一种干酪乳杆菌及其在固态发酵中的应用

摘要

本发明涉及一种干酪乳杆菌及其在固态发酵中的应用。所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)是从酸马奶中分离得到的耐酸和耐胆汁酸的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.1697。本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)能实现在固态发酵方面的应用，特别是作为发酵剂在乳制品、健康食品、微生物饲料以及动物保健制品中的应用；本发明的干酪乳杆菌菌体存活率提高的方法，是一种优化固态培养基的方法，能得到较高的菌体密度和菌体存活率；本发明的干酪乳杆菌固态发酵活菌数是液体MRS发酵活菌数的二十倍以上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离自内蒙古民族传统乳制品——酸马奶中的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)菌株、该菌株在固态发酵中的应用以及菌体存活率提高的方法。

技术背景

众所周知，作为一种益生菌，乳杆菌以其所具备的优良的益生特性，诸如：耐酸性、耐受胆汁酸、在消化道中定殖生长以及缓解乳糖不忍耐症、抗变异突变、降低血清胆固醇、抗肿瘤、抑制肠道病原菌和抗Helicobacter pylori、改善肠道菌群和提高机体免疫功能等已经被广泛应用于食品发酵、动物饲料及医疗保健等领域中。

20世纪90年代以来，随着能源危机与环境问题的日益严重，固态发酵技术以其特有的优点引起人们极大的兴趣。固态发酵领域的研究及其在资源环境、蛋白质饲料中的应用取得了进展，目前它已在生物能的转化、固态废弃物的处理、代谢产物的生产以及微生态制剂等方面均得到了广泛的应用，其中微生态制剂的关键就是要保证在制剂中有足够多的活菌数，以保证其发挥益生菌的作用。

本发明针对上述课题，从内蒙古传统功能性发酵乳——酸马奶中分离乳杆菌，采用体外耐酸性试验、耐胆酸盐试验、降胆固醇试验等一系列试验筛选一株具有潜在益生作用的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)，并通过优化固态培养基的方法达到较高菌体密度，烘干后得到了较高的菌体存活率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌，所述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei Zhang)是从酸马奶中分离得到的耐酸和耐胆汁酸的益生菌；该菌菌株已于2006年4月21日，在地址为中国北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.1697。

本发明的另一目的在于提供该菌株在固态发酵方面的应用，特别是作为发酵剂在乳制品、健康食品、微生物饲料以及动物保健制品中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种所述干酪乳杆菌菌体存活率提高的方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种干酪乳杆菌，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)是从酸马奶中分离得到的耐酸和耐胆汁酸的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.1697。

一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的应用，所述干酪乳杆菌在固态发酵中的应用。

一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)菌体存活率提高的方法，包括以下步骤：

a.菌种的活化：

将-84℃冷冻保存的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)活菌体制剂约0.1ml接种于5ml MRS液体培养基中，在30℃培养24小时，传代培养3次；

b.菌悬液的制备：

取步骤a中传代培养3次后的MRS液体，用无菌生理盐水离心洗涤3次，然后用无菌生理盐水定容至5ml，并振荡均匀制成菌悬液；

c.固态培养基的配制：

将培养基各成份加入250ml三角瓶中，然后加入PH值为6.5的自来水，用玻璃棒搅拌均匀，在121℃灭菌30分钟，然后备用；

d.接种与培养：

取步骤b制备好的菌悬液，按2％接种于固态培养基中，同时对种子液进行平板计数，作为固态发酵的起始种子浓度，然后将固态培养基在30℃培养24-72小时，每隔12小时翻料一次；

e.MRS固体平板稀释计数及PH的测定：

将步骤d的培养物2g加20ml无菌生理盐水振荡，然后用无菌生理盐水稀释至10⁷、10⁸或10⁹倍(一般要稀释到每ml有30-300cfu/ml才是有效计数范围，所以对于不同的样品可能稀释不同的倍数)制成菌悬液；吸取1ml稀释后的菌悬液加入到培养皿中，倒入融化后冷却至50℃左右的MRS琼脂并混匀，待其完全凝固后，置于30℃培养48小时后计数；

f.发酵干燥：

取5g培养物为一个样品置于鼓风干燥箱中进行干燥，每个样品均干燥至含水率为10％以下，所述干燥温度为30-45℃，干燥时间为5-7小时。

本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)除具有一般乳杆菌的益生特性外，还将该菌株应用到固态发酵方面，通过对固态培养条件的优化获得了较高的菌体密度与菌体存活率。

