使用表达GM－CSF的痘病毒系统性治疗转移性癌和/或全身散布性癌

摘要

本发明涉及用于利用血管内施用痘苗病毒治疗癌和癌细胞的方法和组合物。在一些实施方案中，方法和组合物涉及编码GM－CSF的复制型痘苗病毒。

说明书

本申请要求于2005年7月7日申请的序列号为60/714,679的美国 临时专利申请案的优先权，将其通过全文引入作为参考。

发明背景

I.发明领域

本发明一般普遍涉及肿瘤学和病毒学领域。更特别地，本发明涉及 表达GM-CSF的痘苗病毒以及它们在全身施用以治疗癌中的用途。

II.相关技术的描述

正常组织的体内平衡是高度受调控的细胞增殖和细胞死亡的过程。 细胞增殖或细胞死亡的失衡可以发展成癌性状态(Solyanik等，1995； Stokke等，1997；Mumby and Walter，1991；Natoli等，1998；Magi- Galluzzi等，1998)。例如，子宫颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、结肠直 肠癌和脑癌仅仅是可以导致的许多癌中的一些实例。事实上，癌的发生 率如此之高以致在美国每年有超过500000人由于癌而死亡。

细胞增殖和细胞死亡的维持至少部分受原癌基因和肿瘤抑制基因 的调控。原癌基因或肿瘤抑制基因可以编码诱导细胞增殖的蛋白质(例 如，sis、erbB、src、ras和myc)、抑制细胞增殖的蛋白质(例如，Rb、 p16、p19、p21、p53、NF1和WT1)或调控程序化细胞死亡的蛋白质(例 如bcl-2)(Ochi等，1998；Johnson和Hamdy，1998；Liebermann等， 1998)。然而，这些原癌基因和肿瘤抑制基因的基因重排或突变导致原 癌基因转变为潜在的引起癌的致癌基因或肿瘤抑制物转变为无活性的多 肽。通常，单个点突变足以实现转化。例如，P53肿瘤抑制基因蛋白中 的点突变导致野生型P53功能的完全丧失(Vogelstein和Kinzler， 1992)。

目前，仅有很少几个有效选择用于治疗许多普通的癌类型。用于给 定个体的疗程取决于诊断、疾病已经发展到的阶段以及一些因素例如患 者的年龄、性别和一般健康状态。癌症治疗的最常规选择是外科手术、 放射疗法和化学疗法。外科手术在癌的诊断和治疗中起核心作用。通常， 需要外科手术途径来用于生物活组织检查和移除癌性生长。然而，如果 癌已经转移和扩散，外科手术将不可能达到治愈并且必须采取备选的方 法。放射疗法、化学疗法以及免疫疗法是癌的外科手术治疗的备选方法 (Mayer，1998；Ohara，1998；Ho等，1998)。放射疗法涉及精确地靶 向高能辐射以摧毁癌细胞并且很像外科手术，主要在治疗非-转移性、局 部化的癌细胞中有效。放射疗法的副作用报刊皮肤刺激、吞咽困难、口 干、恶心、腹泻、脱发和疲乏无力(Curran，1998；Brizel，1998)。

用抗癌药物治疗癌的化学疗法是另一种模式的癌疗法。给定的抗癌 药物疗法的功效通常受限于实现药物递送贯穿实体瘤的难度(el-Kareh 和Secomb，1997)。化学疗法策略是基于肿瘤组织的生长，其中将抗癌 药物靶向快速分裂的癌细胞。大多数化疗方法包括联合多于一种的抗癌 药物，这已经证明能增加各种各样的癌的应答率(美国专利5,824,348； 5,633,016和5,798,339，将其通过引入作为参考)。化疗药物的一个主 要副作用是它们也影响正常的组织细胞，最可能受影响的细胞是在一些 情形中(例如骨髓、胃肠道、生殖系统和毛囊)快速分裂的那些细胞。 化疗药物的其它毒性副作用可以包括口腔溃疡、吞咽困难、口干、恶心、 腹泻、呕吐、疲劳、出血、脱发和感染。

免疫疗法是癌研究中一个快速发展的领域，是治疗某些类型的癌的 又一个选择。理论上，可以刺激免疫系统以将肿瘤细胞识别为外来物并 靶向它们将其摧毁。不幸地是，响应通常不足以防止大多数肿瘤生长。 然而，最近发展增强或补足免疫系统的天然防御机制的方法已经成为免 疫疗法领域中的一个焦点。目前处于研究或在使用的免疫疗法的实例是 免疫佐剂(例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、镰状疟原虫 (Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香化合物)(美国专利 5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides 等，1998)、细胞因子疗法(例如，干扰素(IL-1、GM-CSF和TNF)(Bukowski 等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)以及基因疗法(例 如，TNF、IL-1，IL-2，p53)(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca， 1998；美国专利5,830,880和5,846,945)和单克隆抗体(例如，抗神 经节甙GM2、抗-HER-2、抗-p185)(Pietras等，1998；Hanibuchi等， 1998；美国专利5,824,311)。这些方法虽然显示了一些前景，但表现出 有限的成果。

复制选择性的溶瘤病毒很有希望用于治疗癌(Kirn等，2001)。这 些病毒可以通过直接复制依赖性的和/或病毒基因表达依赖性的溶瘤效 果引起肿瘤细胞死亡(Kirn等，2001)。而且，病毒能增强宿主体内细 胞介导的抗肿瘤免疫的诱导(Todo等，2001；Sinkovics等，2000)。 这些病毒也可以经基因工程改造而在肿瘤内表达治疗性转基因而增强抗 肿瘤效力。

然而，这种治疗方法存在大的局限性。尽管可以证明一些病毒物种 一定程度的天然的肿瘤选择性，仍需要新的方法来改造和/或增强溶瘤病 毒的肿瘤选择性以便使安全性最大化。当采用血管内施用时以及在将潜 在毒性治疗剂加至这些病毒来增强抗肿瘤效能；基因表达将需要严格局 限于正常组织时，这种选择性将变得特别重要。而且，通过另外的机制， 例如诱导抗肿瘤免疫或靶向肿瘤相关的脉管系统，来增加抗肿瘤效力是 十分期望的。

因此，需要更有效且更少毒性的用于治疗癌的疗法。然而，溶瘤病 毒和免疫疗法的使用代表了可以发展的领域，然而上面讨论的局限性需 要克服。因而本发明解决了那些局限性。

发明概述

因而，根据本发明，提供了杀死受试者中的癌细胞的方法，该方法 包括施用有效量的复制性痘苗病毒给受试者，所述的痘苗病毒具有表达 区，其启动子引导编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸 的表达，其中施用是血管内施用。特别是考虑核酸编码人GM-CSF。

痘苗病毒可以经静脉内或经动脉内施用，例如，使用静脉内滴注或 推注，或使用泵。可以将痘苗病毒分散于可药用制剂中。受试者可以施 用大约10⁵、10⁶、10⁷、10⁸至大约10⁹、10¹⁰、10¹²、10¹³pfu之间的病毒或 在大约10⁷至大约10¹⁰pfu之间的病毒。受试者可以施用痘苗病毒多次(1、 2、3、4、5、6或更多次)，例如，其中第二次处理在第一次处理的1、 2、3、4、5、6、7天或数周内进行，或其中第二次处理在第一次处理的 2周内进行。可以施用相同的或不同的剂量。癌细胞可以是转移的癌细 胞。受试者可能具有脑癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、睾丸癌、子宫癌、 胃癌、肺癌、结肠直肠癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、肝细胞癌、血癌、 淋巴瘤、骨髓瘤或黑素瘤。

痘苗病毒可以在其基因组中具有缺失或在一个或多个基因中具有 突变。痘苗病毒的胸苷激酶基因可能已经删除。痘苗病毒可能在在编码 以下多肽或因子的基因中具有突变：(a)痘苗病毒生长因子；(b)功 能性干扰素-调节多肽，其中所述的干扰素-调节多肽直接结合干扰素； (c)补体调控多肽，其中突变导致病毒缺少至少一种功能性补体调控多 肽；(d)TNF-调节多肽，其中突变导致病毒缺少至少一种功能性TNF- 调节多肽；(e)丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中突变导致病毒缺少至少一种 功能性丝氨酸蛋白酶抑制剂；(f)IL-1β调节多肽，其中突变导致病毒 缺少至少一种功能性IL-1β调节多肽；(g)功能性A41L，B7R，N1L或 vCKBP趋化因子结合多肽或C11R EGF-样多肽，其中突变导致病毒缺少至 少一种A41L、B7R、N1L、vCKBP或C11R的功能；或(h)多肽，其中突 变导致传染性EEV型痘苗病毒的增加。而且，痘苗病毒可以在痘苗病毒 生长因子中包含突变。痘苗病毒可以是Wyeth或Western Reserve(WR) 株。启动子可以是痘苗病毒启动子、合成的启动子、至少在感染早期期 间引导转录的启动子或至少在感染晚期期间引导转录的启动子。

在另一实施方案中，提供了用于在受试者中治疗癌的方法，该方法 包括施用有效量的复制性痘苗病毒给受试者，所述的痘苗病毒具有表达 区，其启动子引导编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸 的表达，其中施用是血管内施用。

在又一个实施方案中，提供了用于在受试者中治疗一个或多个转移 灶的方法，该方法包括施用有效量的复制性痘苗病毒给受试者，所述的 痘苗病毒具有表达区，其启动子引导编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)的核酸的表达，其中施用是血管内施用。

在其它实施方案中，考虑涉及经血管内施用的可复制痘苗病毒的方 法可以含有编码不同于GM-CSF的蛋白质或RNA的核酸。在特别的实施方 案中，核酸编码另一种细胞因子。在某些实施方案中，核酸编码其它的 免疫刺激性细胞因子或化学因子，例如IL-12、IL-2等。在另外的实施 方案中，核酸可以编码胸苷脱氨酶或肿瘤坏死因子(TNF)，例如TNF- α。而且，考虑复制性痘苗病毒可以表达多余一种异源序列。其可以表 达，例如，GM-CSF蛋白和其它蛋白质或RNA分子。

特别是考虑关于特殊的方法或组合物的任何实施方案可以实现本 发明的其它方法和组合物。

当在权利要求书和/或说明书中连同术语“包含”使用时，单词“一” 或“一个”的使用可表示“一个”，但是其也与“一个或多个”、“至 少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。

通过下面的详述，本发明的其它的目的、特征和优势将变得显而易 见。然而应该理解，尽管说明了本发明的具体实施方案，但详述和特定 实施例仅是以例证的方式给出，因为根据该详述在本发明的精神和范围 内的多种改变和修饰对本领域技术人员将变得显而易见。

附图简述

下面的附图构成了本说明书的一部分并且包含在内以进一步说明 本发明的某些方面。本发明可以通过参考一个或多个这些附图，结合在 此说明的具体实施方案的详细描述来更好的理解。

图1-JX-594静脉内(IV)治疗自发性大鼠肝细胞癌(HCC)大鼠 接受它们饮用中的诱变剂N-亚硝基吗啡(NMM)(175mg/L)，为期8 周，并然后接受超声(US)直到HCC肿瘤已经形成并为300-400mm³(通 常是16-20周后)。然后让动物接受3次静脉内剂量(每两周1次，箭 头所示)的PBS(n＝17)或1×10⁸PFU的JX-594(n-6)。然后基于来自 US成像的肿瘤的测量计算后来的肿瘤体积。

图2A-2B-JX-594静脉内剂量治疗兔中的VX2肝肿瘤，对原发性 肿瘤和转移瘤的效率。将VX2细胞(来自解离的1mm³肿瘤)移植进新西 兰白兔的肝脏中并通过超声(US)和CT扫描检测肿瘤生长。一旦肿瘤达 到2-4cm³，用单次剂量的PBS(n＝7)或用JX-594(1×10⁹PFU)(n＝3/ 组)经静脉内或US引导的IT注射。(图2A)通过CT扫描在7周后测 量肝脏中后来的肿瘤体积，(图2B)在第6周和第7周通过CT扫描计 算肺中可检测的肿瘤转移灶的数目。

图3-JX-594和JX-963低剂量静脉内重复治疗兔中的VX2肝肿瘤。 如图2A-2B中描述的移植肿瘤细胞。在肿瘤达到2-4cm³后用1×10⁸PFU 的JX-594、JX-963或wDD(n-6/组)，或PBS(n＝18)静脉内治疗动物3 次(每两周一次，箭头所示)。CT扫描后来的原发性肿瘤体积。

图4-JX-594、wDD和JX-963对负荷VX2肝肿瘤的兔中的肺转移灶 的效果。在治疗开始后每隔一周通过CT扫描检查动物(来自图3中描述 的试验)的肝脏转移灶。显示了每组中的每只动物的可检测转移灶的平 均数目。

图5-在IV递送JX-963后负荷VX2肝肿瘤的兔的存活率。如图3 中描述的用三次剂量的1×10⁸PFU的JX-963处理负荷肝肿瘤的动物。显 示了这些动物和对照处理组的卡普兰-迈耶存活曲线。因为JX-594和 wDD组的存活率不显示显著的差别，所以不包括JX-594和wDD组。

图6A-6C-痘苗株的Burst ratio、细胞病变效应和系统递送病毒 株至肿瘤。(图6A)痘苗株在肿瘤中对在正常细胞中的Burst ratio。 将不同的痘苗株以1.0个噬斑形成单位噬斑形成单位(PFU)/细胞的感 染复数(MOI)用于感染原发性正常细胞(NHBE)和肿瘤细胞系(A2780)。 通过噬菌斑测定法滴定48小时后收集的病毒病表示出在肿瘤细胞中相 对于在正常细胞中产生的病毒(每个细胞)的比率。(图6B)由病毒感 染产生的细胞病变效应。将Western Reserve、血清5型腺病毒和腺病 毒d11520株(ONYX-015)(在一些测定法中)以一系列的MOI(PFU/细 胞)加入至细胞系中，并再72小时后用MTS(Promega)测量细胞生存 力。画出了减少细胞生存力至未受处理的对照孔的50％(ED₅₀)所需的病 毒的MOI(PFU/细胞)。(图6C)系统性递送病毒株至肿瘤。将1×10⁹PFU 的痘苗株Western Reserve或血清5型腺病毒静脉内递送至负荷皮下CMT 64或JC肿瘤的免疫活性小鼠。在48或72小时后杀死小鼠并对石蜡包 埋的肿瘤组织切片上的病毒外壳蛋白进行免疫组织化学分析。图片显示 了每个肿瘤中的阳性细胞的打分(*＝没有检测到)。对于每种情况，结 果是基于来自3只小鼠的肿瘤，并且对于每个肿瘤，对随机选取的10个 视场打分。

图7-WR和wDD对一组人肿瘤细胞系的细胞病变效应。在用WR或wDD 感染肿瘤细胞系后72小时后测定EC₅₀值。画出了减少细胞生存力至未受 处理的对照孔的50％(ED₅₀)所需的病毒的MOI(PFU/细胞)。

图8A-8CH-Ras过度表达对病毒复制的影响、系统性递送至负荷肿 瘤的小鼠后WR和wDD的生物分布以及通过光产生定量的病毒基因表达。 (图8A)H-Ras的过度表达对病毒复制的影响。用不同的痘苗株以1.0 PFU/细胞的MOI感染增殖的或者血清饥饿的表达活化H-Ras的NIH 3T3 细胞和NIH 3T3细胞。病毒株是亲本Western Reserve(WR)和在胸苷激 酶(TK)基因中含有缺失或插入的WR(vJS6)或在病毒生长因子(VGF) 基因中含有缺失或插入的WR(vSC20)或在这两种基因中含有缺失或插 入的WR(wDD)。在48小时后通过噬菌斑测定法滴定感染性病毒。(图 8B)系统性递送至负荷肿瘤的小鼠后WR和wDD的生物分布。用1×10⁷PFU 的痘苗病毒通过尾静脉注射处理负荷皮下人HCT 116肿瘤的无胸腺CD1 nu/nu小鼠(箭头所示)。在处理后标明的时间，加入底物荧光素后通 过在VISI100系统(Xenogen Corp，Alameda)中进行生物发光成像检测 表达荧光素酶的病毒株(WR和wDD)和随后的病毒表达的生物分布。(图 8C)画出了负荷皮下JC肿瘤(n＝5只小鼠/组)并通过尾静脉注射用1×10⁷PFU任一种病毒处理的BALB/c小鼠的覆盖整体(腹部图像)的重要区域 随时间的病毒基因表达(通过光产生定量)(虚线、空心符号)或仅来 自肿瘤的随时间的病毒基因表达(背视图)(实线、实心符号)。

图9A-9C-对负荷移植进肝中的VX2肿瘤的兔在肿瘤移植后进行CT 成像、对VX2肿瘤细胞进行CTL测定法以及用JX-963预先处理兔。(图 9A)在肿瘤移植后对负荷移植进肝中的VX2肿瘤的兔进行CT成像。在肿 瘤移植后第2、3和4周后(箭头所示)通过耳部小静脉注射递送1×10⁹PFU 病毒wDD和JX-963，这时肿瘤测量为5cm³。也在这些动物中测量了可 检测的肺转移灶的数目(显示了第8周时原发性肝肿瘤的代表性CT图像) (对照处理的动物n＝8；wDD处理的动物n＝6；JX-963处理的动物拿)。 (图9B)目标为VX2肿瘤细胞的CTL测定法。用与12.5×；25×和50 ×来自负荷VX2肿瘤并用JX-963处理的兔；来自负荷有VX2肿瘤的未经 处理的动物；以及来自原来的动物(na□ve animal)的未标记的外周血 淋巴细胞混合的预先标记的VX2细胞通过FACS分析进行CTL测定法。通 过ACT1测定法(Cell Technology，Mountain View)定量细胞死亡。 (图9C)将用JX-963如(A)中处理的四只兔用1×10⁹ PFU JX-963在移 植后第42天(箭头所示)预处理，然后通过CT扫描随后的肿瘤体积。

图10A-10B-用WR或Ad5感染的细胞系的病毒产生和由病毒感染产 生的细胞病变效应。(图10A)用Western Reserve或血清5型以1.0PFU/ 细胞的MOI感染不同的细胞系。通过噬菌斑测定法滴定48小时后产生的 病毒的量(感染单位/细胞)。(图10B)处死如图1C中处理的小鼠并 对肿瘤切片的病毒外壳蛋白染色。代表性的图片显示了在处理后72小时 和10天时的切片。

图11-用WR或Ad5感染的细胞系的病毒产生。将增殖或生长至接触 抑制(N.B.肿瘤细胞不变成接触抑制的)的人肿瘤细胞系(Panc-1和 MCF-7)或人永生化但非-转化细胞系(Beas-2B和MRC-5)用不同的痘苗 株以1.0PFU/细胞的MOI处理。使用的病毒株是Western Reserve(WR) 和在胸苷激酶(TK)基因中含有缺失的WR(vJS6)或在病毒生长因子(VGF) 基因中含有缺失的WR(vSC20)或在这两种基因中含有缺失的WR(wDD)。 在48小时后通过噬菌斑测定法滴定产生的病毒。

图12-系统性递送wDD的回收。系统性递送(腹膜内注射1×10⁹PFU) 至负荷皮下MC38肿瘤的C57B/6小鼠的wDD的回收。在处理(n＝8)后第 5天或第8天处死小鼠并回收不同的组织并且通过噬菌斑测定法滴定病 毒感染单位(PFU/mg组织)(*＝低于检测极限)。

图13A-13B-通过不同途径递送进负荷肿瘤的小鼠模型中后wDD的 效力。(图13A)单次静脉内注射1×10⁹PFU的病毒株wDD或携带胸苷缺 失的痘苗Wyeth株递送至负荷皮下TIB 75肿瘤(50-100mm³)的免疫活 性小鼠。通过测径器测量肿瘤体积(n＝8/组)(图13B)将1×10⁹PFU 的wDD经瘤内(IT)或腹膜内(IP)递送给负荷皮下HT29肿瘤的SCID 小鼠或负荷皮下MC38肿瘤的C57B/6小鼠并将随后的肿瘤体积与未受感 染的对照组(n＝8/组)进行比较。

图14-用JX-963(1×10⁸PFU)处理负荷VX2肿瘤的兔后中和抗体 的形成。将在标明的时间从兔获得的血浆的稀释物与已知数目的病毒PFU 孵育，并显示了保持50％的噬菌斑所需的稀释物。

说明性实施方案的描述

表达GM-CSF的痘病毒表明了在患有骨髓瘤的动物或患者中经肿瘤 内注射后的效力和安全性(Mastrangelo等，1999；2000)。观察到了 局部注射位点和远距离效果，包括肿瘤退化和稳定(Mastrangelo等， 1999)。效力据认为是由于在哺乳动物中诱导了对癌细胞的免疫应答。 美国专利6,093,700和6,475,999提出通过在人中进行肿瘤内注射将痘 病毒用于递送GM-CSF至肿瘤以便原位免疫对抗骨髓瘤、头颈癌、前列腺 癌和膀胱癌(Mastrangelo等，2002)。这些癌是因为它们的在表面的 性质并可以直接进行肿瘤内注射而选择。据报道，这些癌也对诱导系统 性肿瘤特异性的、细胞毒性T-淋巴细胞的免疫疗法敏感。GM-CSF证明是 肿瘤特异性的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)的有效诱导剂(Dranoff等， 1993)。因为病毒诱导免疫细胞浸润和致炎细胞因子，病毒可能构成了 递送并在肿瘤体表达GM-CSF的理想方法。

