外说明，所有的免疫沉淀步骤在4 ℃下进行。将转染细胞在含有10％(v/v)甘油的缓冲液A[20mM Hepes/NaOH pH7.4，1mM EDTA，1mM DTT，150mM NaCl，0.5％(w/v) TritonX-100]中溶解30分钟，并且溶解产物在20,000g下离心10分 钟。对于FLAG免疫沉淀，将澄清的溶解产物与20μl的FLAG-M2珠 (Sigma)混合2小时，并用缓冲液A洗涤3次。让沉淀物在60μl的 2×SDS样品缓冲液中沸腾并接受蛋白质印迹。对于其他免疫沉淀，将澄 清的溶解产物与抗体一起孵育1小时，并且将其与20μl的蛋白A/G珠 (Pierce)混合，如上描述的洗涤和处理。用Dounce匀浆器将人脑 (Dr.Peter Davies馈赠)在含10％(v/v)甘油的缓冲液A中匀浆。 过夜提取蛋白质，蛋白质浓度为5mg/ml。将提取的蛋白质在20,000g 下离心1小时。将上清液与用含1％(w/v)BSA的PBS封闭的指定抗体 和蛋白质A/G珠一起孵育。将沉淀物如上描述的洗涤和处理。

代谢标记.将用pcDNA3或BRI2转染的HEK293APP细胞在无甲硫氨 酸和半胱氨酸的DMEM(Invitrogen)中孵育2小时，所述的DMEM补充 有青霉素、链霉素和10％的胎牛血清。随后通过加入[³⁵S]标记的甲硫氨 酸和半胱氨酸(ICN)进培养基中标记细胞30分钟。将标记的细胞彻底 洗涤，在补充有青霉素、链霉素和10％胎牛血清的DMEM中追踪指定的 时间。在追踪后，如上描述的将细胞溶解并用α APPct免疫沉淀。将标 记的细胞通过在20,000g下离心10分钟除去培养基，并随后用标明的 抗体免疫沉淀。

萤光素酶测定法.按所描述的进行该测定法(Scheinfeld等，2003)， 除了将APP-Gal4融合物(Gianni等，2003)用作Gal4来源。通过共转 染的β-半乳糖苷酶的活性标准化萤光素酶活性以监控转染率。

酶联免疫吸附测定法(ELISA).将HEK293APP细胞用pcDNA3或BRI2 转染。在转染24小时后，让细胞适应24小时，并且按照生产商的方法， 用人Aβ ELISA试剂盒(KMI Diagnostics)测量培养基中的Aβ 40和A β 42。如上描述的将转染细胞溶解并澄清，并且将提取的蛋白质的量用 于标准化通过ELISA检测的Aβ的量。

蛋白质测定.蛋白质浓度通过Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad)测 定，BSA用作标准。

结果和讨论

为了检验膜-连接的蛋白质是否可调节APP加工，我们用分裂-泛素 化系统鉴定膜蛋白质之间的相互作用。筛选人脑cDNA文库的与APP家 族蛋白质相互作用的蛋白质导致鉴定了BRI2(Deleersnijder等，1996) 和BRI3(Vidal等，2001)(未显示)，两者是含有Brichos结构域的 II型膜蛋白基因家族的成员。虽然BRI蛋白的功能未知，但在患有FBD (Vidal等，1999)和FDD(Vidal等，2000)的患者中发现BRI2突变 体。值得注意地是，FBD和FDD的神经-病理检查所见包括实质前-淀粉 样沉积(FBD和FDD)和斑(FBD)、神经原纤维缠结、嗜刚果红淀粉样 血管病(CAA)和神经变性，与AD类似。因此，由于BRI2的突变导致 类似AD的家族性痴呆，我们进一步研究这种BRI2-APP相互作用的生理 学相关性。

为了评估哺乳动物细胞中的BRI2-APP相互作用，将HeLa细胞用 BRI2和APP构建体共转染(图1a)。用α FLAG抗体免疫沉淀细胞溶解 产物显示，BRI2与全长的APP(图1b和d)、C99(图1b和d)和APPNcas 相互作用，所述APPNcas表示APP的大部分胞内区域的缺失型(图1c)， 但是不与C83相互作用(图1b和d)。APP以双份进行操作。较低的APP 带表示非糖基化的、未成熟的APP；相反上面的形式是由成熟的、糖基 化的APP组成。值得注意的是，只有成熟的、糖基化形式的APP和APPNcas 与BRI2相互作用(图1b、c和d)。还应该注意的是，BRI2过表达显 著增加了C99的量(图1b和1d)。这种发现的意义将在在后面探究。