本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)在37度24小时的液体MRS发酵活菌数约为0.8～2.0×10⁹cfu/ml(每毫升样品中含有的细菌群落总数)，而在固态发酵中活菌数为4.56×10¹⁰cfu/ml；由此可知，本发明的干酪乳杆菌固态发酵活菌数是液体MRS发酵活菌数的二十倍以上。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明；以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：一种干酪乳杆菌，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)是从酸马奶中分离得到的耐酸和耐胆汁酸的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.1697。

1.样品的采集和乳杆菌的分离鉴定。

样品为传统方法制作的酸马奶，样品采集于中国内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗。

2.样品中乳杆菌的分离和纯化：乳杆菌的分离纯化过程如下。

以内蒙古传统功能性发酵乳——酸马奶为乳杆菌分离样品，将牧民家庭自然发酵制作的酸马奶，在其发酵容器中充分搅拌后，用带有灭菌吸头的移液器，吸取2mL放入带有胶塞的灭菌小试管(15mm×150mm)中封口，再吸取1mL放入带螺旋帽并装有灭菌CaCO₃粉的无菌、容积为2mL的采样瓶中，拧紧螺旋帽作为备用样品。将收集的样品放入冰盒内冷却，间隔一定时间更换冰袋，保持在较低温度下带回实验室并放置于4℃冰箱内，尽快将乳酸菌进行分离。

将乳酸菌分离时，用灭菌吸管吸取1mL酸马奶样品接种于10mL灭菌石蕊牛乳培养基中，置于30℃恒温箱内增菌培养至酸化凝固，在培养基颜色变为粉红时将其取出，用灭菌接种环划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基(日本荣研株式会社制品)上，再放入gaspak厌氧培养罐中，置于30℃条件下，培养48～72小时；待菌落形成后，用接种环或接种针挑取菌落，接种于TPY液体中，置于30℃条件下，培养24～48小时；待菌株生长良好后，再次划线接种于BL琼脂培养基中，置于30℃条件下，培养24～48小时，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性的杆菌暂定为乳杆菌，并进一步接种于TPY液体中，置于30℃条件下培养24小时，经TPY液体(培养液)传代培养三次后，取5ml乳杆菌培养液，离心洗涤(3,000rpm 10min)，同法继续2～3次，在离心洗涤过的菌体中加入2～2.5ml菌体保护液并采用冷藏、-84℃冻结保存或低温真空冷冻保存。

将从酸马奶样品中分离的乳杆菌菌株，经生理生化学试验、乳酸旋光性测定等一系列试验分析鉴定，并将鉴定后的菌株分别制成供试菌液，吸取菌悬液10μL接种于5mL PH值为3.5的MRS液体培养基，置于37℃条件下进行24h培养；同时吸取菌悬液1.0mL与9.0mL PH值为3.0的人工胃液[制备法：NaCl 0.2％、胃蛋白酶(pepsin，sigma)0.35％，用1mol/L HCl调整PH值为3.0后，过滤除菌备用]混合后，置于37℃条件下进行培养，分别在开始(0h)和3h后取样用BCP琼脂培养基(日本荣研株式会社制品)测定活菌数，并计算菌株存活率。通过以上方法筛选出具有高耐酸性生长和耐胃酸的乳杆菌菌株，并进一步测定其在不同人工胃液和肠液中的存活能力以及通过体外耐胆盐试验和降低胆固醇试验，获得一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)菌株。

乳杆菌的鉴定：分离纯化的乳杆菌，经生理生化学特性分析和16S rDNA序列分析的方法鉴定，该干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的生物学特性见表1。

表1 Lactobacillus casei Zhang的生物学特性

实施例2：一种如实施例1所述的干酪乳杆菌的应用，所述干酪乳杆菌在固态发酵中的应用；特别是作为发酵剂在乳制品、健康食品、微生物饲料以及动物保健制品中的应用。

本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)具有较强的耐性和耐酸生长特性、能够耐受人工胃肠消化液，尤其在脱脂乳液中能够耐受pH2.0的人工胃液，能耐受的胆盐浓度达0.6％；

由于本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的这种特性，所述干酪乳杆菌在乳制品中的应用有其重要意义；乳酸菌产生的酸性代谢产物使肠道环境偏酸性，而一般消化酶的最适pH值为偏酸性(淀粉酶6.5、糖化酶4.4)，这样就有利于营养素的消化吸收，有机酸的产生还可加强肠道的蠕动和分泌，也可促进消化吸收养分，研究表明食用酸奶的人群对乳糖的利用率比食用含相同乳糖浓度的牛奶要高，从而减轻乳糖的不耐受症状。

