甘薯离体培养不定根生芽方法及其应用

摘要

本发明公开了一种利用甘薯离体培养不定根产生甘薯芽的方法。使用本发明的方法可方便地获得甘薯芽，该甘薯芽通过无性繁殖可以得到大量甘薯植株。本发明的方法对甘薯的再生培养有着非常重要的意义，并且为甘薯脱毒及遗传转化避免复杂的组织培养程序开辟了新方法。并且，本发明的方法适用性广，对于绝大多数甘薯品种都是适用的。

说明书

技术领域

本发明属于植物学领域；更具体的，本发明涉及甘薯离体培养不定根生芽方法及其应用。

背景技术

甘薯属旋花科，甘薯属，甘薯种，为蔓生性草本植物。甘薯植株可分为根、茎、叶、花、果实、种子等部分。甘薯是一种重要的粮食作物，也是食品加工业的重要原料，营养价值丰富。因此，甘薯品种优化以及培植、再生技术的研究具有重要的意义。

目前，甘薯离体植株再生主要通过体细胞胚胎发生的途径实现，这个过程对基因型依赖性很强，并且非常复杂、耗时。因此，需要探索利用其它途径快速有效地进行甘薯植株再生。

另一方面，由于遗传改良进展缓慢，甘薯的转基因技术逐渐成为研究的热点。甘薯的遗传背景较为复杂，是异源六倍体作物，由常规育种技术引入一些质量性状基因的可能性很小，效果也欠佳。尽管目前基于转基因技术的甘薯遗传转化已取得了一定的进展，但还有许多亟待解决的问题。如：缺乏一个有效的遗传转化体系，转化效率低，获得的转基因植株数量有限，还不能应用于生产；对基因型有比较强的依赖性，到目前，只有栗子香，新大紫，高系14，Jewel，Jonathan等少数几个生产上非主栽品种获得了转基因植株，这些品种均不是主载品种，且它们还不能应用于生产。此外，很多研究者在转基因后经常得到甘薯的再生根系而得不到转基因植株。

因此，本领域迫切需要找到一种方便快捷的甘薯植株再生培养方法，以用于甘薯优良品种的研发或转基因植株的制备。

发明内容

本发明的目的在于提供甘薯离体培养不定根生芽方法及其应用。所述培养方法适合于大多数的甘薯品种。

在本发明的第一方面，提供一种产生甘薯芽方法，所述的方法包括步骤：

(1)在甘薯培养基质上培养甘薯外植体，产生甘薯不定根；

(2)将步骤(1)获得的甘薯不定根置于甘薯培养基质上，从而从根系上生成甘薯芽。

优选的，在步骤(1)中，离体条件下在甘薯培养基质上培养甘薯外植体。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：从根系上分离甘薯芽。

在另一优选例中，在步骤(1)中，所述的甘薯外植体选自：甘薯的茎段、叶、叶柄或根。

在另一优选例中，所述的茎段获自甘薯的苗尖。

在另一优选例中，在步骤(2)中，将甘薯不定根倒置于甘薯培养基质上。

在另一优选例中，在步骤(1)中，在扦插前，还包括步骤：将甘薯外植体消毒灭菌。

在另一优选例中，在步骤(1)中，培养甘薯外植体10-100天(优选的为20-80天，进一步优选的为40-70天)，从而产生甘薯不定根。

在另一优选例中，在步骤(2)中，培养甘薯不定根10-100天(优选的为20-80天，进一步优选的为40-70天)，从而从根系上生成甘薯芽。

在另一优选例中，在步骤(3)之后，还包括步骤(4)：将步骤(3)获得的甘薯芽无性繁殖扩繁后移栽到大田中。

在另一优选例中，所述的培养基质是甘薯组织培养基本培养基。

在另一优选例中，所述的甘薯组织培养基本培养基是：MS基本培养基；并且，所述的MS基本培养基中，维生素B1的含量是0.1-0.9mg/l(优选0.2-0.6mg/l，如0.4mg/l)；蔗糖的含量是10-90g/l(优选20-40g/l，如30g/l)。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，还包括步骤：将外源基因转入甘薯外植体。