然而肿瘤内的注射途径具有大的局限性。这局限于可以进行安全的 肿瘤内注射的肿瘤，通常是浅表肿瘤，例如上面列出的那些。而且，对 未注射的肿瘤的效力需要诱导足够强的肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细 胞。这些缺点使这种方法的功用局限于浅表的且能够系统性地诱导足够 强的肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞的肿瘤。这种肿瘤是少见的。适 用于这种方法的仅有的一个清楚的实例是转移性黑素瘤。然而，即使在 这种肿瘤类型中，远距离应答缓慢且局限于浅表皮肤转移灶。基于器官 或内脏的肿瘤不应答。因为这些肿瘤是几乎所有癌相关的发病和死亡的 原因，系统性的细胞毒性T淋巴细胞表现得不足以诱导持续的、系统性 的、内脏应答或治愈。因此，绝大部分的人肿瘤不能用这种方法得到成 功的效果。

血管内施用(即静脉内、动脉内)递送至转移性肿瘤和免疫组织(例 如网状内皮细胞)具有许多理论上的优势。首先，递送表达GM-CSF的疸 病毒至哺乳动物体内的大部分肿瘤位点或所有肿瘤位点使得能通过局部 的肿瘤内的效果(由于受感染肿瘤内局部的疸病毒复制和GM-CSF作用) 和肿瘤特异性的、细胞毒性T淋巴细胞诱导两者，以及随之在受感染的 肿瘤位点和在远处(不直接用初始剂量感染的肿瘤位点中)两者的效力 系统性地破坏了肿瘤。通过血流递送病毒至肿瘤也使得更一致、广泛地 感染肿瘤中的癌细胞。因此，本发明现在提出多灶性、散布的、转移性 肿瘤可以有效地通过血管内的表达GM-CSF的痘病毒治疗。不适合肿瘤内 方法的许多癌类型和/或阶段也将潜在地可以用血管内注射方法治疗。实 例包括，但不限于肺癌、结肠直肠癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺 癌、肝细胞癌、血癌、淋巴瘤、骨髓瘤和黑素瘤。

然而，技术人员认为安全和有效的使用血管内的表达GM-CSF的痘 病毒受潜在问题的负面影响。首先，安全上的考虑是很重要的。在血管 内施用后，许多正常的组织将曝露于痘病毒感染。随后强的致炎细胞因 子如GM-CSF的表达据预测将潜在地在许多器官，例如肝、肺、肾、心、 脑等中导致显著的炎症。而且，系统性的曝露于病毒血症可以潜在地诱 导脓毒症及其相关的并发症(例如低血压)。小鼠或人脑中的痘病毒感 染例如可以导致临床上显著的、甚至是致死的脑炎。GM-CSF表达可以由 于增强炎症而潜在显著地恶化这种并发症。

其次，通过GM-CSF表达系统性地诱导肿瘤特异性CTL以前仅通过 定位GM-CSF表达来进行，定位GM-CSF表达是通过直接肿瘤注射(例如 牛痘-GM-CSF、HSV-GM-CSF)或通过离体感染/转染自体或同种异体肿瘤 细胞来表达GM-CSF(例如GVAX方法)，随后通过注射GM-CSF细胞进皮 肤中。

尽管有这些潜在的缺点，本发明现在已经证明，两种不同的表达 GM-CSF的痘病毒是静脉内耐受良好的并且对散布的肿瘤和转移灶高度有 效。而且，在静脉内施用后表达GM-CSF的痘苗比其不表达GM-CSF的对 照对原发性肿瘤和肺转移灶两者具有显著更好的效力。而且，尽管另外 具有其它病毒中不存在的vfg基因中的缺失，这种病毒比相当的病毒 (Wyeth疫苗株)对原发性肿瘤和肺转移灶具有显著更好的效力。因而， 用静脉内施用表达人GM-CSF的痘苗导致比没有GM-CSF的相同痘苗有显 著更好的效力，并且血管内施用表达GM-CSF的WR株缺失型突变体比表 达GM-CSF的标准疫苗株显著更好。这些病毒在施用给负荷肿瘤的动物 (大鼠和兔)和正常动物(兔)耐受良好。受处理的动物没有降低体重 而不接受处理的负荷肿瘤动物体重降低。在静脉内处理后存活率升高。 通过血液检测或组织病理学没有发现显著的器官毒性。唯一可重复的组 织病理学发现是处理后可见的多个淋巴样增生位点(与系统性的免疫刺 激一致)。在组织病理学上没有注意到显著的毒性。因此，这些表达GM-CSF 的痘病毒在高度有效对抗系统性癌的剂量时是耐受良好的。

I.痘病毒

A.痘苗病毒

痘苗病毒对病毒学来说是一个谜。不知道痘苗病毒是否是遗传重组 的产物、其是否是通过长的连续传代而缘于牛痘病毒或天花病毒的一个 种、或其是否是现在灭绝的病毒的生活的代表。痘苗病毒通过接种进前 臂皮肤的浅层中用于天花预防接种。然而，天花的消灭，已经停止了使 用痘苗病毒的常规接种。最近的兴趣集中在其可能作为用于免疫其它病 毒和基因疗法的载体的用途上。

痘苗病毒是痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科、正痘病毒属的一个成 员。该病毒颗粒含有RNA聚合酶、早期转录因子、聚腺苷酸聚合酶、加 帽酶复合体、RNA(核苷-2′)甲基转移酶、三磷酸核苷磷酸水解酶II、 缺口连接酶、DNA拓扑异构酶和蛋白激酶。基因组是刚超过180,000碱 基对的双链DNA，其特征是有10kB的末端反向重复。病毒通过与质膜 的pH-不依赖性融合或低pH-依赖性胞内体途径进入细胞。

B.其它痘病毒

正痘病毒属比脊椎动物痘病毒亚科的其它成员相对更同源，并且包 括11种不同但是密切相关的种，包括痘苗病毒、开花病毒(天花的病原 体)、牛痘病毒、水牛痘病毒、猴痘病毒、鼠痘病毒和马痘病毒种等(见 Moss，1996)如在此描述的，本发明的某些实施方案可以延伸到正痘病 毒属的其它成员以及副痘病毒属(Parapoxvirus)、禽痘病毒属 (Avipoxvirus)、羊痘病毒属(Capripoxvirus)、兔痘病毒属 (Leporipoxvirus)、猪痘病毒属(Suipoxvirus)、软疣痘病毒属 (Molluscipoxvirus)和亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus)。痘病毒科的 属通常通过血清血手段，包括实验室动物中的中和和交叉反应性来定义。 正痘病毒属的多个成员以及脊椎动物痘病毒亚科(Chordovirinae subfamily)的其它成员利用免疫调节分子(在此提供了其实例)来中和 宿主生物体的免疫应答。因而，在此描述的本发明不限于痘苗病毒，但 是可以应用于许多病毒。

II.痘病毒的基因工程改造

病毒频繁地由免疫调节分子，例如干扰素(-α，-β，-γ)和肿 瘤坏死因子-α(TNF)失活、抑制或清除。宿主组织和炎性/免疫细胞频 繁地分泌这些分子以相应病毒感染。这些分子具有直接的抗病毒效果和/ 或通过募集和/或激活炎性细胞和淋巴细胞的间接效果。由于这些免疫学 清除机制的重要性，病毒已经进化而表达抑制这些细胞因子/趋化因子和 干扰素的诱导和/或功能的基因产物。例如，痘苗病毒(VV；以及一些其 它痘病毒)编码分泌蛋白vCKBP(B29R)，其结合并抑制CC趋化因子(例 如RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子、MIP-1-α)(Alcami等，1998)。 一些VV株也表达结合并失活TNF的分泌性病毒蛋白(例如Lister A53R) (Alcami等，1999)。多数痘病毒株具有编码结合并抑制干扰素-α/β 的功能的分泌性蛋白的基因(例如B18R)或编码结合并抑制干扰素-γ 的功能的分泌性蛋白的基因(B8R)。vC12L是IL-18结合蛋白，其防止 IL-18诱导IFN-γ和NK细胞/细胞毒性T细胞激活。已经在小鼠中进行 了大多数的痘病毒毒性研究。许多(但不是全部)这些蛋白质在小鼠中 是有活性的(例如，B18R没有活性)。在其中这些蛋白质对抗小鼠的靶 细胞因子的情形中，这些基因的缺失导致使用缺失这些基因或这些基因 有功能性突变的VV突变体时毒性减少和安全性增加。而且，与表达抑制 性蛋白质的亲本病毒株比较，对这些突变体的炎性/免疫应答以及病毒的 清除通常增加。例如，Tl/35kDa家族的痘病毒-分泌性蛋白质(趋化因 子-结合/-抑制性蛋白)的缺失可以导致白细胞浸润进病毒感染的组织显 著增加(Graham等，1997)。VV中vC12L基因的缺失导致在鼻内施用给 小鼠后低的病毒滴定度/毒性；而且，NK细胞和细胞毒性T-淋巴细胞活 性以及IFN-γ诱导增加(Smith等，2000)。粘液瘤病毒T7基因(能够 结合IFN-γ和广泛的趋化因子)的缺失导致在毒性模型中减少的毒性和 显著增加的组织炎症/浸润(Upton等，1992；Mossman等，1996)。来 自粘液瘤病毒的M-T2基因的缺失也导致兔模型中减少的毒性(Upton等， 1991)。B18R抗-干扰素-α/-β基因产物的缺失也导致正常组织中IFN- 介导的清除的病毒敏感性增强、毒力减少(Symons等，1995；Colamonici 等，1995；Alcami等，2000)。总之，这些病毒基因产物起着降低抗病 毒免疫应答和炎性细胞浸润进病毒感染组织中的作用。通过缺失/突变而 丧失蛋白质功能导致病毒在宿主组织中的毒力降低和/或致炎性质增加。 参见PCT/US2003/025141，将其通过引入作为参考。

细胞因子和趋化因子可以导致强烈的抗肿瘤效果(Vicari等，2002； Homey等，2002)。这些效果可以直接在肿瘤细胞自己上(例如TNF)或 它们可以是间接的，通过作用在非癌性细胞上。后者的实例是TNF，其 可以通过引起对肿瘤相关的血管的毒性而具有抗肿瘤效果；这导致丧失 血液流至肿瘤，随后引起坏死。而且，趋化因子可以起作用而募集(以 及在一些情形中激活)免疫效应细胞，例如中性白细胞、嗜酸粒细胞、 巨噬细胞和/或淋巴细胞。这些免疫效应细胞可以通过许多机制引起肿瘤 破坏。这些机制包括抗肿瘤细胞因子(例如，TNF)的表达、fas-配体的 表达、穿孔蛋白(perforin)和粒酶的表达、天然杀死细胞的募集等。 这些炎性应答可最终导致系统性的肿瘤特异性免疫的诱导。最后，许多 这些细胞因子(例如TNF)或趋化因子可以与化学疗法或放射疗法协同 作用来消灭肿瘤。

临床有效的系统性施用重组的这些免疫调节蛋白是不可行的，这是 因为(1)系统性施用诱导严重的毒性以及(2)需要在肿瘤组织内局部 表达来刺激局部的浸润和抗肿瘤效果。需要有方法来获得这些分子在肿 瘤体内的高的局部浓度，同时使体循环中的水平最低。可以改造病毒来 表达细胞因子或趋化因子以试图增强它们的效力。从复制选择性载体表 达这些基因比从非复制型载体表达具有潜在的优势。从复制性病毒表达 可以导致肿瘤体内更高的局部浓度；而且，复制性病毒可以有助于通过 在促炎环境中的肿瘤细胞破坏/癌细胞溶解和释放肿瘤抗原而诱导抗肿 瘤免疫。然而，这种方法有几个局限性。具有在以高的局部浓度表达时 可能会有毒性的基因的有复制能力的病毒(虽然是肿瘤选择性的)释放 进环境中的可能性引起了严重的安全上的顾虑。从它们的基因组表达强 效的促炎基因的病毒因而对受治疗患者以及对公众造成了安全上的风 险。即使使用表达这些基因的肿瘤靶向的、复制选择性病毒，基因表达 也可能在正常组织中发生，导致毒性。而且，大小的限制防止了多种和/ 或大基因从病毒(腺病毒)表达；这些分子一起将无疑更有效地作用。 最后，使用的许多溶瘤病毒表达抗炎蛋白质并因而这些病毒将抵消受感 染肿瘤体内促炎环境的诱导。

A.痘苗病毒产物

1.干扰素调节多肽

干扰素-α/-β通过几种机制阻断病毒复制。干扰素-γ具有较弱的 直接病毒抑制效果但是是一种强效的诱导剂，通过几种机制诱导细胞介 导的免疫。病毒已经进化成表达能抵消干扰素的抗病毒效果的分泌型基 因产物。例如，痘苗病毒(以及其它痘病毒)编码分泌性蛋白B8R和B18R， 它们分别结合干扰素-γ和-α/-β(Smith等，1997；Symons等，1995； Alcami等，2000)。降低干扰素诱导的痘苗基因产物的一个另外的实例 是细胞凋亡蛋白酶(caspase-1)抑制剂B13R，其抑制干扰素-γ诱导 因子IL-8的激活。干扰素调节多肽包括但不限于B18R(其在其它病毒 株，例如痘苗病毒的Copenhagen株中可能称为B19R)、B8R、B13R、vC12L、 A53R、E3L以及具有相似活性或性质的其它病毒多肽。IFN调节多肽可以 分为优先调节IFNα和/或β途径的那些(例如，B18R、B8R、B13R或vC12L) 以及调节IFNγ途径的那些(B8R、B13R或vC12L)非排它的类。

癌细胞通常对干扰素的作用有抗性。涉及了许多机制。这些机制包 括ras信号转导途径激活(例如通过ras突变、上游生长因子受体过度 表达/突变等)，其为癌细胞的一个共同特征，导致PKR抑制。而且淋巴 细胞在肿瘤体中通常受肿瘤细胞通过多种机制，包括IL-10产生和fas-L 表达抑制。因为淋巴细胞是干扰素-γ产生的一个主要来源，淋巴细胞抑 制导致肿瘤中干扰素-γ产生的降低。因而，肿瘤体有点像是逃避干扰素 作用的避难所。而且，干扰素自身可以具有抗肿瘤效果。例如，IFN- γ可以增加I类MHC相关抗原递呈；这将使得能进行更有效的CTL-介导 的肿瘤细胞杀死。IFN-α/β，例如，可以阻断肿瘤体中的血管发生并因 而阻断肿瘤生长。

2.补体调控多肽

用于清除病毒病原体的一个主要机制是通过补体依赖性机制杀死 宿主内的受感染细胞或杀死生物体内病毒粒子。当受感染细胞死亡时， 其不能继续产生传染性病毒。而且，在凋亡过程中，释放细胞内的酶， 其降解DNA。这些酶可以导致病毒DNA降解和病毒失活。凋亡可以通过 许多机制(包括激活的补体的结合和攻击膜的补体复合物)诱导。痘病 毒例如痘苗病毒已经进化成表达能够抵销补体介导的病毒和/或病毒感 染的细胞的清除的基因产物。这些基因因此通过补体依赖性机制防止凋 亡和抑制病毒清除，因而使得病毒感染能进行并增加病毒毒力。例如， 痘苗病毒补体控制蛋白(VCP；例如C21L)在防止补体介导的细胞杀死 和/或病毒失活中起作用(Isaacs等，1992)。

VCP还具有抗炎性效果，因为它的表达降低白细胞浸润进病毒感染 的组织中。补体控制多肽包括(但不限于)VCP，其也称为C3L或C21L

癌细胞常常过度表达细胞抗-补体蛋白；这使得癌细胞能幸免于补 体攻击+/-肿瘤特异性抗体(Caragine等，2002；Durrant等，2001；Andoh 等，2002)。因而，由于肿瘤细胞内在的对补体介导的杀死的抗性而优 先攻击肿瘤细胞的试剂将在各种各样的人癌中具有选择性和强的效力 (Durrant等，2001)。而且，癌细胞的其中一个标志是正常的凋亡机 制的丧失(Gross等，1999)。对凋亡的抗性促进了致癌作用以及对抗 肿瘤剂，包括免疫剂、化学治疗剂和放射治疗剂的抗性(Eliopoulos等， 1995)。凋亡抑制可以通过丧失促凋亡分子功能、增加抗凋亡分子(例 如，bcl-2)的水平/功能以及最终丧失补体敏感性来介导。

3.TNF-调节多肽

用于清除病毒病原体的多种机制的其中一种是通过诱导凋亡(如上 面描述的)杀死宿主内的受感染细胞。凋亡可以通过多种机制，包括TNF 和淋巴毒素-α(LTα)结合至TNF受体上，这引发了细胞内的信号级联 反应。TNF受体的激活起调节免疫和炎性应答以及诱导凋亡性细胞死亡 的作用(Wallach等，1999)。

痘病毒的多种毒株，包括一些痘苗病毒株，已经进化成表达能够抵 销TNF-介导的病毒和/或病毒感染的细胞的清除的基因产物。由这些基 因编码的蛋白质通过结合并掩蔽胞外的TNF而阻止了TNF的促炎症反应 和凋亡诱导活性，导致病毒清除的抑制。由于病毒没有清除，使得病毒 感染继续，并因而增加了病毒毒力。痘病毒科的多个成员表达分泌性病 毒TNF受体(vTNFR)。例如，几种痘病毒编码vTNFR，例如粘液瘤(T2 蛋白)、牛痘和痘苗病毒株，例如Lister，可以编码CrmB、CrmC(A53R)、 CrmD、CrmE、B28R蛋白的一种或多种和/或其等价物。这些vTNFR在防 止TNF-介导的细胞杀死和/或病毒失活中起作用(Saraiva和Alcami， 2001)。TNF调节多肽包括(但不限于)A53R、B28R(这种蛋白质在痘 苗病毒的Copenhagen株中存在，但是可能是无活性的)及其它具有类似 活性或性质的多肽。

癌细胞的其中一个标志是异常的基因表达，其可以导致丧失对许多 用于生长调节的分子机制的敏感性，例如对TNF的抗癌活性的敏感性。 因而，病毒免疫调节机制可能不是病毒在肿瘤微环境内繁殖所需的。

4.丝氨酸蛋白酶抑制剂

用于病毒病原体清除的一个主要的机制是诱导宿主内的受感细胞 中的凋亡。当受感染细胞死亡时，其不能继续产生传染性病毒。而且， 在凋亡过程中，释放细胞内的酶，其降解DNA。这些酶可以导致病毒DNA 降解和病毒失活。

凋亡可以通过许多机制(包括细胞因子的结合(例如肿瘤坏死因 子)、由细胞毒性T-淋巴细胞产生粒酶或fas-配体结合)诱导；caspase 激活是最终的共有凋亡途径的一个关键部分。病毒已经进化而表达能抵 消由包括fas-配体或肿瘤坏死因子(TNF)/TNF-相关分子(例如，腺病 毒的E310.4/14.5，14.7基因(Wold等，1994)；腺病毒的E1B-19kD 蛋白(Boyd等，1994)；来自牛痘病毒的crmA；来自痘苗病毒的B13R) 诱导的细胞细胞内的信号级联反应的基因产物(Dobbelstein等，1996； Kettle等，1997)。这些基因产物防止由凋亡诱导分子引起的凋亡并因 而使得病毒复制能进行，尽管存在抗病毒的凋亡诱导细胞因子、fas、粒 酶或其它的凋亡刺激物。

VV SPI-2/B13R与牛痘CrmA高度同源；SPI-1(VV)与CrmA有弱的 同源性(Dobbelstein等，1996)。这些蛋白质是serpin(丝氨酸蛋白 酶抑制剂)并且CrmA和SPI-2两者都在防止多种形式的凋亡方面起作用。 白介素-1β-转化酶(ICE)和粒酶的抑制，例如，可以防止受感染细胞 的凋亡。这些基因产物也具有抗炎效果。它们能抑制IL-18的激活，其 随后又将降低IL-18-介导的IFN-γ的诱导。IFN-γ对细胞介导的免疫 的免疫刺激效果因而受到抑制(Kettle等，1997)。SPI包括(但不限 于)B13R、B22R和具有类似活性或性质的其它多肽。

癌细胞的其中一个标志是正常的凋亡机制的丧失(Gross等，1999)。 对凋亡的抗性促进癌形成以及对抗肿瘤剂(包括免疫剂、化学治疗剂和 放射治疗剂)的抗性(Eliopoulos等，1995)。凋亡抑制可以通过丧失 促凋亡分子功能(bax)或增加抗-凋亡分子(bcl-2)的水平/功能来介 导。