此外乳酸菌的抗癌作用也有不少报道。更重要的是，由于对乳酸菌代谢和遗传特性了解的深入以及对其机理的认识，还有大量临床试验的结果证明将其作为保健辅佐剂，饲料添加剂的可行性，人们已经广泛接受了乳酸菌这类保健制品。另外，口服是益生菌进入肠道的主要途径，所以益生素在进入大肠之前必须经受胃中盐酸和小肠中高浓度胆盐的影响，只有在盐酸和胆盐中成活率高的菌株才可发挥作用；同时，产品中稳定的活菌数或者微生态制剂中活菌的数量是其发挥作用的关键，所以，活菌制剂的应用要求单位产品达到一定的活菌数，以符合有效治疗剂量标准。

因此，该菌株适用于功能性发酵乳制品的生产，也可作为功能性食品添加剂或保健制剂应用于调节免疫功能的各个方面。

实施例3：一种如实施例1所述的干酪乳杆菌菌体存活率提高的方法，包括以下步骤：

a.菌种的活化：

将-84℃冷冻保存的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)活菌体制剂约0.1ml接种于5ml MRS液体培养基中(MRS培养基：蛋白胨10g牛肉膏10g酵母浸粉5g葡萄糖20g磷酸氢二钾2g  乙酸钠5g柠檬酸三钠2g吐温(80)1g硫酸镁200mg硫酸锰54mg蒸馏水1000mL，用1N HCl调整MRS培养基液体的PH值至6.5，在121℃灭菌15分钟备用)，在30℃培养24小时，传代培养3次。

b.菌悬液的制备：

取步骤a中传代培养3次后的MRS液体，用无菌生理盐水离心(3000r/min、10min)洗涤3次，然后用无菌生理盐水定容至5ml，并振荡均匀制成菌悬液。

c.固态培养基的配制[干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的固态培养基优化方案]：

设计一个9因素4水平的正交实验，将培养基各成份加入250ml的三角瓶中，然后加入PH值为6.5的自来水(用1N HCl调PH至6.5)，用玻璃棒搅拌均匀，在121℃灭菌30分钟，然后备用；各培养基组成见表2。

表2 Lactobacillus casei Zhang在不同固态培养基中30℃、48小时的发酵情况 单位：克

注：试验接入的种子量为1.0×10⁷cfu/g干料。

由表2结果显示，所述步骤c中固态培养基各成份按其重量比为：

豆粕          3-6

麸皮          4-7

乳清粉        0.6-2.4

葡萄糖        0.2-0.5

碳酸钙        0.1-0.4

硫酸铵        0.004-0.02

硫酸镁        0.002-0.01

水            5-8。

固态培养基水份的确定：将固态培养基营养成份定为4g豆粕+5g麸皮+0.6g乳清粉+0.3g葡萄糖+0.3g碳酸钙+0.02g硫酸铵+0.01g硫酸镁，然后分别添加自来水40％、45％、50％、55％、60％[以上述营养配方(不包括水)为基准的质量比]，重复步骤1～5，得到结果如表3。

表3 Lactobacillus casei Zhang在30℃、48小时不同水份条件下的发酵情况

注：试验接入的种子量为1.0×10⁷cfu/g干料，以上数据均为三次试验的平均值。

由表3可见，选定的固态培养基中适合于干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiZhang)生长的最佳水份为55％，在此水份下干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiZhang)可达到2.36×10¹⁰cfu/g干料，起始接种量为1.46×10⁷cfu/g干料。

在本实施例中，所述步骤c中最佳培养基各成份按其重量比为：

豆粕              4

麸皮              5

乳清粉            0.6

葡萄糖            0.3

碳酸钙            0.3

硫酸铵        0.02

硫酸镁        0.01

水            7

在此培养基中干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)可达到5.11×10⁹cfu/g干料，起始接种量为4.75×10⁶cfu/g干料。

d.接种与培养：

取步骤b制备好的菌悬液，按2％(v/w)接种于固态培养基中，同时对种子液进行平板计数，作为固态发酵的起始种子浓度(10⁶～10⁷cfu/g)，然后将固态培养基在30℃培养24-72小时，也可以将固态培养基在30℃培养48-60小时，每隔12小时翻料一次。

固态培养基培养时间的确定：将固态培养基营养成份定为4g豆粕+5g麸皮+0.6g乳清粉+0.3g葡萄糖+0.3g碳酸钙+0.02g硫酸铵+0.01g硫酸镁+7g自来水。