在本发明的第二方面，提供一种制备转基因甘薯植株的方法，所述的方法包括：

(1)将外源基因转入甘薯组织或细胞，获得转化入外源基因的甘薯组织或细胞；

(2)培养步骤(1)获得的转入了外源基因的甘薯组织或细胞，产生甘薯不定根；

(3)将步骤(2)获得的甘薯不定根置于甘薯培养基质上，从而从根系上生成甘薯芽；和

(4)从根系上分离甘薯芽，培养该甘薯芽，获得甘薯转基因植株。

在另一优选例中，所述的外源基因选自(但不限于)：性状改良基因、结构基因、抗虫基因、抗病毒基因或抗病基因等。

在另一优选例中，在步骤(3)中，将甘薯不定根倒置于甘薯培养基质上。

在另一优选例中，在步骤(1)中，将外源基因经根癌农杆菌或基因枪介导转入甘薯外植体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了甘薯的茎段扦插到培养基中约2个月时根系的生长情况(从培养瓶中取出)。

图2显示了在扦插2个月后培养瓶中取出的植株的根系(去除培养基后)。

图3显示了将根系倒置于新的培养基后，生长出甘薯芽。

图4显示了将从根系上分离出的甘薯芽。

图5显示了被农杆菌侵染而部分表达GUS基因的外植体，其中箭头所示部位为蓝色(即表达GUS基因)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次找到一种使甘薯不定根再生出芽的方法，使用该方法可方便地获得甘薯芽，该甘薯芽通过无性繁殖可以得到大量甘薯植株。由于甘薯在生产上是以块根保存种质的，只有在块根上才能出芽，因此本发明人的发现对甘薯的离体植株再生培养有着非常重要的意义；并且，本发明的方法为甘薯脱毒及遗传转化避免复杂的组织培养程序开辟了新方法。在此基础上完成本发明。

产生甘薯芽的方法

本发明提供了一种产生甘薯芽方法，所述的方法包括步骤：

(1)将甘薯外植体扦插到甘薯培养基质上，培养该甘薯外植体，产生甘薯不定根；

(2)将步骤(1)获得的甘薯不定根置于甘薯培养基质上，从而从根系上生成甘薯芽；和

(3)从根系上分离甘薯芽。

本发明对于步骤(1)中选择的外植体没有特别的限制，只要其在被扦插到甘薯培养基上后能够生长出根系，其也可以是一些经过遗传操作的再生组织(如经过诱导分化和/或转基因处理的细胞团)。

作为本发明的优选方式，所述的外植体选自：甘薯的茎段、叶或块根(薯块)。甘薯的茎段可以是从甘薯试管苗的茎蔓上切取的片段，通常茎段的直径是0.2-0.5cm，长度是1-2cm。当利用甘薯的叶进行扦插时，可以是整体的叶，也可以是部分叶，如叶柄或叶片。

作为本发明更优选的方式，采用甘薯的苗尖(属于甘薯的茎段)进行扦插。采用甘薯苗尖的优点是苗尖病毒含量较少或没有。

作为本发明的优选方式，在扦插前，还包括步骤：将甘薯外植体进行消毒灭菌。经消毒灭菌处理后的甘薯外植体可大大降低发生污染的可能，从而提高出芽率。

在扦插到培养基中后，对于甘薯外植体的培养时间没有特别的限制，这主要取决于甘薯外植体上不定根的生长速度。作为本发明的优选方式，培养甘薯外植体10-100天，从而产生甘薯不定根。更优选的培养时间为20-80天，进一步优选的培养时间为40-70天。在上述培养时间内，甘薯外植体上可生长出足够的不定根，用于后续步骤。