5.IL-1β-调节多肽

IL-1β是局部作用以及系统性作用的活性因子。仅描述了IL-1 β和IL-1α之间的几处功能性差别。IL-1β的许多生物活性通过许多 不同的缩写来说明，在这些缩写下IL-1得以描述。除了人IL-1β外(在 猪细胞中是无活性的)，IL-1不显示种属特异性。IL-1的一些生物活性 通过诱导其它介质，包括ACTH(促肾上腺皮质激素)、PGE2(前列腺 素E2)、PF4(血小板因子-4)、CSF(集落刺激因子)、IL-6和IL-8 来间接介导。IL-1的合成可以通过其它细胞因子，包括TNF-α、IFN- α、IFN-β和IFN-γ以及通过细菌内毒素、病毒、促分裂原(mitogen) 以及抗原诱导。IL-1的主要生物活性是刺激T-辅助细胞，其经诱导而分 泌IL-2以及表达IL-2受体。病毒感染的巨噬细胞产生大量的IL-1抑制 剂，其可以支持机会感染和具有T-细胞成熟缺陷的患者中的细胞的转化。 IL-1直接作用于B-细胞，促进它们的增殖和免疫球蛋白的合成。IL-1 也作为其中一种引发因子(priming factor)，使得B-细胞响应IL-5。 IL-1刺激NK-细胞和成纤维细胞、胸腺细胞、胶质母细胞瘤细胞的增殖 和激活。

通过病毒蛋白质阻断IL-1β的合成被认为是使得通过IL-1引发的 系统性抗病毒反应能受到抑制或减少的病毒策略。已经发现以与B15R类 似的活性有效地阻断IL-1的功能的结合蛋白也由牛痘病毒编码。痘苗病 毒也编码另一种蛋白质，称为B8R，其具有细胞因子的受体的性质(Alcami 和Smith，1992；Spriggs等，1992)。IL-1调节多肽包括(但不限于) B13R、B15R和具有类似活性或性质的其它多肽。

癌细胞的其中一个标志是异常的基因表达，其可以导致丧失对许多 用于生长调节的分子机制的敏感性，例如对IL-1的抗癌活性的敏感性。 因而，病毒免疫调节机制可能不是病毒在肿瘤微环境中繁殖所需要的。

6.EEV型

病毒散布至转移的肿瘤位点，以及甚至是在受感染的实体肿瘤体内 散布通常是效率低的(Heise等，1999)。静脉内施用通常导致抗体(例 如腺病毒)(Kay等，1997)和/或补体系统(例如HSV)引起的病毒清 除或失活(Dceda等，1999)。除了这些免疫介导的机制，这些病毒的 生物分布导致绝大多数的病毒存留在正常的组织内而不是肿瘤体内。静 脉内的腺病毒，例如，首先在肝脏和脾脏中终结；少于0.1％的输入病毒 存留在肿瘤内，甚至是在免疫缺陷的小鼠中(Heise等，1999)。因此， 尽管在免疫缺陷的小鼠肿瘤模型中使用非常高的相对剂量可以展示稍微 适度的抗肿瘤效力，静脉内递送是非常效率低的并且较大地限制了效力。 痘苗病毒具有在实体瘤中复制并引起坏死的能力。此外，胸苷激酶缺失 型突变体可以感染肿瘤体和卵巢组织并优先在小鼠肿瘤模型系统中表达 标记基因(Gnant等，1999)。然而，因为这些试验通常基于在＞5天后 的标记基因表达来检测肿瘤靶向，还未清楚该病毒是否优先在肿瘤/卵巢 组织中存留、表达基因或复制(Puhlmann等，2000)。不考虑机制，没 有额外转基因的这种病毒的抗肿瘤效力在统计上是不显著的(Gnant等， 1999)。相反，肿瘤内病毒注射具有显著的抗肿瘤效力(McCart等，2000)。 因而，如果静脉内递送至肿瘤得以提高，则静脉内效力可以提高。痘苗 病毒在细胞内复制并产生细胞内病毒(IMV，细胞内成熟病毒；IEV，细 胞内有包膜病毒)和细胞外病毒(EEV，细胞外有包膜病毒；CEV，细胞 相关的细胞外病毒)(Smith等，1998)。在野生型痘苗病毒株复制后， IMV占大约99％的病毒产量。这种病毒形式在环境中相对稳定，并因而其 主要负责在个体间传播；相反，由于从细胞释放的效率低以及对补体和/ 或抗体中和作用，这种病毒不在受感染的宿主内有效地传播。相比之下， EEV释放进细胞外环境并通常仅占大约1％的病毒产量(Smith等，1998)。 EEV负责病毒在受感染的宿主内传播并且在宿主外相对容易退化 (degraded)。重要地是，EEV已经发展了几种机制来抑制其在血流中 的中和作用。首先，EEV相对耐受补体(Vanderplasschen等，1998)； 这个性质是由于将补体的宿主细胞抑制物整合其外面的被膜中以及痘苗 病毒补体控制蛋白(VCP)分泌进局部的细胞外环境中。第二，与IMV比 较，EEV相对耐受中和性抗体作用(Smith等，1997)。EEV也比IMV(其 仅在细胞死亡期间/之后释放)在感染后更早的时间(例如4-6小时)， 并因而EEV形式的扩散更快(Blasco等，1993)。

然而，不幸地是，野生型痘苗株仅产生相对十分少量的EEV。而且， 迄今为止，用痘苗病毒处理(即病毒的输入剂量)局限于细胞内病毒形 式。标准痘苗病毒(W)生产和纯化步骤导致EEV失活(Smith等，1998)， 并且非人细胞系常常用于生产病毒；来自非人细胞的EEV形式将不受保 护免于补体介导的清除(由EEV从细胞获得的补体抑制蛋白具有种属限 制性作用)。痘苗病毒效力因而受限于IMV形式对中和作用的相对敏感 性以及其在实体肿瘤内低效的扩散；这种扩散通常是从细胞到邻近的细 胞。IMV通过血流或淋巴系统扩散至远处的肿瘤体也是效率低下的。

因而，这种稀少的EEV形式的痘苗病毒具有天然获得的特性，使得 其优于目前用于患者的痘苗病毒(IMV)；EEV经优化而快速且有效地局 部扩散至实体瘤以及扩散至区域性或原处的肿瘤位点。由于EEV相对耐 受补体作用，当其在来自相同物种的细胞类型中生长时，这些病毒形式 在血管内施用后将比标准的痘苗病毒制备物具有增强的稳定性并且在血 液中更久的保持活性。由于EEV耐受抗体介导的中和作用，这种病毒形 式在血管内施用后将比标准的痘苗病毒制备物(其几乎仅含有IMV)保 持更久的活性(Vanderplasschen等，1998)。一旦中和抗体水平已经 增加后，这些性质对重复施用将是特别重要的；所有批准的抗癌疗法需 要重复的施用。因而，EEV形式的牛痘以及其它的痘病毒，将导致良好 地递送治疗性病毒以及通过血流良好地递送它们的遗传负荷至肿瘤。与 标准的痘病毒制备物比较，这将导致增强的系统性效力。最后，转播至 公众个体的风险应该会显著减少，因为EEV在体外是相当不稳定的。涉 及调节EEV形式的病毒的多肽包括(但不限于)A34R、B5R以及多种影 响EEV形式的痘病毒产生的其它蛋白质。A34R的密码子151处从赖氨酸 突变成天冬氨酸(K151D突变)使得A34R蛋白束缚EEV形式至细胞膜的 能力较差。B5R是EEV膜结合多肽，其可以结合补体。A43R的全部缺失 可能导致EEV释放增加，但是显著地减少了病毒的传染性，而K151D突 变增加了EEV释放而保持释放的病毒的传染性。B5R与VCR(抗-补体) 具有序列同源性，但是补体抑制仍然未得到证实。简单地说，一种用于 鉴定强化的EEV形式的方法如下。将EEV稀释于冰冷的MEM中并与稀释 于冰冷的MEM活性的或热灭活的(56℃，30分钟，对照)血清混合(血 清的最终稀释度是1/10、1/20或1/30)。7℃下孵育75分钟后，将样 品在冰上冷却并将mAb 5B4/2F2加至新鲜的EEV样品以中和任何污染物 (IMV和破裂的EEV)。则在冰上让病毒粒子结合至RK13细胞1小时， 洗掉补体和未结合的病毒粒子，并在两个小时后计数噬斑的数目。噬斑 数目越高，对补体的耐受力就大。Vanderplasschen等，(1998)，将其 通过引入作为参考。描述分离EEV形式的痘苗病毒的示例性方法可以在 Blasco等，(1992)(在此通过引入作为参考)中找到。7.其它多 肽

其它的病毒免疫调节多肽可以包括结合免疫应答的其它介质和/或 调节与免疫应答相关的分子途径的多肽。例如，趋化因子结合多肽例如 B29R(这种在痘苗病毒的Copenhagen株中存在但是可能是失活的)、 C23L、vCKBP、A41L以及具有类似活性或性质的多肽。其它痘苗病毒例 如痘苗病毒生长因子(例如C11L)，其为一种类似病毒EGF的生长因子， 也可以是本发明的一些实施方案中用于改变的靶标。其它可以分类为病 毒调节因子的多肽包括(但不限于)B7R、N1L或其活性或性质增加痘病 毒毒力的其它多肽。

8.痘苗病毒-诱导的细胞融合

在本发明的某些实施方案中，编码A56R或K2L的核酸基因的改变、 缺失或突变可以导致由VV感染诱导的细胞融合或合胞体形成。痘苗病毒 诱导的细胞融合将通常增加由于肿瘤内的病毒扩散产生的VV的抗肿瘤 效力。通过细胞融合的肿瘤内的病毒扩散将通常使得病毒能避免中和抗 体和免疫应答。在这些基因的一个或两个中具有突变的VV中，邻近的未 受感染的细胞的杀死和感染(即“旁观者”效应)可能更有效，这可能 导致提高的局部抗肿瘤效果。

B.病毒繁殖

痘苗病毒可以用由Earl和Moss(Ausbel等，Current Protocols in Molecular Biology，16.15.1-16.18.10)中描述的方法繁殖，将该文献 通过引入作为参考。

III.蛋白质和核酸组分

本发明涉及在研究和治疗患者中的癌细胞和癌中有优势的痘病毒。 其涉及痘苗病毒，与野生型比较其任选具有一种或多种突变，这样所述 的病毒具有理想的性质以用于对抗癌细胞，而对非癌细胞具有较小毒性 或无毒性。这种痘病毒在PCT/US2003/025141中描述，将其引入作为参 考。举例来说，下面描述的教授提供了实现本发明的方法和组合物的多 种方案。它们提供了通过使用重组DNA技术来产生突变病毒的背景。

A.蛋白质组合物

在一些实施方案中，本发明涉及产生痘苗病毒(任选缺少一种或多 种功能性多肽或蛋白质的那些)和/或产生具有释放更多特殊的病毒形式 (例如传染性EEV型)的痘病毒。在其它的实施方案中，本发明涉及痘 病毒和它们联合蛋白质组合物作为部分可药用制剂的用途。

如此处使用的，“蛋白质”或“多肽”指含有至少一个氨基酸残基 的分子。在一些实施方案中，采用了野生型蛋白质或多肽，而在本发明 的许多实施方案中，病毒或多肽缺失或受到改变以便使得该病毒更能用 于治疗患者中的癌细胞或癌。上面描述的术语在此可以交换使用。“经 修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”指其化学结构相对于野生型的蛋白 质或多肽而受到改变的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，受修饰的蛋 白质或多肽具有至少一种受修饰的活性或功能(认为蛋白质或多肽可能 具有多种活性)。受修饰的活性或功能可以相对于野生型蛋白质或多肽 中的活性或功能而受到减少、减轻、消除、增强、提高或以一些其它方 式改变(例如特异性)。特别是考虑经修饰的蛋白质或多肽可以关于一 种活性或功能受到改变，但仍在其它方面保持野生型活性或功能。备选 地，经修饰的蛋白质可以是完全没有功能的或其相关核酸序列可以已经 受到改变以至该多肽根本不再表达、受到截短或由于移码而表达不同的 氨基酸序列。

在某些实施方案中，突变的蛋白质或多肽的大小包括(但不限于) 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、 70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、 250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、 575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、 900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、 2000、2250、2500或更多的氨基分子残基以及可源于其中的任何范围。 考虑多肽可以通过截短而进行突变，使得它们比它们相应的野生型短。

如此处使用的，“氨基分子”指本领域一般技术人员所知的氨基酸、 氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质分子的残基 是连续的，没有任何非氨基分子打断氨基分子残基的序列。在其它实施 方案中，序列可以包含一个或多个非氨基分子部分。在特别的实施方案 中，蛋白质分子的残基序列可以为一个或多个非氨基分子部分打断。

因此，术语“蛋白质组合物”包含含有至少一种天然合成的蛋白质 中的20种普通氨基酸或至少一种经修饰的或罕见氨基酸的氨基分子序 列。

蛋白质组合物可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生，包括 通过标准的分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽、从天然来源分离蛋 白质化合物或化学合成蛋白质物质。先前已经公开了多种基因的核苷酸 和蛋白质、多肽和肽序列，并且可以在本领域一般技术人员所知的计算 机化数据库中找到。一个这样的数据库是National Center for Biotechnology Informationt′s GenBank and GenPept databases (www.ncbi.nlm.nih.gov)。这些已知基因的编码区可用在此公开的技 术或本领域一般技术人员应该已知的技术扩增和/或表达。

1.功能方面

当本申请案涉及病毒蛋白质或多肽的功能或活性时，其意在指那种 病毒蛋白质或多肽在生理条件下的活性或功能，除非另有说明。例如， 干扰素调节多肽指直接或间接影响至少一种干扰素及其活性的多肽。该 多肽可以直接或间接诱导、增强、提高、增加、减小、减弱、减少、抑 制或掩蔽干扰素的活性。在一些实施方案中，直接影响干扰素的一个实 例涉及特异性结合干扰素的干扰素调节多肽。检测哪种分子具有这种活 性可以用本领域技术人员熟悉的测定法完成。例如，转移编码调节干扰 素的产物的基因或其变体进诱导干扰素活性的细胞中(与具有这种基因 转移的细胞比较)可以利用不同水平的干扰素响应而鉴定具有干扰素调 节功能的那些分子。

特别是考虑，介质是一种影响涉及靶标分子的途径的表达蛋白质组 合物的分子，例如通过结合编码干扰素的转录物。测定哪种分子是干扰 素、IL-1β、TNF或其它有治疗好处的分子的合适调节剂可以用本领域 所熟悉的测定法完成(在此公开了其中一些)并且可以包括例如，天然 的和/或重组的病毒蛋白质的使用。

2.病毒多肽的变体

本发明多肽的氨基酸序列变体可以是取代、插入或缺失变体。与野 生型比较，编码病毒多肽的基因中的突变可以影响该多肽的1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、 70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、 250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多非- 连续的或连续的氨基酸。多种由痘苗病毒编码的多肽可以通过参考Rosel 等，(1986)，Goebel等，(1990)和GenBank登记号NC_001559(将它们 每个通过引入作为参考)而鉴定。

缺失型突变体缺少天然或野生型蛋白质的一个或多个残基可以删 除独立的残基或可以删除结构域(例如催化或结合结构域)的全部或部 分。可以引入(通过取代或插入)终止密码子进编码核酸序列以产生截 短的蛋白质。插入突变体通常涉及在该多肽的非末端点加入物质。这可 以包括插入免疫反应性表位或仅一个或多个残基。也可以产生末端加入， 称为融合蛋白。

取代突变体通常包括在该蛋白质内的一个或多个位点一个氨基酸 交换为另一氨基酸，并且可以设计来调节多肽的一种或多种性质，丧失 或不丧失其它功能或性质。取代可以使保守性的，即，一个氨基酸用其 中一种类似形状和电荷的氨基酸取代。保守性取代是本领域所熟知的并 且包括，例如：丙氨酸变成丝氨酸；精氨酸变成赖氨酸；天冬酰胺变成 谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变成谷氨酸；半光氨酸病床丝氨酸；谷氨 酰胺变成天冬酰胺；谷氨酸变成天冬氨酸；甘氨酸变成脯氨酸；组氨酸 变成天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变成亮氨酸或脯氨酸；亮氨酸变成 缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变成精氨酸；甲硫氨酸变成亮氨酸或异亮氨 酸；苯丙氨酸变成酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变成苏氨酸；苏 氨酸变成丝氨酸；色氨酸变成酪氨酸；酪氨酸变成色氨酸或苯丙氨酸； 以及缬氨酸变成异亮氨酸或亮氨酸。备选地，取代可以是非保守性的， 这样多肽的功能或活性受到影响。非保守性改变通常涉及用化学上不相 似的残基取代该残基，例如用极性或带电荷的氨基酸取代非极性或不带 电荷的氨基酸，反之亦然。

术语“功能等价的密码子”在此用于指编码相同氨基酸的密码子， 例如用于精氨酸或丝氨酸的6种密码子，并且还指编码生物学上等价的 氨基酸的密码子(见下面的表1)。

还应该理解，氨基酸和核酸序列可以包括额外的残基，例如额外的 N-或C-末端氨基酸或5′或3′序列，并仍然基本上是如在此公开的其中 一个序列中列出的，只要该序列符合上面列出的标准，包括在蛋白质表 达涉及的地方保持蛋白质的生物学活性。末端序列的加入特别是应用到 可以例如，包括编码区的5’或3’部分旁侧的多种非-编码序列或可以 包括多种内部序列，即内含子(其已知在基因中出现)的核酸序列。

表1：密码子表

  氨基酸   密码子   丙氨酸   Ala   A   GCA  GCC  GCG  GCU   半胱氨酸   Cys   C   UGC UGU   天冬氨酸   Asp   D   GAC GAU   谷氨酸   Glu   E   GAA GAG   苯丙氨酸   Phe   F   UUC UUU   甘氨酸   Gly   G   GGA GGC  GGG GGU   组氨酸   His   H   CAC CAU   异亮氨酸   Ile   I   AUA AUC AUU   赖氨酸   Lys   K   AAA AAG   亮氨酸   Leu   L   UUA  UUG  CUA CUC CUG  CUU   甲硫氨酸   Met   M   AUG   天冬酰胺   Asn   N   AAC AAU   脯氨酸   Pro   P   CCA CCC  CCG  CCU   谷氨酰胺   Gln   Q   CAA CAG   精氨酸   Arg   R   AGA AGG  CGA  CGC CGG CGU   丝氨酸   Ser   S   AGC AGU UCA  UCC UCG  UCU   苏氨酸   Thr   T   ACA ACC ACG  ACU   缬氨酸   Val   V   GUA GUC GUG GUU   色氨酸   Trp   W   UGG   酪氨酸   Tyr   Y   UAC UAU

下面是基于改变蛋白质的氨基酸来产生等价的或甚至是改良 的、第二代分子的讨论。例如，在蛋白质结构中某些氨基酸可以取代为 另一氨基酸而没有明显丧失与结构例如抗体的抗原结合区或底物分子上 的结合位点的相互结合能力。因为是蛋白质的相互作用能力和性质决定 了蛋白质的生物功能活性，可以在蛋白质序列中以及在其DNA编码序列 中进行某些氨基酸取代，并仍然产生具有类似性质的蛋白质。因而本发 明人考虑可以在基因的DNA序列中作多种改变而不明显丧失它们的生物 学效用或活性，如下面讨论的。表1显示了编码特定氨基酸的密码子。

在产生这种改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质上的相互作用生物学功能中的 重要性通常是本领域所理解的(Kyte和Doolittle，1982)。人们认为 氨基酸的相对亲水性质有助于得到的蛋白质的二级结构，而二级结构又 确定了蛋白质与其它分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的 相互作用。

本领域还认识到，可以基于亲水性而有效地进行类似氨基酸的取 代。美国专利4,554,101(通过引入作为参考)声称由相邻的氨基酸的 亲水性决定的蛋白质最大的局部平均亲水性与该蛋白质的生物性质相 关。如美国专利4,554,101中详细描述的，将下面的亲水性值赋给氨基 酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨 酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘 氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸 (-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸 (-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸 (-3.4)。

应该理解，一个氨基酸可以置换为另一个具有类似亲水性值的氨基 酸并仍然产生生物学上等价且免疫学上等价的蛋白质。在这样的改变中， 优选置换亲水性值为±2的氨基酸，亲水性值在±1内的那些氨基酸是特 别优选的，并且亲水性值在±0.5内的那些是更特别优选的。

如上面概述的，氨基酸置换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对类 似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑多种前述性 质的示例性置换是本领域技术人员所熟知的并且包括：精氨酸和赖氨 酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