大部分BRI2 ecto-结构域的缺失型没有破坏与APP的结合 (BRI2^1-131，图1d)。用αAPP抗体反向免疫沉淀揭示APP免疫沉淀BRI2 (图1e)。此外，在转染的HeLa细胞中检测到的蛋白水解的～17kDa BRI2 NH₂-端片段(BRI2nt，其与BRI2^1-131的大小相似)也与APP沉淀(图1e)。 这些相互作用的特异性为BRI2不结合至ApoER2(另一种I型膜内在蛋 白质)(图1c)这一证据进一步支持。这些发现证明，APP的胞浆内尾 区和大部分的APP和BRI2的外功能区是BRI2/APP相互作用不必要的， 而紧靠跨膜区并含有NH₂-末端Aβ序列的APP外功能区内的17氨基酸区 域是这种结合所必需的。这些数据强烈暗示，BRI2和APP不是反式相互 作用(即，作为在不同膜上表达的受体/配体)，而是，在细胞膜中形 成分子复合物。

APP和BRI2都在成熟的神经组织中表达。因此，我们寻求确定APP 是否在成人脑中也与BRI2相互作用。首先，我们试验了四种抗BRI2抗 体以确定它们是否能免疫沉淀人BRI2。对于这些试验，将HeLa细胞用 FLAG-BRI2转染并用四种BRI2抗体和对照免疫沉淀。如图2a中显示的， 只有EN3抗-BRI2抗体能够沉淀BRI2。接下来，我们制备人脑的匀浆物 并用α APPct抗体或EN3进行免疫沉淀。如图2b中显示的，C99(和更 长的COOH-末端APP片段)与抗-APP及EN3抗体沉淀，而C99不与兔多 克隆IgG沉淀。有趣地是，也在该情形中C83不与BRI2沉淀，尽管它 被α APPct沉淀。此外，全长的APP也被EN3沉淀，尽管处于较低的水 平。总而言之，这些试验表明内源性APP和BRI2在成人脑中结合。此 外，它们显示BRI2优先与C99和更长的APP C-末端片段相互作用但不 与C83相互作用。

如图1b和1d中显示的，BRI2构建体的表达恒定地导致C99的水平 增加。有可能这种C99水平的显著增加取决于BRI2对APP加工的影响。 为了直接检验该可能性，我们在HeLa、HEK293和N2a细胞中表达了FLAG- 标记的BRI2，一起的还有APP-Gal4、受Gal4启动子控制的萤光素酶报 告基因和β-半乳糖甘酶构建体。APP-Gal4是酵母转录因子Gal4与APP 的胞质结构域的融合物。γ-剪切APP-Gal4从膜释放出AID-Gal4至核， 随后激活了萤光素酶转录(Gianni等，2003)。如图3a中显示的，BRI2 在所有这三种细胞系中都减少了萤光素酶活性，暗示抑制了AID的形成。 相反，正如如预期的，β-分泌酶(BACE)的转染导致AID释放增加， (图3b)。仍然与APP相互作用并产生了增加的C99水平的BRI2^1-131突 变体(图1d)也抑制了AID释放(图3c)。最后，混合试验显示，对 于BRI2抑制AID-Gal4释放，它必须与APP-Gal4在相同的细胞中共表 达。实际上，将表达BRI2的细胞与表达APP-Gal4的细胞混合不会影响 AID的释放(图3d)。这进一步表明BRI2和APP是顺式相互作用而不 是反式相互作用。

为了进一步验证该系统，我们已经测量了用BRI2转染的HEK293的 条件培养基中的Aβ，并且发现BRI2显著减少了Aβ 40和Aβ 42的水平 (图3b)。BACE转染再一次增加了Aβ 40和Aβ 42的分泌(图3f)。