在获得不定根后，培养甘薯不定根10-100天，从而从根系上生成甘薯芽。优选的培养时间为20-80天，进一步优选的培养时间为40-70天。

作为本发明的优选方式，在步骤(2)中，将甘薯不定根倒置于培养基质上，倒置的优点是可以使本来位于下面的根系充分地与空气接触，从而有利于长芽。

作为本发明的优选方式，当将甘薯不定根从原来的培养容器中取出后，不去除其上残留的培养基质，直接倒置于新鲜培养基质上，这样，使得根系上还残留有营养物质，从而更有利于根系的长芽，最大程度地不对根系造成伤害，操作也更简化。

在根系上产生甘薯芽后，可继续在培养基质上培养甘薯芽，使之扩繁得到大量甘薯植株，或者可将获得的甘薯芽移栽到大田中进行培植。

培养基质

本发明对于用于生成不定根的甘薯培养基质没有特别的限制，只要其可用于培养甘薯外植体并使之生成不定根即可。作为本发明的优选方式，所述的培养基质是甘薯组织培养基本培养基。更优选的，所述的甘薯组织培养基本培养基是：提高了维生素B1(VB1)和蔗糖含量的MS基本培养基。

所述的MS基本培养基的配方可以是：

大量元素：440mg/L CaCl₂·2H₂O、170mg/L KH₂PO₄、1900mg/L KNO₃、370mg/LMgSO₄·7H₂O、1650mg/L NH₄NO₃；

微量元素：0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.25mg/LNa₂MoO₄·2H₂O、6.2mg/L H₃BO₃、0.83mg/L KI、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/LZnSO₄·7H₂O；铁盐：37.25mg/L Na₂EDTA、27.85mg/L FeSO₄·7H₂O；

有机元素：2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L维生素B6(VB6)、0.1mg/L维生素B1(VB1)。

在甘薯组织培养基本培养基中，维生素B1的含量是0.1-0.9mg/L；优选的含量是0.2-0.6mg/L，如0.4mg/L。

在甘薯组织培养基本培养基中，蔗糖的含量是10-90g/L；优选的含量是20-40g/L，如30g/L。

制备转基因植株

由于遗传背景较为复杂，大多数品系的甘薯的转基因植株难以获得，并且在转基因过程中普遍存在生根容易出芽难的问题。通过本发明的方法可改善本领域的上述现状，利用转基因过程中产生的根进行培养，从而获得甘薯芽，进一步获得转基因甘薯植株。

因此，本发明提供一种制备转基因甘薯植株的方法，所述的方法包括：

(1)将外源基因转入甘薯组织或细胞，获得转化入外源基因的甘薯组织或细胞；

(2)培养步骤(1)获得的转入了外源基因的甘薯组织或细胞，产生甘薯不定根；

(3)将步骤(2)获得的甘薯不定根置于甘薯培养基质上，从而从根系上生成甘薯芽；和

(4)从根系上分离甘薯芽，培养该甘薯芽，获得甘薯转基因植株。

所述的外源基因通常是一些对于改善甘薯的品质有益的基因，或者是一些对于甘薯抗病、抗虫、抗病毒等有用的基因。可根据所培育的甘薯的特性及所需改良的性状来选择外源基因。所述的外源基因可以是获自甘薯的，也可以是获自其它生物的，如微生物、植物、动物等。

可采用常规的转基因方法将外源基因转入甘薯组织或细胞中，例如农杆菌转化、基因枪转化法、电击法等方法。转基因技术是本领域人员所熟知的，本发明对此没有特别限制。

本发明的主要优点如下：

(1)首次揭示一种可方便地使甘薯不定根再生出芽的方法，对甘薯的再生培养有着非常重要的意义；并且，本发明的方法为甘薯脱毒及遗传转化避免复杂的组织培养程序开辟了新方法。

(2)本发明的方法可被用于甘薯转基因植株的制备，直接利用甘薯的根系来发展甘薯芽，从而可改变以往甘薯转基因植株培养困难、甘薯组织转化体只长根不长芽的技术难题。

(3)本发明的方法适用性广，对于绝大多数品种的甘薯都是适用的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1甘薯不定根生芽方法