IV.核酸分子

A.编码天然蛋白质或经修饰的蛋白质的多核苷酸

本发明涉及能表达蛋白质或多肽的全部或部分的可从细胞分离的 多核苷酸。在本发明的一些实施方案中，考虑已经经特异性突变的病毒 基因组以产生缺少某些功能性病毒多肽的病毒。该多肽可以编码含有全 部或部分病毒氨基酸序列，或者可以改造它们而使得它们不编码这种病 毒多肽或编码至少一种功能或活性减少、减小或缺少的病毒多肽。重组 蛋白质可以从表达细胞纯化而产生活性蛋白质。痘苗病毒的基因组以及 编码区的定义可以在Rosel等，(1986)、Goebel等，(1990)和/或 GenBank登记号NC_00159找到，将它们每个通过引入作为参考。

如此处使用的，术语“DNA片段”指已经分离无特殊物种的总基因 组DNA的DNA分子。因而，编码多肽的DNA片段指含有野生型、多态性 或突变的多肽编码序列包括在术语“DNA片段”内的是一种多肽或多种 多肽、比多肽小的DNA片段以及重组载体，包括例如，质粒、粘粒、噬 菌体、病毒等。

如本申请案中使用的，术语“痘病毒多核苷酸”指已经从总基因组 核酸分离的编码痘病毒多肽的核酸分子。类似地，“痘苗病毒多核苷酸” 指已经从总基因组核酸分离的编码痘苗病毒多肽的核酸分子。“痘病毒 基因组”或“痘苗病毒基因组”指可以提供给宿主细胞以在存在或不存 在辅助病毒时产生病毒颗粒的核酸分子。与野生型病毒比较，基因组可 以或可以不经重组突变。

术语“cDNA”意在指用信使RNA(mRNA)作为模板制备的DNA。与 使用基因组DNA或从基因组的、不经加工或经部分加工的RNA模板聚合 而来的DNA比较，使用cDNA的优势是cDNA主要含有对应蛋白质的编码 序列。当优选全部或部分基因组序列时，序列可能要加倍，例如其中需 要非编码区用于优化表达或其中非编码区例如内含子在反义策略中要用 来靶向。

还考虑来自给定物种的特殊多肽可以由具有稍微不同但是编码相 同的蛋白质(参见上面的表1)的核酸序列的天然变体表达。

类似地，含有分离的或纯化的野生型或突变的多肽基因的多核苷酸 指包含野生型或突变的多肽编码序列的DNA片段，以及在某些方面，包 含调节序列，其基本上与其它天然出现的基因或蛋白质编码序列分离。 在这方面，为简单起见将术语“基因”用于指功能性蛋白质、多肽或肽 编码单元(包括正常转录、转录后修饰或定位所需的任意序列)。本领 域技术人员将理解，这个功能性术语(functional term)包括基因组序 列、cDNA序列以及更小的改造的基因片段，其表达或可以适合于表达蛋 白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白以及突变体。编码天然的或经修饰 的多肽的全部或部分的核酸可以含有下列长度的编码这种多肽的一部分 的连续核酸序列：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、 250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、 380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、 500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、 630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、 760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、 890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、 1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、 2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、 7500、8000、9000、10000或更多核苷酸、核苷或碱基对。

在特殊的实施方案中，本发明涉及分离的DNA片段和整合了DNA序 列的重组载体，该DNA片段或重组载体编码野生型或突变的疸病毒多肽 或肽，所述的多肽或肽在其氨基酸序列中包括了根据或基本对应天然多 肽的连续氨基酸序列。因而，分离的DNA片段或含有DNA片段的载体可 以编码例如，可以抑制或减少TNF活性的TNF调节剂或TNF调节多肽。 术语“重组”可以与多肽或特定多肽的名称一道使用，并且这通常指从 已经在体外进行了操作核酸分子产生的多肽或者从这种经体外操作的分 子的复制产物的产生的多肽。

在其它实施方案中，本发明涉及分离的DNA片段和整合了DNA序列 的重组载体，该DNA片段或重组载体编码在其氨基酸序列中包括了根据 或基本对应该多肽的连续氨基酸序列的多肽或肽。

用于本发明中的核酸片段，不管该编码序列自身的长度，可以与其 它核酸序列，例如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制性内切酶位点、 多克隆位点、其它编码片段等结合，这样它们的总体长度可以相当不同。 因而考虑可以采用几乎任何长度的核酸片段，总的长度优选通过易于在 预期的重组DNA方法中的制备和使用来限制。

考虑本发明的核酸构建体可以编码来自任何来源的全长多肽或编 码截短的所述多肽，例如截短的痘苗病毒多肽，这样该编码区的转录物 代表了该截短型。截短的转录物则可以翻译成截短的蛋白质。备选地， 核酸序列可以编码具有额外的异源编码序列的全长多肽序列，例如，以 允许该多肽的纯化、运输、分泌、翻译后修饰或用于治疗性利益，例如 靶向或效力。如上面讨论的，可以将标签或其它异源多肽加至经修饰的 多肽编码序列，其中“异源”指与该经修饰的多肽不同的多肽。

在一个非限制性实例中，可以制备一种或多种核酸构建体，其包括 与特殊基因，例如B18R基因相同或互补的连续的一段核苷酸。核酸构建 体可以是至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、 140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、 800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、 9,000、10,000、15,000、20,000、30,000、50,000、100,000、250,000、 500,000、750,000至至少1,000,000个核苷酸的长度，以及更大的、高 达并且包括染色体大小(包括所有中间长度和中间范围)的构建体，只 要核酸构建体例如酵母人工染色体是本领域技术人员所知的。很容易理 解，如此处使用的“中间长度”和“中间范围”表示包括列出的值或列 出的值之间(即包括这些值或这些值之间的所有整数)的任何长度或范 围。

用于本发明的DNA片段包含生物学功能等价的经修饰的多肽或肽， 例如经修饰的gelonin毒素。这种序列可以由于密码子冗余和已知在核 酸序列以及在因而编码的蛋白质中天然出现的功能等价性而产生。备选 地，功能等价的蛋白质或肽可以通过应用重组DNA技术产生，在该技术 中可以基于考虑要交换的氨基酸的性质而设计蛋白质结构中的改变。由 人设计的改变可以通过应用定点诱变技术引入，例如引入对蛋白质抗原 性的改良、减少蛋白质对接受该蛋白质的受试者的体内毒性效果或增加 涉及该蛋白的任何治疗的效力。

在某些其它实施方案中，本发明涉及分离的DNA片段和重组载体， 该DNA片段和重组载体在它们的序列中包含了来自在此鉴定的序列(和/ 或通过引入作为参考)中显示的序列的连续核酸序列。然而，可以突变 这种序列以产生其活性相对于野生型改变的蛋白质产物。

还应该理解，本发明不限于这些鉴定的序列的特殊核酸和氨基酸序 列。重组载体和分离的DNA片段因而可以不同地包括痘病毒编码区本身、 在基本的编码区中具有选择的改变或修饰的编码区，或者它们可以编码 仍然包括痘苗编码区的更大的多肽或可以编码具有变体氨基酸序列的生 物学功能等价的蛋白质或肽。

本发明的DNA片段包含在生物学上功能等价的痘苗病毒蛋白质和 肽。这种序列可以由于密码子冗余和已知在核酸序列以及在因而编码的 蛋白质中天然出现的功能等价性而产生。备选地，功能等价的蛋白质或 肽可以通过应用重组DNA技术产生，在该技术中可以基于考虑要交换的 氨基酸的性质而设计蛋白质结构中的改变。由人设计的改变可以通过应 用定点诱变技术引入，例如引入对蛋白质的抗原性的改良。

B.痘苗病毒多核苷酸的诱变

在多个实施方案中，可以改变或诱变痘病毒多核苷酸。改变或突变 可以包括插入、缺失、点突变、倒位等并且可以导致某些途径或分子机 制的调节、激活和/或失活，以及改变基因产物的功能、定位或表达，特 别是是基于产物无功能。在采用时，编码痘病毒的全部或部分的多核苷 酸的诱变可以通过许多标准的诱变方法(Sambrook等，1989)完成。突 变是借此生物体的量或结构发生改变的过程。突变可以涉及单个基因、 基因段或整个染色体的核苷酸序列的修饰。单个基因的改变可以通过点 突变完成，点突变涉及DNA序列内单个核苷酸碱基的除去、加入或置换， 或它们可以通过涉及大量核苷酸的插入或缺失的改变完成。

突变可以在曝露于化学或物理诱变剂后诱导。这种突变-诱导剂包 括电离放射、紫外光和一系列化学剂例如烷化剂和多环芳烃，它们都能 直接或间接(通常是在一些代谢生物转化后)与核酸相互作用。由这些 因子诱导的DNA损伤可以在受影响的DNA复制或修复时导致碱基序列的 修饰并因而导致突变。突变还可以通过使用特殊的靶向方法进行的定点 突变。

1.随机诱变

a.插入诱变

插入诱变是基于通过插入已知的DNA片段使基因失活。由于其涉及 插入某种类型的DNA片段，产生的突变通常是功能丧失型 (loss-of-function)，而不是功能获得型(gain-of-function)突变。 然而，也存在几个产生了功能获得型突变的插入的实例插入诱变在细菌 和果蝇中已经十分成功(Cooley等，1988)并且最近已经成为玉米(拟 南芥；(Marks等，1991；Koncz等，1990)；和金鱼草(Sommer等，1990) 中的一个有力的工具。插入诱变可以用标准的分子生物学技术完成。

b.化学诱变

化学诱变提供了某些优势，例如发现各种各样的具有不同表型严重 性程度的突变的能力以及执行容易且便宜。大部分化学致癌物在DNA中 产生突变。苯并芘、N-乙酰氧基乙酰氨基芴和黄曲霉素B1引起细菌和哺 乳动物细胞中的GC至TA的颠换。苯并芘也可以产生碱基替换，例如AT 替换成TA。N-亚硝基化合物产生GCAT的转换。由曝露于N-亚硝基脲诱 导的胸腺嘧啶的O4位置的烷基化导致TA转换为CG。

c.辐射诱变

生物分子通过电离辐射而退化。吸收入射能力导致离子和自由基的 形成以及一些共价键的破坏。对辐射损伤的易感性在分子之间，以及在 相同分子的不同晶体形式直接表现出相当的可变性。这取决于总的累积 剂量，以及取决于剂量率(因为一旦存在自由基，它们引起的分子损伤 取决于它们的自然扩散速率并因而取决于实际时间)。通过使样品尽可 能冷来减少和控制损伤。电离辐射引起DNA损伤，通常与剂量率成比例。

在本发明中，术语“电离辐射”表示包括粒子或光子的辐射，所述 粒子或光子具有足够的能量或可以产生足够的能量来产生电离(得到或 失去电子)。一种示例性的且优选的电离辐射是X-线辐射。给定细胞所 需要的或用于特殊分子的电离辐射的量通常取决于那种细胞或分子的性 质以及突变靶标的性质。用于确定辐射的有效量的手段是本领域熟知的。

d.体外扫描诱变

随机诱变也可以用易错PCR引入。诱变率可以通过在具有模板稀释 物的多个试管内执行PCR来增加。

一种特别有用的诱变技术是丙氨酸扫描突变，在该方法中将许多残 基单独地用氨基酸丙氨酸置换，这样可以测定丧失侧链相互作用的效果， 而使构象的大规模干扰最小化(Cunningham等，1989)。

体外扫描饱和诱变提供了一种用于获得大量结构功能信息的快速 方法，该方法包括(i)鉴定调节配体结合特异性的残基，(ii)基于在 给定位置处保持活性的那些氨基酸和消失活性的那些氨基酸来更好地理 解配体结合，(iii)评价活性位点或蛋白质亚结构域的整体塑性，(iv) 鉴定导致增加结合的氨基酸置换。

2.定点诱变

结构引导的定点诱变展示了一种用于分解和改造蛋白质-配体相互 作用的有利工具(Wells，1996；Braisted等，1996)。该技术提供了 序列变体的制备和测试，其通过引入一种或多种核苷酸序列改变至选择 的DNA中。

定点诱变使用编码具有期望突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列， 以及足够数目的邻近的、未经修饰的核苷酸。以这种方式，提供了具有 足够大小和复杂性的引物序列来在被横过的缺失接头两端形成双链。优 选大约17-25核苷酸长度的引物，在受改变序列的接头两端都具有大约 5-10个残基。

该技术通常采用以单链和双链两种形式存在的噬菌体载体。可用于 定点诱变的载体包括载体如M13噬菌体。这些噬菌体载体是可商业获得 的，并且它们的用途是本领域技术人员所熟知的。双链质粒也是在定点 诱变中常规采用的，其减少了将目标基因从噬菌体转移至质粒的步骤。

通常，人们首先获得单链载体，或使双链载体的两条链解链，所述 的单链在其序列中包含编码期望蛋白质或遗传元件的DNA序列。然后将 合成制备的携带突变序列的寡核苷酸引物与该单链DNA制备物退火，在 选择杂交条件时考虑错配度。让杂交的产物接受DNA聚合酶例如大肠杆 菌聚合酶I(Klenow片段)的作用以便完成带有突变的链。因而，形成 了异源双链，其中一条链编码原来的非突变序列，而第二条链携带期望 的突变。然后将这种异源双链用于转化合适的宿主细胞，例如大肠杆菌 细胞，并选择包括携带突变序列的重组载体。

关于功能重要性和蛋白质给定残基的信息量的综合信息可最好通 过其中总共试验19个氨基酸置换的饱和突变来获得。这种方法的缺点是 多残基饱和诱变的逻辑是令人望而生畏(Warren等，1996，Zeng等， 1996；Burton and Barbas，1994；Yelton等，1995；Hilton等，1996)。 必须研究成百上千，并且甚至可能是成千上万个定点突变。然而，改良 的技术使得突变的产生和快速筛选更加直接。也参见美国专利5,798,208 和5,830,650，其描述了“Look-Through”诱变。其它的定点诱变方法 在美国专利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,366,878；5,389,514； 5,635,377和5,789,166中公开。

C.载体

术语“载体”用于指用于引入细胞的可以将外源核酸序列插入其中 的载体核酸分子，在细胞中载体可以复制。核酸序列可以是“外源的”， 其意味着其对载体要引入其中的细胞来说是外来的或该序列与细胞中的 序列同源，但是在宿主细胞核酸内处于不常发现该序列的位置。载体包 括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(YAC)。 本领域技术人员将有能力通过标准的重组技术构建载体，这些技术在 Sambrook等，(1989)和Ausubel等，(1994)中描述，将这两篇文献都通 过引入作为参考。除了编码经修饰的多肽例如经修饰的白树毒素，载体 可以编码补经修饰的多肽序列，例如标签或靶向分子。编码这种融合蛋 白的有用载体包括pIN载体(hiouye等，1985)，其为编码一段组氨酸 的载体，和pGEX载体，其用于产生谷胱甘肽-S-转移酶(GST)可溶性融 合蛋白用于后面的纯化和分离或裂解。靶向分子是引导经修饰的多肽至 受试者身体的特殊器官、组织、细胞或其它位置的分子。

术语“表达载体”指含有编码至少部分能转录的基因产物的核酸序 列的载体。在一些情形中，RNA分子则翻译成蛋白质、多肽或肽。在其 它情形中，这些序列不翻译，例如在反义分子或核酶的产生中。表达载 体可以含有许多“控制序列”，控制序列指在特殊的宿主生物体中有效 连接的编码序列的转录以及可能的翻译所必须的核酸序列。除了，控制 转录和翻译的控制序列，载体和表达载体还可以含有发挥其它功能的核 酸序列并在下文中描述。

根据本发明，痘苗病毒本身是表达载体。存在也可以用于改造本发 明的痘苗病毒的其它病毒和非病毒载体。在一个实施方案中，这种载体 可以经改造而表达GM-CSF。

1.启动子和增强子

“启动子”是一种控制序列，其为核酸序列的一个区域，在该区域 转录的起始和速率受到控制。其可能含有调节蛋白和分子，例如RNA聚 合酶和其它转录因子可以结合的遗传元件。短语“有效定位的”、“有 效连接的”、“受到控制的”以及“受到转录控制的”表示关于一条核 酸序列启动子处于正确的功能性位置和/或取向以控制该序列的转录起 始和/或表达。启动子可以和或可以不和“增强子”协同使用，增强子指 涉及核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。

启动子可以是天然与基因或序列关联的启动子，这可以通过分离位 于编码序列和/或外显子上游的5’非编码序列获得。这种启动子可以称 为“内源性的”。类似地，增强子可以是天然与核酸序列关联的，位于 该序列的上游或下游。备选地，通过使编码核酸序列定位于重组或异源 启动子的控制下将获得某些优势，重组或异源启动子是指在其天然环境 中通常不与核酸序列相关联的启动子。重组或异源增强子也指在其天然 环境中通常不与核酸序列相关的增强子。这种启动子或增强子可以包括 其它基因的启动子或增强子，以及从任意其它原核、病毒或真核细胞分 离的启动子或增强子，以及不是“天然出现的”启动子或增强子，即含 有不同转录调控区的不同元件和/或改变表达的突变。除了合成产生启动 子和增强子的核酸序列，序列还可以用重组克隆和/或核酸分子扩增技 术，包括PCR，连同在此公开的组合物(参见美国专利4,683,202、美 国专利5,928,906，将每篇通过引入作为参考)来产生。此外，考虑也 可以采用控制序列，该控制序列引导序列在非核细胞器例如线粒体、叶 绿体等内转录和/或表达。自然，采用有效引导DNA片段在选择用于表 达的细胞类型、细胞器和生物体中表达的启动子和/或增强子应该是重要 的。在本发明的某些实施方案中，启动子是在痘苗病毒复制周期中激活 的痘苗病毒启动子。特别是，启动子可以使痘苗病毒晚期启动子-在晚期 启动子控制下的表达使表达限于复制周期的晚期，导致增强的癌选择性 (由于晚期基因表达在正常组织中应该最少或不存在)。基因表达也可 以处于合成的早期-晚期启动子控制以使基因表达的持续时间和水平最 大化。Mastrangelo等，1999，将其通过引入作为参考。分子生物学技 术人员通常知道启动子、增强子和细胞类型组合用于表达的用途，例如， 参见Sambrook等，(1989)，将其通过引入作为参考。采用的启动字可以 在引导引入的DNA片段高水平表达的合适条件下是组成型的、组织特异 性的、可诱导的和/或有用的，例如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中 是有利的。启动子可以是异源性的或内源性的。特殊的启动子是在细胞 质中可以是有活性的那些，因为病毒在细胞质内复制。

表2列出了可以在本发明的某些实施方案的内容中采用来调控基因 表达的几种元件/启动子。该名单无意于穷尽所有涉及促进表达的可能元 件，而仅仅是举例说明。表3提供了可诱导元件的实例，其为可以响应 特定刺激而激活的核酸序列的区域。

表3

组织特异启动子或元件的鉴定以及用于表征它们的活性的方法是 本领域技术人员所熟知的。这些区域的实例包括人LIMK2基因(Nomoto 等，1999)、生长抑素受体2基因(Kraus等，1998)、鼠附睾视黄酸结 合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、小鼠 α2(XI)型胶原(Tsumaki等，1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee等， 1997)、胰岛素样生长激素-II(Wu等，1997)、人血小板-内皮细胞粘 附分子-1(Almendro等，1996)和SM22α启动子。

也在本发明中认为有用的是dectin-1和dectin-2启动子。可以与 本发明组合使用的其它病毒启动子、细胞启动子/增强子和可诱导启动子 /增强子在表2和3中列出。此外，任何启动子/增强子组合(按照真核 启动子数据库EPDB)也可以用于驱动编码寡糖加工酶、蛋白质折叠辅助 蛋白、可选标记蛋白或目标异源蛋白的结构基因的表达。备选地，用于 癌基因治疗(表4)或肿瘤靶向(表5)的组织特异性启动子可以用于本 发明的核酸分子。

表4：用于癌基因治疗的候选组织特异性启动子

  组织特异性启动子   启动子在其中有活性的癌   启动子在其中有活性的正常细胞   癌胚抗原(CEA)*   大多数结肠直肠癌；50％的肺癌；   40-50％的胃癌；大多数胰腺癌；许   多乳癌   结肠粘膜；胃粘膜；肺上皮；外泌汗   腺；睾丸中的细胞   前列腺特异性抗原(PSA)   大多数前列腺癌   前列腺癌上皮   血管活性肠肽(VIP)   大多数非小细胞肺癌   神经元；淋巴细胞；肥大细胞；嗜酸   粒细胞   表面活性蛋白A(SP-A)   许多肺腺癌细胞   II型肺细胞；克拉拉细胞   人achaete-scute同系物   (hASH)   大多数小细胞肺癌   肺中的神经内分泌细胞   粘蛋白-1(MUC1)**   大多数腺癌(源于任何组织)   乳房以及呼吸道、胃肠道和生殖泌尿   道中的腺上皮细胞   α-胎儿球蛋白   大多数肝细胞癌；可能许多睾丸癌   肝细胞(在某些情况下)；睾丸   白蛋白   大多数肝细胞癌   肝细胞