BRI2对AID和Aβ产生的抑制表明，BRI2表达减少了γ-分泌酶对 APP的剪切。然而，还可能是BRI2可调节APP的β-和α-剪切。如上面 论述的，APP受β-或α-分泌酶的剪切分别释放出sAPP β和sAPP α于上 清液中。sAPP α或sAPP β的量增加表明α-或β-剪切增加，而sAPP α 或sAPP β减少反映α-或β-剪切减少。因此，为了确定BRI2是否影响 α-或β-分泌酶，我们测量了sAPP α和sAPP β的量。在这些相同的实 验中，我们还测量了C99和C83的细胞内水平。将HEK293-APP细胞用 FLAG-BRI2或载体对照转染。将转染细胞用[³⁵S]甲硫氨酸-半胱氨酸脉冲 标记30分钟，然后在37℃下追踪0、1、2和4小时(图3c)。将细 胞溶解产物在每个时间点用α APP-ct抗体免疫沉淀(图3c)。为了测 量分泌的APP(sAPP α和sAPP β)，从标记4小时的细胞收集上清液并 将其用抗-APP抗体P21(其使sAPP α和sAPP β都沉淀)或6E10(其仅 使sAPP α沉淀)沉淀(图3d)。BRI2转染导致C83(图3c)和sAPP α (图3d)的量减少。相反，C99(图3c)和sAPP β(图3d)的水平增 加。值得注意地是，BRI2在所有时间点都被α APP-ct抗体共免疫沉淀。 因此，BRI2表达减少α-分泌酶剪切APP，同时增加了β-分泌酶对它的 加工。伴随的γ-分泌酶的抑制和APP的β-剪切的增加解释了C99水平 的显著增加。

APP是包括APLP1和APLP2的蛋白质家族的成员。APLP1和APLP2 也是g-分泌酶底物(Scheinfeld等，2002)并且，在众多的γ-分泌酶 底物之中，它们是与APP具有更大的序列相似性的那些。因此，为了检 验BRI2通常是否影响g-分泌酶或特异性抑制APP的g-剪切，我们用 APLP1或APLP2转染BRI2。使用抗-APLP1或抗-APLP2C-末端抗体的蛋 白质印迹表明，BRI2表达不会促进APLP1(未显示)和APLP2(图3i) 的C-端片段的积聚。该结果支持这样的观点：BRI2特异性地对阻断APP 的γ-活性但没有阻断对其他γ-底物上的γ-活性。

总而言之，这些研究表明BRI2和APP在细胞膜中形成多分子复合 物。虽然APP和BRI2在这种复合物中的化学计量必须要研究并且BRI2 和APP是否在含有其他蛋白质的结构中发现是未知的，但我们的数据表 明BRI2作为APP加工的内源性调节物起作用。更特别地是，我们在这 里发现BRI2表达减少了APP的α和γ两种的剪切。尽管负责这些功能 的详细的分子机制必须直接解决，但BRI2与含有α-和γ-切割位点的 APP的区域相互作用这一发现暗示：BRI2在物理上遮蔽了所述分泌酶的 这两种靶序列。

目前，BRI2的突变已在FBD(Vidal等，1999)和FDD(Vidal等， 2000)患者中发现。野生型和突变型BRI2都受弗林蛋白酶加工(Kim 等，1999)，这种加工导致C-末端肽的分泌。野生型BRI2的弗林蛋白 酶剪切释放出17个氨基酸长的肽。在FBD患者中，BRI2的终止密码子 的点突变导致3’-非翻译区的通读(read-through)并合成在C-端含 有11个额外氨基酸的BRI2分子。这种突变的BRI2的弗林蛋白酶剪切 产生一种更长的肽(ABri肽)，其作为淀粉样蛋白纤维沉积。在丹麦亲 缘族中，在正常的终止子之前一个密码子的10-nt重复的存在引起了 BRI2序列的移码(frame-shift)，产生大于正常的前体蛋白质，该蛋 白质的淀粉样蛋白亚基包含最后的34C-末端氨基酸。ABri和ADan淀 粉样蛋白的沉积认为是这些痴呆的致病原因。然而，BRI2调节APP加工 这一发现是令人感兴趣的，并且促使人们推测：改变的APP加工也是FBD 和FDD中的致病因素。与这一假设一致，在FDD患者中检测到升高的A β 42沉积水平，并在CAA损伤中检测到升高水平的ADan。