1.甘薯品系的选择

本发明人选择了32个甘薯品系用于不定根生芽试验，所选择的品系如表1所列，这些品系均是本领域常规使用的。

                           表1

2.培养基的配制

所用培养基为甘薯组织培养基本培养基，成分为MS基本培养基附加0.3mg/LVB1，蔗糖浓度提高到30g/L。其中，MS基本培养基的配方是：大量元素：440mg/LCaCl₂·2H₂O、170mg/L KH₂PO₄、1900mg/L KNO₃、370mg/L MgSO₄·7H₂O、1650mg/LNH₄NO₃；微量元素：0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.25mg/LNa₂MoO₄·2H₂O、6.2mg/L H₃BO₃、0.83mg/L KI、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/LZnSO₄·7H₂O；铁盐：37.25mg/L Na₂EDTA、27.85mg/L FeSO₄·7H₂O；有机元素：2mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L维生素B6(VB6)、0.1mg/L维生素B1(VB1)。

将培养基平铺于甘薯离体培养瓶(直径40.5cm，高49cm)中，培养基的厚度是1.5-2.5cm。

3.不定根生芽培植试验

①一次试验

分别取前述表1所列各甘薯品系的茎段(长约1-2cm，直径0.2-0.5cm)，扦插至前述配制的甘薯组织培养基本培养基上，茎段位于培养基内的部分为0.5-1cm，位于培养基表面上的部分为0.5-1cm。每培养瓶扦插的茎段数量为6-13个。

培养几天后，茎段下部会自然生根，并且根系逐渐发达，扦插到培养基中约2个月时根系的生长情况见图1所示。

在培养2个月后，培养基中根系生长密集。然后，除去培养瓶中除根以外的其它组织，将所得根系连带培养基从培养瓶中取出，获得根系(可在根系上保留或去除之前培养所残留的培养基，优选的是保留之前培养所残留的培养基)，去除培养基后的根系如图2所示。

接着，将根系颠倒平铺(即在原培养瓶中接近瓶底的根系位于上方，在原培养瓶中远离瓶底的根系位于下方)至新鲜的甘薯组织培养基本培养基上，再于2月后观察是否出现芽体，并统计根系上芽体产生数目。图3显示了根系上产生芽体的情况；图4显示了从根系上分离出的甘薯芽，可将之移栽到另一培养基质，使之继续生长。

叶源根系采用类似方法将单个叶片扦插至培养基生根就可以获得。

结果，各品系的根生芽的生长结果如表2所示。

                            表2

  编号  品系  瓶数  茎段/瓶  出芽瓶数  出芽数  B01  AY  1  13  0  0  B02  金山57  1  13  0  0  B03  龙薯1号  1  13  1  2  B04  鲁薯7号  1  13  0  0  B05  南薯88  2  13  1  3  B06  宁13-1  2  13  0  0  B07  宁27-17  1  13  0  0  B08  宁99-9-2  1  13  1  1  B09  宁薯192  1  13  0  0  B10  宁紫1号  2  13  1  1  B11  苏薯2号  2  13  2  30  B12  苏薯8号  1  13  0  0  B13  苏薯9号  1  13  1  3  B14  苏渝303  1  13  3  3  B15  皖薯1号  7  13  0  0  B16  皖苏31  1  13  0  0  B17  徐2-2  2  13  2  10  B19  北京553  1  13  0  0  B22  泰薯6号  1  7  1  31  B24  栗子香  1  6  1  3

当根系上的芽长到长度约为1cm时，可将之移到培养基继续培养，经扩繁后可以移栽到大田中。

②二次试验

二次试验选取一次试验及其它试验中未出芽品种加上一次试验中未测试品种，甘薯芽的培植方法同一次试验。

结果，各品系的根生芽的生长结果如表3所示。

                           表3

  编号  品种  瓶数  茎段/瓶  出芽瓶数  出芽数  B04  鲁薯7号  2  10  0  0  B06  宁13-1  9  9  2  3  B07  宁27-17  4  8  0  0  B09  宁薯192  4  11  2  10  B12  苏薯8号  5  12  2  3  B15  皖薯1号  9  13  3  8  B16  皖苏31  10  11  1  1  B18  徐薯18  2  13  0  0  B19  北京553  5  10  1  1  B21  17--4  2  10  0  0  B23  徐薯22  3  3  1  13  B26  79-26  2  3  2  5  B27  ZT06-06  1  3  0  0  B28  ZT06-08  4  2  2  5  B29  ZT06-09  1  2  0  0  B30  济薯18  3  2  1  6  B31  J55-1  1  3  1  13  B32  蒙自真白  1  2  0  0