  酪氨酸酶  大多数黑素瘤   黑素细胞；星形细胞；施旺细胞；-   些神经元   酪氨酸结合蛋白(TRP)  大多数黑素瘤   黑素细胞；星形细胞；施旺细胞；-   些神经元   角蛋白14  大概许多鳞状细胞癌(例如，头颈  癌)   角质化细胞   EBV LD-2  头和颈的许多鳞状细胞癌   上消化道的上层消化性角质细胞的   角质细胞   胶质纤维酸性蛋白(GFAP)  许多星形细胞瘤   星形细胞   髓磷脂碱蛋白(MBP)  许多神经胶质瘤   少突胶质细胞   睾丸-特异性血管紧张素   转化酶(睾丸-特异性   ACE)  可能许多睾丸癌   精子   骨钙素  可能许多骨肉瘤   成骨细胞

表5：用于肿瘤组织特异性靶向的候选启动子

  启动子   启动子在其中有活性的癌  启动子在其中有活性的正常细胞   E2F-调控   启动子   几乎所有癌  增生性细胞   HLA-G   许多结肠直肠癌；许多黑素瘤；可能大多   数的其它癌  淋巴细胞；单核细胞；精母细胞；滋养层   FasL   大多数黑素瘤；许多胰腺癌；大多数星形   细胞瘤；可能大多数的其它癌  活化的白细胞；神经元；内皮细胞；角质化  细胞；免疫豁免组织中的细胞；肺、卵巢、  肝脏和前列腺中的一些细胞   Myc-调控   启动子   大多数肺癌(小细胞和非小细胞型两者)；   大多数结肠直肠癌  增生性细胞(仅一些细胞类型)：乳房上皮细  胞(包括非增生性细胞)   MAGE-1   许多黑素瘤；一些非小细胞肺癌；一些乳   癌  睾丸   VEGF   70％的所有癌(在许多癌中组成型过度表   达)  新血管形成部位的细胞((但是不像在肿瘤  中，表达是暂时的、较弱并且不是组成型的)

  bFGF   可能许多不同的癌，因为bFGF表达由缺血   状况诱导  缺血部位的细胞(但不像在肿瘤中，表达是  暂时的、较弱并且不是组成型的)   COX-2   大多数结肠直肠癌；许多肺癌；可能许多   的其它癌  炎症部位的细胞   IL-10   大多数结肠直肠癌；许多肺癌；头和颈的   许多鳞状细胞癌；可能许多的其它癌  白细胞   GRP78/BiP   可能许多不同的癌，因为GRP7S表达是由   肿瘤特异性条件诱导  缺血部位的细胞   来自   Egr-1的   CarG元件   通过电离辐射诱导，所以在辐射是可能是   大多数肿瘤  曝露于电离辐射的细胞；白细胞

2.起始信号和内部核糖体结合位点

还需要一种特异性的起始信号来有效翻译编码序列。这些信号包括 ATG起始密码子或毗邻顺序。可能需要提供内源性翻译控制信号，包括 ATG起始密码子。本领域一般技术人员将能够容易地确定这些并且提供 必须的信号。众所周知，起始密码子必须是和引导的编码序列的阅读框 在“框内”以确保整个插入序列的翻译。外源性翻译控制信号和起始密 码子可以是天然的或合成的。表达效率可以通过包括合适的转录增强子 元件来增强。

在本发明的某些实施方案中，将内部核糖体进入位点(IRES)元件 的用途用于产生多基因或多顺反子信使RNA。IERS元件能够绕开5’-甲 基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier 和Sonenberg，1988)。已经描述了来自小核糖核酸病毒科的两个成员 (脊髓灰质炎病毒和脑炎心肌炎病毒)的IRES元件以及来自哺乳动物信 使RNA的IRES(Macejak和Sarnow，1991)可以将IRES元件连接至异 源开放阅读框。多个开放阅读框可以一起转录，每个由IRES分来，产生 多顺反子信使RNA。利用IRES元件，每个开放阅读框能够到达核糖体进 行有效的翻译。用单个启动子/增强子可以有效表达多个基因而转录单个 信使RNA(参见美国专利5,925,565和5,935,819，通过引入作为参考)。

3.多克隆位点

载体可以包括一个多克隆位点(MCS)，其为含有多个限制性内切 酶位点的核酸区域，任何一个限制性内切酶位点可以与标准的重组技术 协同使用来消化该载体(参见Carbonelli等，1999、Levenson等，1998， 和Cocea，1997，将它们通过引入作为参考)。“限制性内切酶消化” 指用仅在核酸分子的特定位点作用的酶催化切割核酸分子。许多这些限 制性内切酶是可商业获得的。这些限制性内切的用途是为本领域技术人 员所广泛理解的。通常，载体用在MCS内切割的限制性内切酶进行线性 化或片段化以使得外源序列能连接至该载体。“连接”指在可以是或可 以不是相互邻接的两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。涉及限制 性内切酶和连接反应的技术是重组技术领域的技术人员所周知的。

4.剪接位点

大多数转录的真核RNA分子将进行RNA剪接以将内含子从初始转录 本除去。含有基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点来 确保转录物正确加工来表达蛋白质。(参见Chandler等，1997，将其在 此通过引入作为参考。)

5.终止信号

本发明的载体或构建体将通常包含至少一个终止信号。“终止信号” 或“终止子”包括涉及特异性终止由RNA聚合酶进行的RNA转录。因而， 在某些实施方案中，考虑终止RNA转录物产生的终止信号。在体内可能 必须终止子来获得期望的信使RNA水平。

在真核系统中，终止子区也可以包含特定的DNA序列，其允许位点 特异性切割新的转录物以便暴露多腺苷酸化位点。这传递信息给专一的 内源性聚合酶来加入一段大约200个腺苷酸残基(多聚A)至该转录物 的3’端。用这种多聚A尾的RNA分子表现得更稳定并且得以更有效地 转录。因而，在涉及真核细胞的其它实施方案中，优选终止子包含RNA 切割信号，并且更优选终止子信号促进该信使RNA的多腺苷酸化。终止 子和/或多腺苷酸化位点元件可以用于增强信使RNA水平和/或使从表达 盒连读到其它序列最小化。

考虑用于本发明的终止子包括在此描述的或本领域一般技术人员 已知的任何已知的转录终止子，包括(但不限于)例如，基因的中止序 列，例如牛生长因子终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在某些 实施方案中，终止信号可以是缺少可转录或可翻译序列，例如由于序列 平截。

6.多腺苷酸信号

在表达中，特别是真核表达，通常包括多腺苷酸信号来实现转录物 的正确多腺苷酸化。多腺苷酸信号的性质并不认为是对成功实践本发明 关键，和/或可以采用任意这种序列。优选的实施方案中包括SV40多腺 苷酸化信号和/或牛生长激素多腺苷酸化信号，它们是方便的和/或已知 在多种把细胞中良好作用。多腺苷酸化可以增加转录物的稳定性或可以 有助于细胞质转运。

7.复制起点

为了在宿主细胞中增殖载体，载体可以含有一个或多个复制位点的 起点(通常称为“ori”)，其为复制在该处起始的特异性核酸序列。备 选地，如果宿主细胞是酵母则可以采用自主复制序列(ARS)。

8.可选择和可筛选标记

在本发明的某些实施方案中，含有本发明的核酸构建体的细胞可以 通过在该表达载体中包括标记而体外或体内鉴定。这种标记物将赋予细 胞可鉴别的变化，使得容易地鉴定含有该表达载体的细胞。通常，可选 标记是赋予使得能进行选择的性质的可选标记。正向可选标记是其中该 标记的存在使得能对其选择的标记，而负向可选标记是其中它的存在防 止了对它的选择的标记。正向可选标记的一个实例是抗药性标记。

通常，包含药物选择标记有助于转化物的克隆和鉴定，例如赋予对 新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和histidinol抗性的 基因是有用的可选标记。除了赋予使得能基于状态实现而鉴别转化体的 表型，也考虑其它类型的标记，包括可筛选标记例如GFP，GFP的根据是 比色分析。备选地，可以利用可筛选酶例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk) 或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也将指导如何采用免疫标 记，可能与FACS分析协同使用。使用的标记认为是不重要的，只要其能 够与编码基因产物的核酸同时表达。可选标记和可筛选标记的其它实例 是本领域技术人员所熟知的。

D.核酸检测

除了它们在引导痘病毒蛋白质、多肽和/或肽的表达中的作用外， 在此公开的核酸序列具有许多其它用途。例如，他们具有作为探针或引 物用于涉及核酸杂交的实施方案的用途。它们可以用于本发明的诊断或 筛选方法。本发明包括编码疸病毒或痘病毒多肽调节物的核酸的检测。

1.杂交

长为13-100个核苷酸之间，优选17-100个核苷酸之间，或在本发 明的一些方面多达1-2千碱基或更长的探针或引物的使用使得能形成既 稳定又有选择性的双链分子。在多于20个碱基长度的连续序列上具有互 补序列的分子通常是优选的，以增加获得的杂交分子的稳定性和/或选择 性。人们将通常优选设计具有一条或多条20-30个核苷酸，或如果需要 甚至是更长的互补序列用于杂交的核酸分子。这种片段可以很容易制备， 例如，通过用化学手段直接合成片段或通过将选择的序列引入用于重组 生产的重组载体。

因此，可以因为它们与互补的DNA序列和/或RNA序列选择性形成 双链或提供引物用于从样品扩增DNA或RNA的能力而可以使用分子本发 明的核酸序列。取决于预想的应用，人们将期望采用各种杂交条件来获 得探针或引物对靶序列的各种程度的选择性。

对于需要高度选择性的应用，人们通常将期望采用相对高的严格条 件来形成交链。例如，相对低的盐和/或高的温度条件，如在大约50℃ 至大约70℃的温度下提供大约0.02M至大约0.10M NaCl。这么高的严 格条件容忍极小(如果有的话)的探针或引物与模板或靶链之间的错配 并特别适合用于分离特定的基因或用于检测特定的mRNA转录物。通常应 该理解，可以通过加入增加量的甲酰胺来获得更严格的条件。

对于某些应用，例如，定点诱变，应该理解低严格条件是优选的。 在这些条件下，即使杂交链的序列不是完全互补而是在一个或多个位置 处错配，也可以发生杂交。可以通过增加盐浓度和/或增加温度而给条件 赋予更少的严格性。例如，中等严格条件可以由大约37℃至大约55℃ 的温度下的大约0.1-0.25M NaCl提供，而低严格条件可以由大约20℃ 至大约55℃的温度范围下的大约0.15-0.9M的盐提供。可以根据期望 的结果而容易地操纵杂交条件。

在其它实施方案中，可以在例如大约20℃-大约37℃之间的温度、 50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl₂、1.0mM二硫苏糖 醇的条件下实现杂交。使用的其它杂交条件可以包括大约10mM Tris-HCl (pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl₂，在大约40℃-大约72℃范围的温 度下。

在某些实施方案中，采用本发明定义的序列的核酸，结合合适的手 段，例如标记用于测定杂交，将是有利的。各种各样的合适指示手段是 本领域已知的，包括荧光、放射性、酶促或其它配基，例如亲和素/生物 素，它们能够被检测。在优选的实施方案中，人们期望采用荧光标记或 酶标签，例如，脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，而不是放射性或其它 对环境不不利的试剂。在酶标记的情形中，比色指示底物已知能用于提 供检测手段来鉴定与含有互补序列的样品的特异性杂交，所述的检测手 段是可通过看得见或通过分光光度计来检测的。

通常，设想在此描述的探针或引物将可在溶液杂交，如在PCR  中 用试剂，用于检测对应基因的表达，以及在采用固相的实施方案中用作 试剂。在涉及固相的实施方案中，试验DNA(或RNA)吸附或固定于选择 的基质或表面上。然后让固定的单链核酸与选择的探针在理想的条件下 杂交。选择的条件将取决于特殊的情况(例如取决于G+C含量、靶核酸 的类型、核酸来源、杂交探针的大小等)。用于特殊的目标应用的杂交 条件的优化是本领域技术人员所熟知的。在洗涤杂交的分子除去非特异 性结合的探针分子后，通过测定结合的标记的量检测和/或定量杂交。代 表性的固相杂交方法在美国专利5,843,663、5,900,481和5,919,626中 公开。可用于实践本发明的其它杂交方法在美国专利5,849,481、 5,849,486和5,851,772中公开。在本说明书的该部分中确定的这些或 其它参考文献的相关部分在此通过引入作为参考。

2.核酸的扩增

用作扩增模板的核酸可以根据标准的方法学(Sambrook等，1989) 从细胞、组织或其它样品分离。在某些实施方案中，分析是在整个细胞 或组织匀浆物或生物流体样品上进行而无需充分纯化模板核酸。核酸可 以是DNA或分级的或整个细胞RNA。如果使用RNA，可能期望首先将RNA 转换为互补的DNA。

如此处使用的，术语“引物”意指包括能在模板依赖性的过程中引 发新生核酸的合成的任意核酸。通常，引物是长为10到20和/或30个 碱基对的寡核苷酸，但是可以采用更长的序列。可以提供双链和/或单链 形式的引物，尽管单链形式是优选的。

让引物对与模板核酸在允许选择性杂交的条件下接触，所述的引物 对是设计用于选择性杂交至对应在此鉴定的基因序列的核酸。取决于期 望的应用，可以选择将仅使得能杂交至与引物完全互补的序列的高严格 杂交条件。在其它的实施方案中，杂交可以在降低的严格性下进行，以 使得核酸的扩增含有与引物序列的一个或多个错配。一旦杂交，让模板- 引物复合物与一种或多种促进模板依赖性核酸合成的酶接触。进行多轮 扩增，也称为“循环”，直至产生了足够量的扩增产物。

可以检测或定量扩增产物。在某些应用中，可以通过视觉手段来进 行检测。备选地，检测可以涉及通过整合的放射标记或荧光标记的化学 发光、闪烁显像或甚至是通过使用电和/或热脉冲信号的系统间接鉴定产 物(Bellus，1994)。

许多模板依赖性过程可以用来扩增给定模板样品中存在的寡核苷 酸序列。最有名的一种扩增方法是聚合酶链式反应(称为PCR)，其 在美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159以及在Innis等，1988 中详细描述，将这每篇文献通过引入作为参考。

可以采用逆转录酶PCR扩增方法来定量扩增的mRNA的量。逆转录 RNA为cDNA的方法是众所周知的(参见，Sambrook等，1989)。用于逆 转录的备选方法利用热稳定性DNA聚合酶。这种方法在WO 90/07641中 描述。聚合酶链式反应方法学是本领域所熟知的。RT-PCR的代表性方法 在美国专利5,882,864中描述。

用于扩增的另一种方法是连接酶链式反应(“LCR”)，其在欧洲 申请案No.320308中公开，在此将该参考通过全文引入作为参考。美 国专利4,883,750描述了一种类似LCR的方法用于让探针对结合至靶序 列上。也可以使用一种在美国专利5,912,148中公开的基于PCR和寡 核苷酸连接酶测定法(OLA)。

可以用于实践本发明的用于扩增靶核酸序列的备选方法在美国专 利5,843,650、5,846,709、5,846,783、5,849,546、5,849,497、5,849,547、 5,858,652、5,866,366、5,916,776、5,922,574、5,928,905、5,928,906、 5,932,451、5,935,825、5,939,291和5,942,391、GB申请案No.2202 328和PCT申请案No.PCT/US89/01025中公开，在此将每篇参考文献通 过全文引入作为参考。

在PCT申请案No.PCT/US87/00880中描述的Qβ复制酶也可以在本 发明中用作一种扩增方法。在这种方法中，在存在RNA聚合酶时将具有 与靶标的区域互补的区域的RNA复制序列加入至样品中。该聚合酶将复 制该复制序列，然后可以检测该复制序列。

等温扩增技术，其中限制性内切核酸每和连接酶用于实现在限制性 位点的一条链中含有核苷5′-[α-硫代-]-三磷酸的靶分子的扩增，也可 以用于扩增本发明中的核酸(Walker等，1992)。在美国专利5,916,779 中公开的链置换扩增技术(SDA)是另一种进行核酸的等温扩增的方法， 该方法涉及多轮的链置换和合成，即切口平移法。

其它的核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)，包括基于 核酸序列的扩增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989；PCT申请案WO 88/10315， 在此通过全文引入作文参考)。欧洲申请案No.329822公开了一种核 酸扩增方法，其涉及循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA (dsDNA)，其可以用于本发明。

PCT申请案WO 89/06700(在此通过全文引入作文参考)公开了一 种核酸序列扩增方案，该方法是基于启动子区/引物序列与靶标单链DNA (“ssDNA”)杂交，随后转录该序列的许多RNA拷贝。这种方案不是循 环得，即新模板不是从得到的RNA专利物产生。其它的扩增方法包括 “RACE”和“单边PCR”(Frohman，1990；Ohara等，1989)。3. 核酸的检测

在任何扩增后，可能期望从模板和/或过剩的引物分离扩增产物。 在一个实施方案中，扩增产物用标准的方法通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰 胺或拒丙烯酰胺凝胶电泳来分离(Sambrook等，1989)。可以切取出分 离的扩增产物并从凝胶中洗出用于进一步操作。使用低熔点琼脂糖凝胶， 可以通过加热凝胶而将分离的带移出，随后提取核酸。

也可以通过本领域已知的的色谱技术实现核酸的分离。存在许多类 型的可用于实践本发明的色谱法，包括吸附色谱法、分配色谱法、离子 交换色谱法、羟基磷灰石色谱法、分子筛色谱法、反相色谱法、柱色谱 法、纸色谱法、薄层色谱法和气相色谱法以及HPLC。

在某些实施方案中，对扩增产物进行显影。一种典型的显影方法涉 及用溴化乙锭染色凝胶并在UV光下显影电泳条带。备选地，如果扩增产 物用放射或荧光标记的核苷酸整体标记，则可以将分离的扩增产物曝光 于x-光片或在合适的激发光谱下显影。

在一个实施方案中，在分离扩增产物后，让经标记的核酸探针与扩 增的标记序列接触。探针优选缀合至发色团，但是也可以经放射标记。 在另一实施方案中，将探针缀合至结合伴侣(binding partner)，例如 抗体或生物素，或携带可检测部分的另一结合伴侣。

在特别的实施方案中，通过与经标记的探针的DNA印迹和杂交来检 测。涉及DN印迹的技术是本领域技术人员所熟知的(参见Sambrook等， 1989)。前述技术的一个实例描述于美国专利5,279,721(在此将其通 过引入作为参考)中，该专利公开了用于自动电泳和核酸转移的仪器和 方法。该仪器使得能进行电泳和印迹而不需外部操作电泳并很理想用于 进行根据本发明的方法。

可以用于实践本发明的用于核酸检测的其它方法在美国专利 5,840,873、5,843,640、5,843,651、5,846,708、5,846,717、5,846,7265、 846,729、5,849,487、5,853,990、5,853,992、5,853,993、5,856,092、 5,861,244、5,863,732、5,863,753、5,866,331、5,905,024、5,910,407、 5,912,124、5,912,145、5,919,630、5,925,517、5,928,862、5,928,869、 5,929,227、5,932,413和5,935,791中公开，在此将它们每篇通过引入 作为参考。

4.其它测定法

用于遗传筛选的其它方法可以在本发明的范围内使用，例如，用于 检测基因组DNA、cDNA和/或RNA样品中的突变。用于检测点突变的方法 包括变性梯度凝胶电泳法(“DGGE”)、限制性片段长度多态性分析 (“RPLP”)、化学或酶促切割方法、直接测序由PCR扩增的靶区域 (见上面)、单链构象多态性分析(“SSCP”)以及本领域熟知的其它 方法。

用于点突变的其它筛选方法是基于RNA/DNA或RNA/RNA异源双链中 的碱基对错配的RNA酶切割。如此处使用的，术语“错配”定义为双链 RNA/RNA、RNA/DNA或DNA/DNA分子中一个或多个未配对的或错配的区域。 因而该定义包括由于插入/缺失突变以及单个或多个碱基点突变引起的 错配。

美国专利4,946,773描述了RNA酶A错配切割测定法，该方法涉及 退火单链DNA或RNA试验样品至RNA探针，并随后用RNA酶A处理该核 酸双链。为了检测错配，将通过电泳根据大小而分离的RNA酶A处理的 单链产物与经类似处理的对照双链比较。在含有照双链中不可见的较小 片段(切割产物)的样品记为阳性。

其它研究者已经描述的RNA酶I在错配测定中的使用。来自 Promega Biotech的文献描述了RNA酶I用于错配检测的用途。Promega 销售含有RNA酶的试剂盒，据报道该酶切割4种已知的错配中的三种。 其它人已经描述了使用MutS蛋白或其它DNA-修复酶用于检测单碱基错 配。

可以用于本发明的实践的用于检测缺失、插入或置换突变的备选方 法在美国专利5,849,483、5,851,770、5,866,337、5,925,525和 5,928,870中公开，将每个这些专利通过全文引入作为参考。

