PD-1和TIM-3序贯阻断逆转T细胞凋亡在GM-CSF锚定疫苗治疗转移性膀胱癌的实验研究

摘要

研究目的:
　　膀胱癌是泌尿系统中威胁人类健康最常见的恶性肿瘤，肌层浸润性膀胱癌危害尤甚。膀胱癌治疗后的高复发率及其恶性进展的可能与肿瘤微环境(TME)中缺乏肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)以及肿瘤细胞通过免疫逃逸机制逃避了免疫细胞的杀伤密切相关。
　　肿瘤疫苗是通过多种方式将肿瘤抗原接种至宿主体内以获得主动免疫反应，从而产生抗肿瘤作用。前期研究中，利用细胞膜表面易被生物素化以及生物素与链亲和素(Streptavidin，SA)天然强有力结合的特性，成功地将带有SA的细胞因子锚定于肿瘤细胞表面而制备成了一种新型肿瘤细胞疫苗。前期研究结果证实该疫苗能有效激活T细胞，但始终存在一部分小鼠的肿瘤消退不明显。
　　程序性死亡因子1受体/配体(PD-1/PD-L1)是体内重要的协同刺激分子，已被证实可通过抑制T细胞的活化和增殖而负调控免疫应答。
　　T细胞免疫球蛋白和黏附蛋白-3(Tim-3)是Tim家族成员之一，当与其天然配体半乳糖凝集素-9结合可引发辅助性T细胞功能下降，从而负性调节机体的抗肿瘤能力。
　　结合前期研究工作和现有研究进展，本实验拟探究SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗治疗后小鼠TME中是否发生与PD-1、Tim-3表达相关的免疫逃逸;研究PD-1和Tim-3的表达对CD8+TILs功能的影响;评估PD-1、Tim-3序贯靶向阻断联合疫苗对晚期膀胱肿瘤的治疗效果，并探讨相关的免疫学机制。
　　研究方法:
　　利用蛋白修饰细胞表面的技术制备SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗。通过对肿瘤大小的观察比较，以及CTL、流式分析、免疫组化、ELISA等检测方法，评估疫苗或疫苗联合靶向共刺激分子阻断治疗转移性膀胱肿瘤的效果以及探究相关的免疫学机制。
　　研究结果:
　　1.通过已成瘤的小鼠皮下模型证实SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗能够通过诱导脾脏中DCs的成熟激活CD8+TILs，但无法明显抑制皮下已成瘤的肿瘤生长。
　　2.该疫苗能够上调CD8+TILs表面PD-1和Tim-3的表达，同时也能以IFNγ依赖的形式上调TME中PD-L1的表达。
　　3.该疫苗联合抗PD-1抗体较单独治疗能够明显抑制小鼠皮下肿瘤的生长，但总体应答率较低(12.5％)。
　　4.PD-1靶向阻断能够上调CD8+TILs表面Tim-3的表达。
　　5.PD-1+Tim-3+CD8+TILs的增殖和分泌能力明显低于其他亚型，PD-1-Tim-3+CD8+TILs的分泌能力较低，但具备良好的增殖能力。
　　6.抗PD-1抗体和抗Tim-3抗体序贯靶向阻断联合新型疫苗能有效增强机体对肿瘤细胞的特异性杀伤，降低促肿瘤生长的progranulin和IL-6的分泌，减少CD8+TILs的凋亡，从而有效抑制小鼠皮下肿瘤的生长，提高治疗的应答率(45.8％)。
　　研究结论:
　　抗PD-1抗体和抗Tim-3抗体序贯靶向阻断联合SA-GM-CSF膜修饰的膀胱肿瘤细胞疫苗能够有效抑制晚期膀胱肿瘤的生长。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 疫苗的制备及其生物学活性检测

2．1 实验材料及方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 研究结论

第三章 疫苗治疗转移性膀胱癌

3．1 实验材料及方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

3．4 研究结论

第四章 疫苗治疗后肿瘤微环境中的免疫逃逸

4．1 实验材料及方法

4．2 实验结果

4．3 讨论

4．4 研究结论

第五章 疫苗联合PD-1靶向阻断治疗转移性膀胱癌

5．1 实验材料及方法

5．2 实验结果

5．3 讨论

5．4 研究结论

第六章 PD-1和Tim-3表达对CD8+TILs功能的影响

6．1 实验材料及方法

6．2 实验结果

6．3 讨论

6．4 研究结论

第七章 PD-1和Tim-3序贯靶向阻断联合疫苗治疗转移性膀胱癌

7．1 实验材料及方法

7．2 实验结果

7．3 讨论

7．4 研究结论

全文总结和展望

参考文献

博士学位期间成果

致谢

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