上述实验证实，在所研究的32个品系中，有21个品系可以从根组织上形成芽体。

另外，本发明人以未出芽的编号为B01、B02、B29和B32的甘薯品系重复进行试验。结果显示，采用前述方法培植，这些品种也是可以出芽的。

至目前为止，经过两次大批量的根生芽实验和一些零散实验，在所试32个甘薯品种中，本发明人已经得到25个品种的由根系形成的株系，出芽率为78％(25/32)。

只有B04(鲁薯7号)、B07(宁27-17)、B18(徐薯18)、B20(鲁薯8号)、B21(17-4)、B25(豫薯10号)、B27(ZT06-06)这7个品种还未观察到芽的形成，其中B20(鲁薯8号)和B25(79-26)是由于在培植过程中发生污染，还有几个品种受材料数量限制，所以实际的出芽率应大于计算值78％。

以下几个数据值得参考：单次实验出芽率按品种计算为：50％(10/20)和61％(11/18)，按实验瓶数计算为：45％(14/31)和26％(18/68)，从理论上讲，经过多次实验，有望拿到更多品系，甚至所有品系的根生苗株系。

由上述结果可见，本发明的方法适用性广，对于绝大多数品种的甘薯都是适用的。

实施例2不同培养条件下生芽比较

选择长芽情况良好的苏薯2号(B11)和泰薯6号(B22)作为试验对象，验证不同培养条件下生芽情况。

培养条件1：

培养方法同实施例1，在获得根系后，将根系颠倒地平铺至新鲜的甘薯组织培养基本培养基上。

培养条件2：

其它培养方法同实施例1，除了：在获得根系后，将根系非颠倒地平铺(即按照在原培养瓶中根系所处方向)至新鲜的甘薯组织培养基本培养基上。

在根系被平铺至新鲜培养基后的2个月后观察是否出现芽体，并统计根系上芽体产生数目。苏薯2号的测试结果如表4所示，泰薯6号的测试结果如表5所示。

                            表4

  苏薯2号  瓶数  茎段/瓶  出芽瓶数  出芽数  培养条件1  4  8  4  40  培养条件2  4  8  1  1

                             表5

  泰薯6号  瓶数  茎段/瓶  出芽瓶数  出芽数  培养条件1  3  8  3  59  培养条件2  3  8  1  1

由上述结果可见，将根系非颠倒平铺培养，根系长芽较为困难，只是偶尔从根系上长出个别芽体；而将根系颠倒地进行平铺培养，根系长芽的几率大大提高。

实施例3制备转基因甘薯植株

采用常规的方法，将pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司，自带GUS基因)表达载体导入到感受态的农杆菌中，筛选阳性克隆，获得导入了所述载体的农杆菌。

通过浸染法，利用导入了所述载体的农杆菌浸染甘薯外植体，部分组织被侵染而表达GUS基因(显示蓝色)的外植体如图5所示。通过抗性选择筛选被农杆菌浸染的细胞，其中一部分为胚性细胞(可分化)，将胚性细胞置于附加了1mg/L ABA的甘薯组织培养基本培养基上，培养约1个月后，将它们转移到不含ABA的甘薯组织培养基本培养基上，这些胚性细胞可逐渐生长出根系。

在根系生长到较为发达的时候，分离出这些根，倒置于甘薯组织培养基本培养基上，使它们长出芽体，这些芽体可进一步发展为转基因植株。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与本申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。