E.基因转移的方法

用于核酸递送以有效表达本发明组合物的合适方法相信实际上包 括在此描述的或本领域一般技术人员将知道的、通过其可以将核酸(例 如，DNA，包括病毒和非病毒载体)引入进细胞起、细胞、组织或生物体 中的任何方法。这种方法包括(但不限于)直接递送DNA例如通过注射 (美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、 5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，在此将它们每个通过 引入作为参考)，包括显微注射(Harlan和Weintraub，1985；美国专 利5,789,215，在此通过引入作为参考)；通过电穿孔(美国专利 5,384,253，在此通过引入作为参考)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等1990)；通过使用DEAE- 葡聚糖，随后使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接sonic loading (Fechheimer等，1987)；通过脂类体介导的转染(Nicolau和Sene，1982； Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989； Kato等，1991)；通过微粒轰击(PCT申请案No.WO 94/09699和95/06128； 美国专利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877 和5,538,880，在此将每个通过引入作为参考)；通过用碳化硅搅动 (Kaeppler等，1990；美国专利5,302,523和5,464,765，在此将每个 通过引入作为参考)；通过农杆菌介导的转换(美国专利5,591,616和 5,563,055，在此将每个通过引入作为参考)；或通过PEG-介导的原生 质体的转换(Omirulleh等，1993；美国专利4,684,611和4,952,500， 在此将每个通过引入作为参考)；通过干燥/抑制-介导的DNA摄取 (Potrykus等1985)。通过这些技术的应用，可以稳定或暂时转化细胞 器、细胞、组织或生物体。

5.脂类组分和部分

在某些实施方案中，本发明涉及含有一种或多种与核酸相关的脂 类、氨基酸分子(例如肽)或其它小分子化合物。在此讨论的任何实施 方案中，所述的分子可以是痘病毒多肽或痘病毒多肽调节基因，例如编 码任一种痘病毒多肽的部分或全部的核酸，或备选地，编码痘病毒多肽 调节物的全部或部分的氨基酸分子。脂类是一种特性上不溶于水并且可 以用有机溶剂萃取的物质。本领域技术人员将符合在此具体描述的化合 物认为是脂类，并且包含于本发明的组合物和方法中。可以将脂质组分 和非脂质组分通过共价或非共价方式相互连接。

脂类可以天然出现的或是合成的(即由人设计或生产)。然而，脂 类通常是生物物质。生物脂类是本领域所熟知的，并且包括例如，中性 脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜类、溶脂类(lysolipids)、糖 鞘脂类、糖脂、硫脂类、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂类和多聚化的脂 类以及它们的组合物。

可以将与脂质关联的核酸分子或氨基酸分子(例如肽)分散进含有 脂的溶液中、用脂溶解、用脂乳化、与脂混合、与脂组合、共价结合至 脂上、作为悬浮物包含于脂中或相反与脂结合。本发明的脂或脂/痘病毒 相关组合物不限于任何特殊的结构。例如，它们也可以简单地散布于溶 液中，可能形成大小或形状不均一的聚集物。在另一实例中，它们可以 存在于双层结构，例如细胞器中，或具有“坍陷”结构。在另一非限制 性实例中，也考虑lipofectamine(Gibco BRL)-痘病毒或Superfect (Qiagen)-痘病毒复合物。

在某些实施方案中，脂组合物可以包含大约1％、大约2％、大约3％、 大约4％about 5％、大约6％、大约7％、大约8％、大约9％、大约10％、大 约11％、大约12％、大约13％、大约14％、大约15％、大约16％、大约17％、 大约18％、大约19％、大约20％、大约21％、大约22％、大约23％、大约 24％、大约25％、大约26％、大约27％、大约28％、大约29％、大约30％、 大约31％、大约32％、大约33％、大约34％、大约35％、大约36％、大约 37％、大约38％、大约39％、大约40％、大约41％、大约42％、大约43％、 大约44％、大约45％、大约46％、大约47％、大约48％、大约49％、大约 50％、大约51％、大约52％、大约53％、大约54％、大约55％、大约56％、 大约57％、大约58％、大约59％、大约60％、大约61％、大约62％、大约 63％、大约64％、大约65％、大约66％、大约67％、大约68％、大约69％、 大约70％、大约71％、大约72％、大约73％、大约74％、大约75％、大约 76％、大约77％、大约78％、大约79％、大约80％、大约81％、大约82％、 大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约 89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、 大约96％、大约97％、大约98％、大约99％、大约100％或可源于此的任何 范围的特殊脂、脂类型或非脂组分如药物、蛋白质糖、核酸或在此公开 的或本领域技术人员已知的其它物质。在一个非限制性实例中，脂组分 可以包含大约10％-大约20％的中性脂类，和大约33％-大约34％的脑苷脂 类以及大约1％的胆固醇。在另一非限制性实例中，脂质体可以包含4％- 大约12％的萜类，其中大约1％的微胶粒确切地是番茄烯，剩下大约3％- 大约11％的脂质体含有其它萜类；和大约10％-35％的磷脂酰胆碱，以及大 约1％的药物。因而，考虑本发明的脂组合物可以包含任意组合或百分比 范围的任意脂类、脂类型或其它组分。

V.GM-CSF

在本发明的一个特殊方面，痘苗病毒将携带编码GM-GSF的基因。 GM-CSF是粒-巨噬细胞集落刺激因子，其为一种有助于产生更多白细胞， 特别是粒细胞、巨噬细胞和变成血小板的细胞的物质。它是属于称为造 血(血液形成)剂的药物家族的细胞因子，并也称为沙莫司亭GM-CSF 由Cantrell等，(1985)首先克隆并测序。人GM-CSF是由单个开放阅读 框编码的144个氨基酸的糖蛋白，预测的分子量为16,293道尔顿。其表 现出与小鼠GM-CSF有69％的核苷酸同源性和54％的氨基酸同源性，并且 作为单拷贝基因存在。

GM-CSF由许多不同的细胞类型(包括激活的T细胞、B细胞、巨噬 细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞)响应细胞因子或免疫和炎性 刺激而产生。除了粒细胞-巨噬细胞祖细胞外，GM-CSF还是红细胞、巨 核细胞和嗜酸粒细胞祖细胞的生长因子。对于成熟的造血细胞，GM-CSF 是粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和嗜酸性细胞的存活因子并激活它们的效 应子功能。还据报道GM-CSF对非造血细胞具有功能性作用。其可以诱导 人内皮细胞迁移和增殖。

GM-CSF是种属特异性的，人GM-CSF对小鼠细胞不具有功能性作用。 GM-CSF通过结合至特定的细胞表面受体而发挥其生物学作用。人GM-CSF 信号转导所需的高亲和性受体已经显示为异二聚体，由一条GM-CSF-特 异性α和一条由IL-3和IL-5的高亲和性受体共有的β链组成。

尽管GM-CSF可以刺激许多种类细胞系(包括骨肉瘤、癌和腺癌细 胞系)的增殖，用于患有黑素瘤、白血病、淋巴瘤、成神经细胞瘤、卡 波西肉瘤、间皮瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、脑癌、肾 癌和子宫颈癌的人的GM-CSF(单独或与其它免疫疗法一起)的临床试验 正在进行。GM-CSF的普通副作用包括流行性感冒样症状(发热、头痛、 肌肉疼痛)、皮疹、面部潮红和骨痛。

VI.其它异源基因

在一些实施方案中，用于本发明的痘苗病毒含有表达异源序列的核 酸序列，该异源序列不编码GM-CSF，而是编码其它异源序列。在某些实 施方案中，该异源序列编码细胞因子。备选地或额外地，该痘苗病毒可 以含有编码IL-12、胸苷脱氨基酶、TNF₅等。而且，在此讨论的任何基因 产物可以由包含于痘苗病毒内并用于本发明的方法中的核酸编码。

VII.药物制剂、递送和治疗方案

在本发明的一个实施方案中，考虑通过递送痘苗病毒来治疗过度增 殖性疾病，例如癌的方法。考虑治疗的癌的实例包括肺癌、头颈癌、乳 腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、子宫癌、骨癌、睾丸癌、子宫颈癌、 胃肠癌、淋巴瘤、肺部中的瘤前病变、结肠癌、骨髓瘤、膀胱癌和可以 治疗的任意其它癌或肿瘤。

通常，药物组合物的有效量定义为足以可检测地且重复地改善、减 少、最小化或限制疾病或其症状的程度。可采用更严格的定义，包括疾 病的消除、根除或治愈。

优选地，患者将具有足够的骨髓功能(定义为＞2,000/mm的外周 粒细胞绝对计数和＞100,000/mm的血小板计数)、足够的肝功能(胆 红素＜1.5mg/dl)和足够的肾功能(肌酐＜1.5mg/dl)。

可以通过本发明的方法和组合物治疗的癌细胞包括来自膀胱、血 液、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食管、胃肠、齿龈、头、肾、肝、肺、 鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的细胞。此外， 癌可特别是以下组织学类型，尽管其不限于这些：恶性赘生物；癌；未 分化的癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状上皮细 胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行 细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和 胆管癌；小梁性腺癌；囊性腺样癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结 肠息肉病；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌 色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗 粒细胞腺癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜硬化性癌；肾上 腺皮质细胞癌；内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯 聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺 癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小 叶癌；炎性癌；乳房的佩吉特氏病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌w/鳞状 化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细 胞瘤；恶性男性细胞瘤；细胞癌；恶性莱迪希细胞瘤；恶性脂质细胞瘤； 恶性神经节细胞瘤；恶性乳房外神经节细胞瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉 瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性恶性黑素瘤；浅表扩展性黑素瘤；巨色 素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤； 恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤； 环胎性横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤； Mullertian混合瘤；肾胚细胞瘤；肝毒细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶 性布伦纳瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚 胎癌性细胞；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿样瘤；绒毛膜癌；恶性中 肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波济氏肉瘤；恶性血管外皮细胞 瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤； 间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞 牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤； 恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性 星形细胞瘤；星形芽细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质细胞瘤；成 少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞 瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑脊膜瘤； 神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；何杰金 氏病；hodgkin′s；类肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细 胞恶性淋巴瘤；滤泡恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其它特异性非何杰金 氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫 增生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞性白血病；红白血病； 淋巴肉瘤细胞白血病；髓细胞性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞 性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病； 髓样肉瘤；和毛细胞白血病。

本发明考虑用于抑制或预防任何类型的原发性癌的局部侵入和/或 转移的方法。例如，原发性癌可以是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺 癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、牙龈 癌、舌癌、白血病、成神经细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前 列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、 淋巴瘤、脑癌、结肠癌、或膀胱癌。在本发明的某些实施方案中，原发 性癌是肺癌。例如，肺癌可以是非小小细胞肺癌。

而且，本发明可以用于预防癌或用于治疗初癌或癌前细胞，包括组 织转化、发育异常和超常增生。其也可以用于抑制不希望的但是是良性 的细胞，例如鳞状化生、发育异常、良性前列腺增生细胞、增生性病变 等。发展成癌或更严重形式的癌可以通过涉及如上描述的GM-CSF多肽或 由痘苗病毒编码的其它多肽的本发明方法而受到停止、打断或延缓。

A.施用

用本发明的方法和组合物来杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、 降低肿瘤或组织大小或者逆转或减少恶性表型，通常应该将过度增生细 胞与治疗性组合物例如多肽或表达多肽的表达构建体接触。自然，施用 的途径将随病患的位置和性质而变化，并包括例如，皮内、经皮肤、肠 胃外、静脉内、肌内、鼻内、皮下、局部、经皮、气管内、腹膜内、动 脉内、膀胱内、瘤内、吸入、灌注、灌洗、直接注射和经口施用和制剂。

本发明特别涉及本发明痘苗病毒的血管内施用。术语“血管内”理解 为指递送进患者的脉管系统，意味着递送进患者的血管内、在患者的血 管内或之中。在某些实施方案中，施用是进入认为是静脉的血管中(静 脉内)，而在其它方案中施用是进入认为是动脉的血管中。静脉包括(但 不限于)颈内静脉、外周静脉、冠状静脉、肝静脉、门静脉、大隐静脉、 肺静脉、上腔静脉、下腔静脉，胃静脉、脾静脉、肠系膜下静脉、肠系膜 上静脉、头静脉和/或股静脉。动脉包括(但不限于)冠状动脉，肺动脉， 肱动脉，颈内动脉，弓动脉，股动脉，外周动脉和/或睫动脉。考虑递送 可以通过小动脉或毛细管或到达小动脉或毛细管。

特别考虑注射进肿瘤脉管中用于离散性、实体瘤、可接近的肿瘤。 局部、区域或系统性施用也是合适的。对于＞4cm的肿瘤，要施用的量 是大约4-10ml(优选10ml)，而对于＜4cm的肿瘤，将施用大约1-3 ml(优选3ml)的量。作为单次剂量递送的多次注射剂包含大约0.1- 大约0.5ml的量。可以通过施用多次注射剂给肿瘤(间隔大约1cm) 来有利地接触病毒颗粒。

在手术介入的情形中，本发明可以在手术前使用，使得不能进行手 术的肿瘤能接受切除术。备选地，本发明可以在手术时使用和/或在手术 后使用，以治疗残留的或转移性疾病。例如，可以用含有痘苗病毒多肽 或痘苗病毒的制剂注射或灌注切除后的肿瘤床，所述的痘苗病毒含有突 变，使得该痘苗病毒有利于用于治疗癌或癌细胞。灌注可以在切除后继 续进行，例如，通过保留在手术位点植入的导管来继续。还考虑定期的 手术后治疗。

还可以在需要的地方，例如，在肿瘤切除的地方，进行持续施用， 并且对瘤床进行处理以除去残留的显微病灶。优选通过注射器或导管插 入术来递送。这种连续的灌注可以在初次治疗后进行大约1-2小时、大 约2-6小时、大约6-12小时、大约12-24小时、大约1-2天、大约1-2 周或更长。通常，经由连续灌注的施用的治疗组合物的剂量等价于通过 单次或多次注射给予的剂量，在灌注进行期间过一段时间进行调整。进 一步考虑，肢体灌注(limb perfusion)可用于施用本发明的治疗性组 合物，特别是在黑素瘤和肉瘤的治疗中。

治疗方案也可以变化，并且通常取决于肿瘤类型、肿瘤位置、疾病 进展和患者的健康及年龄。显然，某些类型的肿瘤将需要更强力的治疗， 而同时，某些患者不能忍受更重的方法。基于治疗性制剂已知的效力和 毒性(如果有的话)临床医生将十分适于做这种决定。

在某些实施方案中，要治疗的肿瘤可能不能(至少在开始时不能) 切除。由于在肿瘤边缘的收缩或通过除去某些特别有侵润性的部分，用 治疗性病毒构建体治疗可以增加肿瘤的可切除性。在治疗后，有可能进 行切除可。切除后额外的治疗将用来除去肿瘤位点的肉眼不可见的残留 肿瘤。

用于原发性肿瘤或切除后的瘤床的典型疗程将涉及多次剂量。典型 的原发性肿瘤治疗涉及在两周期间施用6次剂量。该两周用药法可以重 复1、2、3、4、5、6或更多次。在治疗过程中，可以再次评估对完成既 定的给药的需要。

治疗可以包括多种“单位剂量”。单位剂量定义为含有预定量的治 疗性组合物。要施用的量，以及特别的途径和剂型是在临床领域的技术 人员的能力内。单位剂量不需要以单次注射施用，而是可以包括在设定 的时间期限内的持续灌注。本发明的单位剂量可以方便地根据用于病毒 构建体的噬斑形成单位(pfu)来描述。单位剂量范围是10³、10⁴、10⁵、 10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³pfu以及更高。备选地，取决 于病毒的类型和可达到的滴定度，将递送1-100、10-50、100-1000或 多达1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、 1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴或1×10¹⁵更高感染性病毒颗粒 (vp)给患者或患者细胞。

B.可注射组合物或制剂

用于递送编码全部或部分痘苗病毒基因组的表达载体或病毒至本 发明的癌或肿瘤细胞的优选方法是通过肿瘤内注射。然而，在此公开的 药物组合物可以备选经肠胃外、静脉内、皮内、肌内、经皮肤或甚至是 经腹膜内施用，如美国专利5,543,158；5,641,515和5,399,363中描述 的(在此特别将每篇专利通过全文引入作为参考)。

核酸构建体的注射可以通过注射器或用于注射溶液的任何其它方 法递送，只要表达构建体可以通过注射所需的针头的特殊规格。最近已 经描述了(美国专利5,846,233)一种新的无针注射系统，该系统具有 一个限制装盛溶液的安瓿腔的喷嘴和用于将溶液从喷嘴推出至递送位点 的能量装置。也已经描述了注射器系统在基因治疗中的使用，该系统允 许精确地在任意深度多次注射预定量的溶液(美国专利5,846,225)。 作为游离碱或可药用盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂例如羟 丙纤维素稳定混合的水中制备。分散剂也可在甘油、液体聚乙二醇及其 混合物以及在油中制备。在一般的存储和使用条件下，这些制剂含有防 腐剂用以防止微生物的生长。适合注射施用的药物形式包括无菌含水溶 液剂或分散剂以及用于临时制备无菌注射用溶液剂或分散剂的无菌粉剂 (美国专利5,466,468，特别在此通过全文引入作为参考)。在所有情 形中，所述的形式必须是无菌的，并且应该是达到容易进行注射程度的 流体。其在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须对抗微生物如细 菌和真菌的污染作用进行防腐。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇 (如甘油、丙二醇和流体聚乙二醇等)及其合适的混合物和/或植物油的 溶剂或分散介质。适当的流动性可例如通过用包衣如卵磷脂、在分散剂 的情形中通过保持所需的粒度，以及通过使用表面活化剂来维持。对微 生物作用的预防可通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯 丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情形中，将优选包括等 渗剂，例如糖或氯化钠。可注射用组合物的延长吸收可通过在该组合物 中使用延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

对于在含水溶液中的肠胃外施用，例如，如有必要应该适当地缓冲 该溶液并用足够的盐水或葡萄糖首先赋予该流质稀释剂等渗性。这些特 殊含水溶液特别适合静脉内、肌内、皮下、瘤内和腹膜内施用。就此而 论，根据本公开内容，可使用的无菌含水介质将是本领域那些技术人员 已知的。例如，可将一次剂量可溶解于1ml等渗的NaCl溶液中，并加 入1000ml皮下输注流体中或在建议的输注位点处注入(参见例如， “Remington′s Pharmaceutical Sciences”15th Edition，1035-1038 和1570-1580页)。剂量的一些变化必然会取决于受治疗的受试者的状 况发生。在任何情况下，负责施用的人将确定用于个体受试者的合适剂 量。此外，对于人施用，制剂应该符合如FDA Office of Biologies standards要求的无菌性、致热原性、一般安全性(general safety) 和纯度标准。

无菌注射用溶液剂通过这样制备：将需要量的活性化合物与上文中 列举的多种其它成分一起合并进合适的溶剂中，根据需要，之后过滤灭 菌。通常，分散剂通过将多种灭菌的活性成分合并进无菌载体制备，所 述载体含有基本的分散介质和所需的来自上面列举的那些的其它成分。 在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉剂的情形中，优选的制备方法是 真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术产生活性物质加上任何来自其事先 无菌-过滤的溶液的额外所需成分的粉末。

在此公开的组合物可以配制成中性或盐形式。可药用盐，包括酸加 成盐(用蛋白质的游离氨基形成)并且其是与无机酸例如，盐酸或磷酸， 或与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。用游离羧基形成的 盐也可以源于无机碱，例如，氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，以及有机碱 例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。一旦配制成制剂，溶液将 以与剂型相容的方式并以治疗有效的量施用。制剂很容易以各种剂型， 例如可注射溶液剂、药物释放胶囊剂(drug release capsules)等。

如在此使用的，“载体”包括任何以及所有的溶剂、分散介质、赋 形剂、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和延缓吸收的试剂、缓 冲液、载体溶液、混悬液、胶体等。这种介质和试剂用于药学活性物质 的用途在本领域中是熟知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质 或制剂外，考虑将它们用于治疗性组合物中。辅助的活性成分也可整合 进该组合物中。

短语“可药用”或“药理学可接受的”指在施用给人时不会产生变 应性反应或类似的不利反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性 成分的含水组合物的制备是本领域熟知的。通常，这种组合物可制备成 可注射剂，作为流体溶液剂或混悬剂；也可制备成适合在注射前溶解或 悬浮于流体中的固体形式。

C.联合治疗

本发明的化合物和方法可用于包括癌和动脉粥样硬化的过度增生 性疾病/病状范围。为了增加用本发明的组合物(例如减毒的痘苗病毒) 治疗的效力，将这些组合物与在治疗那些疾病和病状中有效的其它制剂 组合是理想的。例如，癌的治疗可以用本发明的治疗性化合物和其它抗 癌疗法，例如抗癌剂或手术来实施。

可以采用多种组合；例如，减毒多达痘病毒如痘苗病毒是“A”而 第二种抗-癌疗法是“B”：

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

将本发明的治疗性表达构建体施用给患者将按照用于所述特殊的 第二种疗法的一般方法，如果有毒性的话，考虑痘病毒治疗的毒性。期 望应该根据需要重复治疗周期。还应考虑，多种标准疗法以及外科手术 可与上面描述的癌或肿瘤细胞疗法结合协同应用。