重复步骤1～5，然后分别在24、36、48、60、72小时测活菌数，得到结果如表4。

表4 Lactobacillus casei Zhang在固态培养基中30℃不同发酵时间的发酵情况

注：试验接入的种子量为1.0×10⁷cfu/g干料，以上数据均为三次试验的平均值。

由表4可见，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)最佳生长时间为60小时，在此时干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)可达到4.56×10¹⁰cfu/g干料，起始接种量为1.26×10⁷cfu/g干料。

e.MRS固体平板稀释计数及PH的测定：

取步骤d的培养物2g加20ml无菌生理盐水振荡并用无菌生理盐水稀释至10⁷、10⁸或10⁹倍(一般要稀释到每ml有30-300cfu/ml才是有效计数范围，所以对于不同的样品可能稀释不同的倍数)制成菌悬液；吸取1ml稀释后的菌悬液加入到培养皿中，倒入融化后冷却至50℃左右的MRS琼脂并混匀，待其完全凝固后，置于30℃培养48小时后计数；同时取2g固体培养基加20ml蒸馏水，振荡均匀后用PH计测定PH值，结果见表2。

本发明最终固态条件确定为：4g豆粕+5g麸皮+0.6g乳清粉+0.3g葡萄糖+0.3g碳酸钙+0.02g硫酸铵+0.01g硫酸镁+7g自来水。换算为百分比为：23.2％豆粕+29.0％麸皮+3.5％乳清粉+1.7％葡萄糖+1.7％碳酸钙+0.12％硫酸铵+0.058％硫酸镁+40.6％自来水[以上百分比均为质量/质量，且比例均为以全料(包括水在内的所有物料)为基准的质量比]。

本发明固态培养基最后定为：23.2％豆粕+29.0％麸皮+3.5％乳清粉+1.7％葡萄糖+1.7％碳酸钙+0.12％硫酸铵+0.058％硫酸镁+40.6％自来水[以上比例均为以全料(包括水在内的所有物料)为基准的质量比]。

将自来水调整pH值为6.5后，按40.6％加入已装入三角瓶中的固态培养基中，用玻璃棒搅拌均匀。在121℃灭菌30min，按2％(v/w)接种于固态培养基中，同时对种子液进行平板计数，固态培养基在30℃培养60小时，每隔12小时翻料一次；取样并平板计数，在此时干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)可达到4.56×10¹⁰cfu/g干料，起始接种量为1.26×10⁷cfu/g干料。

f.发酵干燥：

取5g培养物为一个样品置于鼓风干燥箱中进行干燥，每个样品均干燥至含水率10％以下，所述干燥温度为30-45℃，干燥时间为5-7小时。

本发明为了保证干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)固态发酵完成后，在烘干干燥过程中有较高的存活率，干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiZhang)固态培养后干燥温度通过如下实验进行选择。

在上述确定的发酵条件下，固态培养干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiZhang)培养完毕后，平板计数，同时取5g培养物为一个样品，置于鼓风干燥箱中进行干燥，每个样品均干燥至含水率10％以下。

1.干燥后含水率的测定：

含水率＝(样品干燥前质量-样品干燥后质量)/样品干燥前质量×100％。待烘干干燥后，对每个样品取2～3g，置于马福炉中在103℃烘干2小时，然后冷却称重，得到每个样品的水分含量，结果见表5。

2.干燥后活菌数的测定。

待干燥后对每个样品取2g分别置于带玻璃珠的20ml无菌生理盐水中振荡30min，然后用无菌生理盐水稀释至10⁷、10⁸或10⁹倍(一般要稀释到每ml有30-300cfu/ml才是有效计数范围，所以对于不同的样品可能稀释不同的倍数)制成菌悬液，吸取1ml稀释后的菌悬液加入到培养皿中，倒入融化后冷却至50℃左右MRS琼脂，混匀。待完全凝固后，置于30℃培养48小时后计数，结果见表5。

3.存活率的测定。

存活率＝(干燥后活菌数/干燥前活菌数)×100％，由以上数据得到结果见表5：

表5 Lactobacillus casei Zhang在固态培养基中发酵后不同干燥温度下的存活率

注：试验接入的种子量为1.0×10⁷cfu/g干料，以上数据均为三次试验的平均值。

由表5数据可知，发酵结束后，在35℃下干燥5.5小时，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的含水率从53.4％降为8.57％，存活率可达到17.51％。

本发明确定了干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiZhang)固态发酵后最佳干燥条件为35℃、5.5小时，固态培养基含水率降为8.57％，该菌的存活率可达到17.51％。