实施例2.BRI2对APP加工的影响的进一步研究

用实施例1中描述的方法，测量由前80、93、96、99、102、105、 117和131个氨基酸组成的BRI2缺失型构建体的影响。如图4(左图) 中显示的，仅大于99个氨基酸的截短形式显示了C99在总溶解产物中 的积聚，这表明抑制了C99的进一步加工。由前96个和99个氨基酸组 成的缺失型构建体显示出弱很多的抑制作用，而由前80个和前93个氨 基酸组成的那些未显示抑制。BRI2对C99加工的这种抑制作用对应于如 图4(右图)中显示的这些BRI2截断形式与C99和全长APP的结合。将 同一组缺失型构建体用于测定它们对AID产生的影响。APP-Gal4-驱动 的萤光素酶活性的结果(图5)进一步支持这样的结论：含有多于前99 个氨基酸的BRI2构建体是有效抑制产生AID所必需的。

实施例1确定sAPP α在存在BRI2时减少，表明BRI2抑制α-分泌 酶。进行了另外的实验用以测定BRI2对sAPP β产生的影响。如图6中 显示的，sAPP β产生也在存在BRI2时减少，表明BRI2抑制β-分泌酶。

鉴于上述内容，将会发现：本发明的几个优势已实现并且获得了其 他优势。

由于可在上述方法和组合物中做出多种改变而不会背离本发明的 范围，所以意味着上述描述中包含的和附带的图中显示的所有内容都应 该理解为是说明性的而无限制性意义。

本说明书中引用的所有参考文献因此通过引入作为参考。在此参考 文献的论述仅旨在概括由作者做出的论断而不是承认任何参考文献构 成了当前技术。申请人保留了质疑所引用的参考文献的准确性和相关性 的权利。

SEQ ID NO

SEQ ID NO：1-人BRI2氨基酸序列GenBank Q9Y287

1   mvkvtfnsal aqkeakkdep ksgeealiip pdavavdckd pddvvpvgqr rawcwcmcfg

61  lafmlagvil ggaylykyfa lqpddvyycg ikyikddvil nepsadapaa lyqtieenik

121 ifeeeevefi svpvpefads dpanivhdfn kkltayldln ldkcyvipln tsivmppml

181 lellinikag tylpqsylih ehmvitdrie nidhlgffiy rlchdketyk lqrretikgi

241 qkreasncfa irhfenkfav etlics

SEQ ID NO：2-人BRI3氨基酸序列GenBank Q9NQX7

1   mvkisfqpav agikgdkadk asasapapas ateilltpar eeqppqhrsk rggsvggvcy

61  lsmgmvvllm glvfasvyiy ryfflaqlar dnffrcgvly edslssqvrt qmeleedvki

121 yldenyerin vpvpqfgggd padiihdfqr gltayhdisl dkcyvielnt tivlppmfw

181 ellmnvkrgt ylpqtyiiqe emvvtehvsd kealgsfiyh lcngkdtyrl matrmin

241 krgakncnai rhfentfvve tlicgvv

SEQ ID NO：3-人弗林蛋白酶前蛋白原GenBank NP 002560

1   melrpwllwv vaatgtlvll aadaqgqkvf tntwavripg gpavansvar khgflnlgqi

61  fgdyyhfwhr gvtkrslsph rprhslqre pqvqwleqqv akrrtkrdvy qeptdpkfpq

121 qwylsgvtqr dlnvkaawaq gytghgivvs ilddgieknh pdlagnydpg asfdvndqdp

181 dpqprytqmn dnrhgtrcag evaavanngv cgvgvaynar iggvrmldge vtdavearsl

241 glnpnhihiy saswgpeddg ktvdgparla eeaffrgvsq grgglgsifv wasgnggreh

301 dscncdgytn siytlsissa tqfgnvpwys eacsstlatt yssgnqnekq ivttdlrqkc

361 teshtgtsas aplaagiial tleanknltw rdmqhlvvqt skpahlnand watngvgrkv

421 shsygyglld agamvalaqn wttvapqrkc iidiltepkd igkrlevrkt vtaclgepnh

481 itrlehaqar ltlsynrrgd laihlvspmg trstllaarp hdysadgfnd wafmtthswd

541 edpsgewvle ientseanny gtltkftlvl ygtapeglpv ppessgcktl tssqacvvce

601 egfslhqksc vqhcppgfap qvldthyste ndvetirasv capchascat cqgpaltdcl

661 scpshasldp veqtcsrqsq ssresppqqq pprlppevea gqrlragllp shlpevvagl

721 scafivlvfv tvflvlqlrs gfsfrgvkvy tmdrglisyk glppeawqee cpsdseedeg

781 rgertafikd qsal