1.抗-癌疗法

“抗-癌”剂能够负面地影响受试者中的癌，例如通过杀死癌细胞、 诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞的生长速度、减少转移的发生率或数量、 减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供给、增强 对抗癌细胞或肿瘤的免疫应答、防止或抑制癌发展，或延长患有癌的受 试者的寿命。抗-癌剂包括生物制剂(生物疗法)、化学治疗剂和放射治 疗剂。一般来说，这些其它组合物将以有效杀死或抑制细胞增生的组合 量提供。该过程可能涉及将细胞与所述表达构建体和所述药剂或多种因 子同时接触。这可通过这样实现：将细胞与包含这两种制剂的单一组合 物或药理学制剂接触，或通过将细胞在与两种不同的组合物或制剂同时 接触，其中一种组合物含有表达载体而另一组合物含有第二种制剂。

肿瘤细胞对化疗剂和放疗剂的耐受是临床肿瘤学中的一个主要问 题。当前癌研究的一个目标是找到通过将化学疗法和放射疗法与基因疗 法组合联合而提高化学疗法和放射疗法的效力的方法。例如，单纯疱疹- 胸腺激酶(HS-tK)基因，当通过逆转录病毒载体系统递送至脑肿瘤后， 成功地诱导了对抗病毒剂更昔洛韦的易感性。在本发明的内容中，考虑 可以类似地将痘病毒疗法除了与其它促凋亡剂或细胞周期调控剂联合使 用外，还与化学疗法、放射疗法、免疫疗法或其它生物学介入联合使用。

备选地，基因疗法可以在其它制剂治疗的数分钟至数周之前或之后 进行。在其中其它制剂和表达构建体分开施用给细胞的实施方案中，通 常应该确保有效时段不会在每次递送时间之间终止，这样制剂和表达构 建体将仍然能够对细胞发挥有利的联合作用。在这种情况下，考虑可将 细胞与这两种用药程式接触，相互之间在约12-24小时内，更优选相互 之间在约6-12小时内。然而，在一些情况中，显著地延长治疗的时间， 其中在各次施用之间有数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、 5、6、7或8)的时间间隔可能是理想的。

a.化学疗法

癌疗法也包括多种用基于化学和放射的治疗的联合疗法。联合化疗 包括，例如顺铂(CDDP)、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、 异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、 白消安(busulfan)、硝基脲、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、博来 霉素、立可霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、它莫西 芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇(taxol)、吉西他滨 (gemcitabien)、诺维本(navelbine)、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、 反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春花碱和甲氨喋呤、 氮烯咪胺(Temazolomide，DTIC的含水形式)，或前述药物的任意类似 物或衍生物变体。化学疗法与生物疗法的组合称为生化疗法。

b.放射疗法

导致DNA损伤并已广泛利用的其它因素包括通常称为γ-射线、X- 射线的那些，和/或直接递送放射性同位素至肿瘤细胞。还考虑其它形式 的DNA损伤因素，例如微波和紫外线照射。很有可能，所有这些因素实 现对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复，以及染色体的装配和维持的广 范损伤。X射线的剂量范围从用于长时间周期(3至4周)的50-200伦 琴的日剂量到2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变 化很大，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型，以及 赘生细胞的吸收。

术语“接触”和“曝露”，在应用于细胞时，在此用于描述将本发 明的组合物(例如，低氧的抗肿瘤化合物)或者化学治疗剂或放射治疗 剂递送至靶细胞或直接与靶细胞并置的方法。为了实现细胞杀死或停滞， 可将两种制剂都以有效用于杀死细胞或防止其分裂的组合剂量递送给细 胞。

c.免疫疗法

通常，免疫治疗学依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌 细胞。免疫效应物可以是，例如肿瘤细胞表面上的一些标记的特异性抗 体。抗体单独可用作治疗的效应物，或者它可以募集其它细胞来实际实 现细胞杀死。抗体也可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻 毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并仅用作靶向剂。备选地， 效应物可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋 巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞。治疗方式， 即直接的细胞毒活性和某些痘病毒多肽的抑制或减少的组合将在癌治疗 中提供治疗效果。

免疫疗法还可用作联合疗法的一部分。用于联合疗法的一般方法在 下面论述。在免疫治疗的一方面，肿瘤细胞必须携带一些受靶向作用， 即不存于大多数其它细胞上的标记。存在许多肿瘤标记并且任意这些标 记在本发明范围内可适合用于靶向。普通的肿瘤标记包括癌胚抗原、前 列腺特异性抗原、泌尿器官肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、 gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激 素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个备选方面是 免疫刺激效应的抗癌效应。也存在免疫刺激分子，包括：细胞因子例如 IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趋化因子例如MIP-1、MCP-1、 IL-8；以及生长因子例如FLT3配体。将免疫刺激分子作为蛋白质或利用 基因送递与肿瘤抑制基因例如mda-7组合已显示增强了抗肿瘤效果(Ju 等，2000)。

如先前论述的，当前正在研究的或使用的免疫疗法的实例是免疫佐 剂(例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物)(美国专利5,801,005、 美国专利5,739,169、Hui和Hashimoto，1998、Christodoulides等， 1998)、细胞因子疗法(例如，干扰素α、β和γ；IL-1、GM-CSF和TNF) (Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)、基 因疗法(例如TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等，1998；Austin-Ward和 Villaseca，1998；美国专利5,830,880和美国专利5,846,945)和单克 隆抗体(例如抗神经节苷脂GM2、抗-HER-2、抗-p185)(Pietras等，1998； Hanibuchi等，1998)。赫赛汀(曲妥单抗)是阻断HER2-neu受体的嵌 合(鼠-人)单克隆抗体。它具有抗-肿瘤活性并已经批准用于恶性肿瘤 的治疗(Dillman，1999)。使用赫赛汀和化学疗法的癌的联合疗法已显 示比单独的疗法更有效。因此，考虑可以将一种或多种抗-癌疗法与在此 描述的痘病毒相关的疗法一起使用。

被动免疫疗法.存在许多不同方法用于癌的被动免疫治疗。它们 大致可以分为：注射抗体自身；注射偶联至毒素或化学治疗剂的抗体； 注射偶联至放射性同位素的抗体；注射抗独特型抗体；以及清除骨髓中 的肿瘤细胞。

优选地，在被动免疫疗法中采用人单克隆抗体，因为它们在患者中 产生极少或不产生副作用。然而，它们的应用多少因它们的缺乏而受到 限制，并且目前仅在病变内施用。神经节苷脂抗原的人单克隆抗体已经 在病变内施用给患有复发性皮肤黑素瘤的患者(Me和Morton，1986)。 在每天或每周病变内注射后，10名患者中有6名观察到了肿瘤退化。在 另一研究中，通过病变内注射两种人单克隆抗体获得了较好的成功(Irie 等，1989)。

使用多于一种针对两种不同的抗原的单克隆抗体或甚至是具有多 抗原特异性的抗体是可能是有利的。治疗方法也可以包括施用淋巴因子 或如Bajorin等，(1988)描述的其它免疫增强因子。人单克隆抗体的发 展在本说明书的其它地方有更详细的描述。

主动免疫疗法.在主动免疫疗法中，施用通常具有不同的细胞 佐剂的抗原肽、多肽或蛋白质或自身或异体肿瘤细胞组合物或“疫苗” (Ravindranath和Morton，1991；Morton等，1992；Mitchell等，1990； Mitchell等，1993)。在黑素瘤免疫疗法中，那些引发了高的IgM应答 的患者通常比没有引发或引发了低的IgM抗体的那些患者能更好的存 活。IgM抗体通常是暂时抗体(transient antibody)，抗神经节苷脂 抗体或抗糖类抗体(anti-carbohydrate antibody)看上去例外。

过继免疫疗法.在过继免疫疗法中，将患者的循环淋巴细胞或肿 瘤侵润淋巴细胞在体外分离，通过淋巴因子例如IL-2活化或用肿瘤坏死 基因转导，并再次施用(Rosenberg等，1988；1989)。为了实现这些， 将给动物或人患者施用免疫学有效量的与如在此描述的整合了佐剂的抗 原肽组合物组合的活化的淋巴细胞。活化的淋巴细胞最优选是早先在体 外从血液或肿瘤样品分离并活化(或“扩展的”)的患者自身的细胞。 这种免疫疗法形式已经在几个案例中引起了黑色瘤和肾癌退化，但是与 不响应的那些患者比较，有效者的比例极小。

d.基因

在另一实施方案中，所述的第二种治疗是基因疗法，在该疗法中， 治疗性多核苷酸在减毒痘苗病毒施用之前、之后或同时使用。与编码其 中一种以下基因产物的载体协同使用的痘病毒的递送将对靶组织具有合 并的抗肿瘤效果。备选地，可以将痘病毒基因工程改造为病毒载体以包 括治疗性多核苷酸。许多蛋白质包含于本发明中，其中一些在下面描述。 表7列出了可以为一些与本发明联合的基因疗法所靶向的多种基因。

细胞增生诱导物.取决于功能，诱导细胞增生的蛋白质进一步分 为多种类型。所有这些蛋白质的共性是它们调节细胞增生的能力。例如， 一种形式的PDGF即sis癌基因蛋白，是一种分泌型生长因子。癌基因极 少从编码生长因子的基因产生，并且目前，sis是仅有的已知天然出现 的致癌生长因子。在本发明的一个实施方案中，考虑将针对特殊的细胞 增生诱导物的反义mRNA用于防治该细胞增生诱导物的表达。

蛋白质FMS、ErbA、ErbB和neu是生长因子受体。这些受体的突变 导致可调控功能的丧失。例如，影响Neu受体蛋白的跨膜结构域的点突 变导致了neu致癌基因。erbA致癌基因是源于甲状腺激素的细胞内受体。 经修饰的致癌ErbA受体被认为是与内源性甲状腺激素受体竞争，引起不 受控制的生长。

最大的一类致癌基因包括信号转导蛋白(例如，Src、Abl和Ras)。 Src蛋白是一种胞质蛋白酪氨酸激酶，在一些情形中其通过527号酪氨 酸残基处的突变实现从原癌基因转化为致癌基因。相反，在一个实例中， GTP酶蛋白ras从原癌基因转化为致癌基因是由序列中的12号氨基酸从 缬氨酸突变为甘氨酸引起。

Jun、Fos和Myc蛋白是作为转录因子直接对核行使功能的蛋白质。

细胞增生的抑制基因.肿瘤抑制致癌基因用于抑制多度的细胞增 生。这些基因的失活破坏了它们的抑制活性，导致不受调控的增生。肿 瘤抑制基因p53、p16和C-CAM在下面描述。

除了先前已经描述过的p53，另一种细胞增生抑制物是p16。主要 的真核细胞周期的转换由周期蛋白依赖性激酶(或CDK)引发。一种CDK， 周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)调控通过G₁期。这种酶的活性可以在G₁晚期将使Rb磷酸化。CDK4活性受激活亚基D型细胞周期蛋白以及受抑 制亚基控制，p16^INK4已经在生物化学上鉴定为特异性结合并抑制CDK4， 并因而调节Rb磷酸化的蛋白质(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。 由于p16^INK4蛋白是CDK4抑制剂(Serrano，1993)，这种基因的缺失可 以增加CDK4的活性，导致Rb蛋白的过度磷酸化。p16也已知能调控CDK6 的功能。

p16^IKN4属于最新描述的一类CDK-抑制性蛋白，该类蛋白还包括p16^B、 p19、p21^WAF1和p27^FIP1。p16^INK4基因对应于9p21，其为许多肿瘤类型中常 常缺失的染色体区域。p16^INK4基因的纯合子缺失和突变在人肿瘤细胞系中 很频繁。这种迹象表明p16^INK4基因是肿瘤抑制基因。然而，这种解释受 到观察到p16^INK4基因改变频率在初始的未培养肿瘤比在培养的细胞系中 更低这个现象的挑战(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等， 1994；Kamb等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto等，1994； Nobori等，1994；Orlow等，1994；Arap等，1995)。通过用质粒表达 载体转染恢复野生型p16^INK4功能见少了一些人肿瘤细胞系的集落形成 (Okamoto，1994；Arap，1995)。

可以根据本发明采用的其它基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、 WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、 rsk-3、p27、p27/p16融合基因、p21/p27融合基因、抗凝血(例如，COX-1、 TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fins、trk、ret、 gsp、hst、ab1、E1A、p300、涉及血管发生的基因(例如，VEGF、FGF、 血小板反应素、BAI-1、GDAIF或它们的受体)和MCC。

程序化细胞死亡调控剂.凋亡或程序化细胞死亡是正常胚胎发 育、维持成人组织中的稳态和抑制致癌作用所必需的程序(Kerr等， 1972)。Bcl-2家族的蛋白和ICE样蛋白酶已经证明是其它系统中的凋 亡的重要调控剂和效应物。发现与滤泡性淋巴瘤相关的Bcl-2蛋白在控 制凋亡和增强细胞响应各种凋亡刺激而存活中起显著的作用(Bakhshi 等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等， 1985；Tsujimoto和Croce，1986)。现在认识到在进化上保守的Bcl-2 蛋白是相关蛋白质的家族的一个成员，该家族的蛋白质可以分为死亡激 动剂或死亡拮抗剂。

在其发现后，人们发现Bcl-2抑制由多种刺激引发的细胞死亡。而 且，现在很清楚存在着Bcl-2细胞死亡调控蛋白家族，该家族的蛋白质 具有相同的结构和序列同源性。这些不同的家族成员已经显示类似于 Bcl-2的功能(例如，BC1_XL、Bc1_w、Bc1s、Mc1-1、A1、Bf1-1)或抵消 Bcl-2的功能并促进细胞死亡(Bax、Bale、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。

D.手术

大约60％有癌症的患者将进行一些类型的手术，包括预防性、诊断 性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术是一种可与其它疗法，例 如本发明的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗 法和/或备选疗法协同使用的癌症治疗。

治愈性手术包括其中将癌性组织全部或部分物理移除、切断和/或 破坏的切除术。肿瘤切除术指物理移除至少部分的肿瘤。除了肿瘤切除 术，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制 手术(莫氏手术)。进一步考虑本发明可以与浅表癌、初期癌或附带量 的正常组织的移除协同使用。

切除全部癌性细胞、组织或肿瘤的部分后，可能在身体上形成空洞。 治疗可以通过用额外的抗癌疗法灌注、直接注射、间接注射或局部应用 于该区域来完成。这种治疗可以例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或 每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12 个月重复一次。这些治疗也可以使用不同的剂量。

E.其它制剂

考虑可以将其它制剂与本发明联合使用以提高治疗的疗效。这些额 外的制剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体上调和间隙连接的制剂、 细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增生细胞对凋亡 诱导剂的敏感性的制剂或其它生物制剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子； 干扰素α、β和γ；IL-2及其它细胞因子；F42K及其它细胞因子类似 物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES以及其它趋化因子。进一步考 虑细胞表面因子或它们的配体，例如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL (Apo-2配体)的上调将通过建立对过度增生细胞的自分泌或旁分泌效果 而加强本发明的凋亡诱导能力。通过提高间隙连接的数目增加细胞间的 信号传导将增加对邻近过度增生细胞群体的抗-过度增生效果。在其它实 施方案中，细胞生长抑制或分化剂可以与本发明联合使用以提高治疗的 抗过度增生效果。考虑将细胞粘附的抑制剂来提高本发明的效力。细胞 粘附抑制剂的实例是黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐它丁。进一步考虑 可以将增加过度增生细胞对凋亡的敏感性的其它制剂，例如抗体c225与 本发明联合使用来提高治疗效力。

Apo2配体(Apo2L，也成为TRAIL)是肿瘤坏死因子(TNF)细胞因 子家族的一个成员。TRAIL激活许多类型的癌细胞中的快速凋亡，而对 正常细胞无毒性。TRAIL mRNA在多种组织中出现。大多数正常细胞看上 去对TRAIL的细胞毒作用有抗性，暗示存在可以保护免于TRAIL诱导的 凋亡的机制。描述的第一种TRAIL抗体(称为死亡受体4(DR4))含有 胞质内的“死亡结构域”；DR4传导由TRAIL携带的凋亡信号。已经鉴 定了结合TRAIL的其它受体。一种称为DR5的受体含有细胞质内的死亡 结构域并很像DR4的传导凋亡信号。DR4和DR5mRNA在许多正常组织和 肿瘤细胞系中表达。最近，已经鉴定了诱骗受体例如DcR1和DcR2，其 阻止TRAIL通过DR4和DR5诱导凋亡。这种诱骗受体因而代表了一种新 的用于调控对直接位于细胞表面的促凋亡细胞因子的敏感性的机制。这 种抑制性受体在正常组织中的优选表达暗示TRAIL可以用作抗癌剂，在 癌细胞中诱导凋亡而在伤害正常细胞。(Marsters等，1999)。

在引入细胞毒性化学治疗药物后，癌疗法中已经有很多进展。然而， 化学疗法的其中一个后果是耐药性表型的产生/获得以及多重耐药性的 产生。耐药性的产生仍然是这种肿瘤的治疗的一个主要障碍并因而，显 然需要备选的方法，例如基因疗法。

与化学疗法、放射疗法或生物疗法协同使用的其它形式的疗法包括 高温治疗，高温治疗是一种将患者组织曝露于高温(高达106°F)的方 法。外部或内部加热器可能涉及给局部的、区域性的或整个身体施加高 温。局部高温治疗涉及对小面积区域，例如肿瘤施加热。热可以用来自 体外装置的靶向肿瘤的高频波在外部产生。内部加热可能涉及无菌探针， 包括细的、加热的金属丝或具有温水的空心管、植入的微波天线或射频 电极。

将患者的器官或四肢加热进行区域性治疗，其用产生高能的装置， 例如磁铁来完成。备选地，可以移出一些患者的血液并加热，然后灌流 进将进行内部加热的区域。在癌已经扩展至整个身体的情形中，也可以 加热整个身体。温水毯(Warm-water blanket)、热蜡、有感线圈和热 处理室可以用于该目的。激素疗法也可以与本发明协同使用或者与先前 描述的任意其它癌疗法联合使用。激素的使用可以在某些癌(例如乳腺 癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌)的治疗中使用以降低或阻断某些激 素例如睾酮或雌激素的效果。这种治疗通常与至少一种其它的癌疗法联 合使用作为一种治疗选择或用于降低转移风险。

VIII.实施例

下列实施例包括在内用以说明本发明的优选实施方案。本领域的那 些技术人员应该理解，在接下来的实施例中公开的技术显示，由本发明 者发现的技术在本发明实践中很好的发挥作用，并因此可认为构成了用 于其实践的优选模式。然而，本领域的那些技术人员根据本公开内容应 该理解，公开的特殊实施方案可进行许多改变并仍然获得类似或相似的 结果而不会背离本发明的精神和范围。

实施例1：材料和方法

病毒和细胞系.一组野生型痘病毒株(Wyeth、Western Reserve (WR)、USSR、Tian Tan、Tash Kent、Patwadangar、Lister、King、IHD-W、 IHD-J和Evans)由Geoff Smith博士，Imperial College，London惠 赠。人腺病毒血清型5(Ad5)从ATCC获得。WR的病毒生长因子(VGF) 缺失型株(vSC20)由Bernie Moss博士，NIH惠赠。WR的胸苷激酶缺失 型株(vJS6)和WR的TK-、VGF双缺失型株(wDD)在Puhlmann等，(2000) 和McCart等，(2001)中描述。表达荧火虫荧光素酶的WR株由Gary Luker 博士(Uni Michigan)惠赠。

痘苗株JX-963通过将含有大肠杆菌gpt和人GM-CSF基因(分别处 于p7.5和pSE/L启动子的控制下)的pSC65质粒重组进WR的vSC20(VGF 缺失型)株的胸苷激酶基因中而构建。在X-Gal中繁殖该病毒后进一步 选择白斑而产生具有无功能lacZ的病毒(lacZ从vSC20的VGF内表达)。 正确插入TK基因中和lacZ功能的丧失通过测序验证，而GM-CSF通过 ELISA检验。

表达荧光酶的wDD通过将具有处于p7.5启动子控制下的荧光酶的 pSC65质粒插入vSC20构建。生物发光用IVIS 50系统(Xenogen， Alameda)检验。

人肿瘤细胞系包括A2780(卵巢癌，从ECACC获得)、A549(肺癌， 从ECACC获得)、HCT116、HT-29和SW620(结肠癌，从ATCC获得)、HT-1080 (纤维肉瘤，从ATCC获得)、LNCaP(前列腺癌，从ATCC获得)、PANC-1(胰 腺癌，从ATCC获得)、MCF-7(乳腺癌，从ATCC获得)。非变异细胞包括 MRC-5(肺成纤维细胞，从ATCC获得)、Beas-2B(支气管上皮细胞，由 Tony Reid，UCSD惠赠)以及从Clonetics(Walkersville，MD)获得的原 代正常细胞NHBE(正常人支气管上皮细胞)和SAEC(小气道支气管上皮 细胞)。

鼠肿瘤细胞系包括CMT 64(C57/B6肺癌，从Cancer Research UK 获得)、JC(BALB/c乳腺癌，从ATCC获得)、MC38(C57/B6结肠癌，从 NIH获得)和TIB-75(BNL IME A.7R.1)(BALB/c肝癌，从ATCC获得)。 细胞系NIH 3T3和过表达H-Ras的NIH 3T3细胞系由Richard Marais(ICR， London)惠赠。先前已经描述了兔肿瘤细胞系VX2(Kidd，1940；Tjernberg， 1962；Chen等，2004)。

体外复制和细胞病变效应测定法.将细胞系以5×10⁶细胞/孔接 种进6孔板中并保留过夜。然后将病毒以1.0个噬斑形成单位(PFU)/ 细胞的感染复数(MOI)加入并让其感染2小时。在感染结束时，更换培 养基并将板孵育48小时，然后将细胞刮落进培养基中并收集。通过三轮 的冻融，然后进行超声处理溶解细胞，随后将粗的病毒溶解物的系列稀 释物加至BSC-1细胞以滴定病毒。噬菌斑测定法如先前描述的(Earl等， 1998)进行。腺病毒在A549细胞(Earl等，1998)上滴定。试验通常 一式三份进行。

为了评估病毒的细胞病变效应(CPE)，将细胞以1000个细胞/孔 接种于96孔板中并让其附着过夜。然后将要试验的病毒的系列稀释物加 至该板中(MOI从100-0.001)，一式三份，并将该板另外孵育72小时。 在这之后，用无血清的培养基代替培养基并将MTS(Promega)加至该板 中。在孵育2-4小时后，在ELISA酶标仪上读取450nm下的吸光度。细 胞病变效应测定为试验孔相对于仅含有细胞(100％存活)和无细胞的孔 (0％存活)的生存力减少。结果表示为50％的细胞层存活时的MOI(50％ 有效浓度，EC50)。

小鼠同系和异种移植肿瘤模型试验.免疫活性小鼠用同系肿瘤 细胞(1×10⁶个细胞/小鼠)经皮下植入，这样JC和TIB-75细胞移植 进BALB/c小鼠中，CMT64细胞移植进C57/B6小鼠中。某些人异种移植 模型涉及将1×10HT29个细胞皮下移植进SCID小鼠(所有小鼠为8-10 周大，并且性别相配)中。一旦肿瘤达到50-100mm³，按照指示将小鼠 重新分组并处理。肿瘤大小通过测径器测量。

用表达荧光酶的病毒处理的小鼠可以用IVIS 100系统(Xenogen， Alameda)成像。在成像前，将小鼠腹膜内注射荧光素(30mg/kg)并麻 醉(2％异氟烷)。

在治疗后标明的时间杀死一些小鼠并回收器官用于病毒生物学分 布或免疫组织化学试验。对于病毒的生物学分布，将器官快速冷冻并磨 碎，随后如描述的进行噬菌斑测定法。对于免疫组织化学试验，在福尔 马林中固定器官，随后包埋于石蜡块中用于切片。切片用苏木精和伊红 (H&E)以及病毒外壳蛋白抗体(对于腺病毒处理的小鼠，使用多克隆 抗-痘苗抗体或多克隆抗壳粒抗体)染色。

兔模型.先前已经描述了将VX2肿瘤移植进新西兰白兔的肝脏并 通过CT和超声扫描测量肿瘤的发展和转移至肺部(Paeng等，2003)。

细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)测定法.这通过将经标记的从按指 示进行处理的兔获得的外周血淋巴细胞(PBL)与VX2肿瘤细胞混合来进 行。4小时后，通过碘化丙丁啶染色和流式细胞仪测量细胞凋亡。

中和抗体测定法.抗痘苗中和抗体的产生在从处理后的兔获得的 血浆中测量。将血浆稀释物与1000PFU的痘苗混合过夜，随后加入含有 A2780细胞的96孔板中。在72小时后，通过MTS测定法测量细胞活力。 病毒中和作用测量为防止病毒失活所需的血浆稀释度。

统计分析.用广义Wilcoxin检验比较卡普兰-迈耶曲线。肿瘤响应 率(Tumor response rate)和无转移率(metastasis-free rate)通常 用费歇尔精确检验比较。

实施例2：大鼠肿瘤模型

将大鼠(斯普拉-道来氏大鼠，雄性)曝露于它们饮用水(175mg/L) 中的致癌物质(N-亚硝基吗啉，NNM)8周，在该期间发生了肝硬化，随 后平均在16-20周之间在肝内原位产生了肿瘤(肝细胞癌或胆管癌)(模 型先前在Oh等，2002中描述)。肿瘤检测和评价通过有经验的超声检 查操作者利用超声成像进行。在治疗即将开始前的基线时肿瘤直径大约 为0.75-1.5cm；肿瘤体积在基线时在对照和治疗组之间没有显著差 别(估计平均体积是400-500mm³)。对照动物(n＝17)不接受治疗，而 受治疗的动物(n＝6)接受静脉内注射(经由尾静脉)，注射在合成的早 晚期启动子控制下表达人GM-CSF(在Mastrangelo等，1999中描述的病 毒构建体)的痘病毒(Wyeth株；存在胸苷激酶基因缺失)。病毒以10⁸噬菌斑形成单位(如Earl等，1998中进行滴定)的剂量施用，总体积 为0.75ml(病毒悬液与10mM Tris混合直到期望体积)，在60秒内 通过尾静脉静脉内注射。治疗每两周重复一次，总共三次(第1、15和 29天)。

在开始治疗后的十周内，对照种类大小显著增加直至平均为大约 3000mm³(标准误差为500)(FIG.1)。由于此时肿瘤的发展，为伦理原 因需要处死对照动物。所有肿瘤大小已经显著增加。相反，6个受治疗 的肿瘤中有5个完全退化(低于超声检测极限)。治疗组中的平均体积 为大约50mm³(标准误差＜10；相对对照p＜0.01)。

实施例3：兔VX2肿瘤模型

在VX2兔癌模型中进行了一个研究(如Paeng等，2003中描述的)。 选取兔是因为先前证明人GM-CSF在兔中具有显著的生物学活性(与小鼠 相反)。让VX2肿瘤在新西兰白兔的肌肉中生长并从1-2mm的肿瘤片段 分离细胞，再悬浮于0.1ml生理盐水中并在肝包膜下注射(21号针头； 注射位点用具有荷包缝合线的手术补片覆盖)，并且让其生长14天直至 形成原发性肿瘤(平均直径1.5-2.0cm；估计体积2-4cm³)在标准 的burst测定法中，证明VX2细胞离体可以受痘苗病毒感染。肿瘤大小 通过CT扫描和超声实时监控。在后面7周，对照动物(未治疗)动物(n＝18) 在肝脏内发生了肿瘤发展，估计的平均体积达到大约100cm³(标准误差 大约为20cm³)。而且，发生了许多肿瘤转移并随时间过去在肺和肝内变 得可以检测。到第7周，对照动物全部具有可检测的转移瘤，肺转移瘤 的平均数是17个(标准误差2.3)。这些对照动物的生存中值是55天 (受治疗动物治疗开始后)，并且全部在80天内死亡。

在第一次试验中的受治疗动物(n＝3)接受单次静脉内注射(经由 尾静脉)，注射在合成的早晚期启动子控制下表达人GM-CSF(在 Mastrangelo等，1999中描述的病毒构建体)的痘病毒(Wyeth株；存 在胸苷激酶基因缺失)。病毒以10⁹噬菌斑形成单位(如Earl等，1998 中进行滴定)的剂量施用，总体积为7ml(病毒悬液与10mM Tris混 合直到期望体积)，在60秒内通过尾静脉静脉内注射。在第7周，与对 照动物相反，受治疗的动物没有可通过CT扫描检测的肺转移瘤(FIG.2A -2B)。存活率也显著增加。到治疗开始后110天，生存中值没有达到， 并且大约70％仍旧存活。

在第二个试验中受治疗的动物(每组n＝6)接受三次每周一次的静 脉内注射(经由尾静脉)，注射在合成的早晚期启动子控制下表达人 GM-CSF(在Mastrangelo等，1999中描述的病毒构建体，在此将该文献 通过引入作为参考)的痘病毒(Wyeth株；存在胸苷激酶基因缺失)JX-594、 具有胸苷激酶和痘苗病毒生长因子缺失的痘苗病毒WR株wDD(如McCart 等，1999描述的wDD)或具有胸苷激酶和痘苗病毒生长因子缺失并且从 合成的早晚期启动子表达人GM-CSF的痘苗病毒WR株JX-963。病毒以10⁸个噬菌斑形成单位(如Earl等，1998中进行滴定)的剂量施用，总体 积为7ml(病毒悬液与10mM Tris混合直到期望体积)，在60秒内通 过尾静脉静脉内注射。到第7周，与对照动物相反，用JX-963治疗的动 物没有可通过CT扫描检测的肺转移瘤(相对对照p＜0.01)。JX-594治 疗的动物平均具有8个肺部肿瘤(标准误差为2；相对对照p＜0.05)。 wDD治疗的动物平均具有5个肺部肿瘤(标准误差为2；相对对照p＜0.05)。 值得注意的是，与该剂量的JX-594相反JX-963和wDD对肝脏中的原发 性肿瘤生长(图3)，并且JX-963明显地增加了这些动物的存活率(图 5)。

表达GM-CSF的病毒JX-963比其不表达GM-CSF的对照wDD具有显 著更好的对抗原发性肿瘤和肺部转移瘤的效力；2)表达GM-CSF的病毒 JX-963比表达GM-CSF Wyeth株对照(尽管JX-594中不存在另外的vgf 基因缺失)具有显著更好的对抗原发性肿瘤和肺转移瘤的效力。因而， 静脉内施用表达人GM-CSF的痘苗导致比没有GM-CSF的相同痘苗有显著 更好的效力，并且血管内施用表达GM-CSF的WR株缺失型突变体比表达 GM-CSF的Wyeth株显著更好。

实施例4：JX-963的系统性癌效力

靶向疗法很有希望用于治疗癌症，但是由于靶分子的突变和/或肿 瘤通过冗余途径逃逸而频繁产生耐药性，仍需要新的药物。溶瘤病毒是 其复制能力固有地或通过基因工程改造而受限于恶性细胞类型的病毒 (Thorne等，2005)¹。选择性的肿瘤内复制导致病毒增殖，通过独特且 凋亡依赖性机制(溶癌作用)杀死受感染细胞并扩散病毒至其它肿瘤细 胞。病毒治疗法因而具有有效治疗顽固性癌的潜力并且通过局部或区域 性施用几种溶瘤病毒获得了临床概念验证(Parato等，2005)²。然而， 要使溶瘤病毒对患者存活率有大的影响，将需要系统性效力和静脉内递 送。

本发明因而采取了分步的设计和开发策略来产生更有效的系统性 药剂。首先，本发人鉴定了痘病毒(例如痘苗病毒)为已经进化为系统 性扩散并且对补体和抗体的清除有抗性的病毒物种(Smith等，1997； Buller和Palumbo，1991)。痘苗病毒具有完全确定的机制来使得能在 血液中运输而不致失活并且可以在组织内快速传播，人类在天花根除的 战争中利用痘苗病毒也具有悠久的历史。在接种程序过程中使用了一组 痘苗病毒，并且筛选了一些相关病毒株在正常细胞(NHBE)和肿瘤细胞 (A2780)中的复制能力。AU痘苗株在肿瘤细胞系中比在正常细胞中复 制达到更高水平(图6A)，但是治疗指数(肿瘤与正常细胞的复制比) 在病毒株之间不同。实验室广泛使用的病毒株(例如Western Reserve (WR))比它们的亲本痘苗病毒株(Wyeth)倾向于展示更高的固有种类 选择性这是第一次野生型痘苗株在肿瘤细胞系中相对于在正常细胞中 显示固有的更优的复制。然而，并不是所有病毒都这样，因为腺病毒血 清型5(Ad5)(大多数临床中的溶瘤病毒的骨架)不显示这种选择性(图 10A)。

溶瘤剂的另一属性是快速的肿瘤内扩散(Wein等，2003)。这可以 通过短的复制周期和容易从受感染细胞释放病毒来实现。因而在注射后 较早的时间点(72小时)检验了痘苗病毒WR株破坏肿瘤细胞的能力并 将其与Ad5和溶瘤腺病毒株d11520(ONYX-015)(Heise等，1997)相比 较(图6B)。相对于Ad5和d11520两者，WR在该时刻在肿瘤细胞中展 示了高达5-logs的增加的杀死潜能，以及比任一种腺病毒株具有更高的 肿瘤选择性。

迄今试验的大多数溶瘤病毒的主要局限性是在系统性递送后不能 有效地感染肿瘤，正如在静脉内递送1×10⁹个噬斑形成单位(PFU)的Ad5 至小鼠中的皮下肿瘤模型中时所观察到的(图6C和图10B)；这相当于 在70kg的人中3.5×10¹²PFU的剂量，比曾施用给患者的都要高。在肿 瘤中病毒复制很少或没有病毒复制(通过在递送病毒后48小时和72小 时后对病毒衣壳蛋白进行免疫组织化学染色测定)。然而，在这些相同 的模型中痘苗株WR可以有效地运送至肿瘤病感染肿瘤，在治疗48小时 内多达50％的肿瘤细胞染色为阳性。此外，痘苗病毒能够在肿瘤细胞中 继续存在至少10天(图10B)，尽管到该时间应该已经引发了免疫应答。

为了使安全性最大化，特别是对于给免疫缺陷的癌患者静脉内施 用，将减毒的且肿瘤靶向的遗传缺陷引入进病毒中。本发明先前已经描 述了在痘苗病毒胸苷激酶(TK)基因中插入序列的病毒基因以及TK和病 毒生长因子(VGF)双缺失型病毒基因的优先在肿瘤中表达(Puhlmann 等，1999；McCart等，2001)。尽管这些缺陷型的靶向机制先前没有阐 明，但是基本原理是使病毒复制和癌细胞溶解作用局限于具有升高的E2F 水平(因为E2F源于细胞的胸苷激酶基因产物(Hengstschlager等， 1994))和表皮生长因子(EGF)受体途径激活(因为VGF激活该途径是 有效的病毒复制所必需的(Andrade等，2004))的癌细胞。这里显示 TK和VGF双缺失型病毒(wDD)展示了惊人的破坏多种不同起源的肿瘤 细胞的能力(图7)。还发现TK或VGF基因任一种中的单缺失削弱了痘 苗病毒在非-增生性、非-变异性人细胞系中的复制，而双缺失型病毒 (wDD)进一步削弱该能力(图11)。这些病毒株都没有削弱它们在人 肿瘤细胞中复制的能力。

进一步发现VGF-缺失型病毒在非-增生性、非-变异性细胞系中复制 的能力的阻断可以在表达激活的H-ras的细胞中克服(图8A)。发现H-ras 激活甚至导致WR的复制增加(p＝0.0094)并且发现VGF缺失没有抑制 H-ras激活的细胞中的病毒复制，而TK缺失则产生了抑制(p＝0.016)。 这表明通过wDD中的基因缺失引入的肿瘤选择性不仅仅是对增生性细胞 的简单优选，因为如果缓慢增生或甚至非增生性细胞在EGF-R/Ras/MAP 激酶信号传导途径中含有突变则它们可能被靶向。

为了确定双缺失型痘苗病毒(wDD)是否可能通过靶向正常的增生 细胞(例如肠上皮细胞、骨髓或卵巢细胞)而产生毒性，通过非侵入式 生物发光成像(图8B)研究了体内的病毒基因表达并且在杀死后检查了 病毒的生物分布(图12)。在静脉内递送1×10⁷PFU表达荧光酶的WR或 wDD后进行的生物发光成像显示，两种病毒展示了类似的初始感染和病 毒基因表达模式(包括脾、肺、肝和肿瘤)(图8B)。然而，来自wDD 的生物发光信号从大多数器官而不是从肿瘤快速清除，即使是在免疫缺 陷型小鼠中，而WR在靶器官中继续复制并扩散至其它组织，包括骨髓、 皮肤和脑(图8B和8C)。尽管wDD确实在肿瘤外边产生一些感染点， 但这些感染点短暂出现或在后期出现，表明是继发性扩散而没有复制(数 据没有显示)。从用1×10⁹PFU的wDD(WR的致死剂量)进行静脉内处 理的小鼠的组织回收感染性病毒单位揭示，到处理后第8天肿瘤展示出 增加的病毒滴定度，每mg组织比任何其它器官多于超过1000倍的病毒 拷贝，而所有正常组织低于检测极限或显示下降的病毒滴定度(图12)。

随后在免疫活性小鼠模型中分析了wDD的抗肿瘤效果。当两者都经 静脉内递送时，wDD比Wyeth TK缺陷型痘苗病毒株(临床试验中最常用 的痘苗病毒株，通常用作疫苗)具有显著更好的抗肿瘤效果(图13)。 进一步的研究显示，在通过系统性注射或肿瘤内注射至携带人肿瘤异种 移植物的免疫缺陷型小鼠和携带同系肿瘤的免疫活性小鼠时，1×10⁹PFU 的wDD都能有显著的抗肿瘤效果(图13)。

为了增加wDD的抗肿瘤潜力以及抑制在静脉内给药时血管化的显微 肿瘤沉积物(microscopic tumor deposit)的过度生长，将细胞因子 GM-CSF插入进TK基因的位点内(处于合成的E/L启动子控制下)；将 这种病毒命名为JX-963。由于人GM-CSF在啮齿动物中没有活性而在家 兔中有活性(Cody等，2005)，为了评估对抗大很多的可复制转移的原 发性肿瘤的活性，将JX-963用于具有原发性(VX2)肝肿瘤和肺转移瘤 的家兔模型(Kim等，2006)中。正如在小鼠模型中，1×10⁹PFU的静脉 内注射的wDD具有显著的抗肿瘤效果(图9A)。wDD也能抑制显微肺转 移瘤的过度生长。为了评价由于伴随的GM-CSF表达引起的额外效力，将 JX-963直接与wDD相比较。JX-963产生了更大的对抗原发性肿瘤的效力， 并且完全阻断了肺转移瘤的过度生长。通过ELISA在JX-963处理的小鼠 的血浆中检测到了GM-CSF(数据没有显示)。除了直接的癌细胞溶解效 果，还发现JX-963通过引起对抗VX2肿瘤细胞的CTL应答而交叉保护 动物对抗肿瘤(图9B)。

使用痘苗病毒作为抗肿瘤剂的一个关心的问题是，即使系统性递送 至肿瘤最初在未受过处理的个体(na□ve individual)是可能的，但先 前曝露于病毒而引起的免疫应答可能抑制随后的治疗的效力。在试验家 兔中，初次感染的3周内产生了强的抗病毒抗体(图14)。为了研究形 成中和抗体后重复给药的可行性，对4只已经初次响应治疗但是在治疗 停止4周后具有肿瘤发展的家兔进行了再次治疗。初次治疗后静脉内递 送1×10⁹PFU的JX-963导致4只经处理的动物中的3只原发性肿瘤大小 降低(图9C)。

因此，通过选择已经进化成通过造血系统扩散的痘苗病毒，以及筛 选肿瘤选择性复制的病毒株，本发明人能够发现能系统性肿瘤递送的具 有快速溶癌细胞效果的病毒。为了提高这种病毒的安全性，引入了能增 加其治疗指数的几种缺陷型病毒株，描述了它们作用的机制以及在体内 检验了它们的生物分布。系统性递送后对抗大的原发性肿瘤的惊人的治 疗效果得以证明。最后，由于不可能所有肿瘤细胞都受到感染，即使在 系统性递送病毒后，从这种病毒骨架表达GM-CSF。发现GM-CSF的加入 增加了这种病毒对抗原发性肿瘤的效力，防止微小转移灶的过度增生， 并且产生抗肿瘤CTL应答。这表明，JX-963这种病毒能够系统性递送至 肿瘤，在肿瘤中其快速且有效地破坏肿瘤组织，而回避正常的器官，并 且同时在肿瘤中诱导了能识别原位产生的肿瘤抗原的免疫应答。重复给 药进一步显示通过直接的溶癌作用或通过加强抗肿瘤免疫应答而产生了 额外的抗肿瘤效果。因而，JX-963具有治疗多种肿瘤的潜力。

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根据本公开内容，可以产生和执行所有在此公开和要求的组合物和 方法而不需要过多的实验。虽然本发明的组合物和方法是根据优选的实 施方案来描述，本领域的那些技术人员将理解可以对所述的组合物和/ 或方法进行改变，以及在在此描述的方法的步骤或步骤的顺序中进行改 变而不背离本发明的概念、精神和范围。更特别是，应该理解在化学和 生理学两者上都相关的某些试剂可以替代在此描述的试剂，而将获得相 同或类似的结果。对本领域技术人员明显的所有类似的取代和修饰被认 为是在由附带的权利要求书定义的本发明的精神、范围和概念内。

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