用于对细胞进行损伤处理的机械损伤器

摘要

本发明涉及一种用于对细胞进行损伤的多通道机械损伤器，包括：销支持体1；多个平行排列的销2，其与销支持体连接，所述销伸出销支持体的长度可调节；和手柄3，其与销支持体连接。在本发明的一个方面，其中销支持体上设有多个孔5，销可插入所述孔内。所述销适于可更换的一次性吸头。本发明的多通道机械损伤器还可具有位于销支持体1两侧的导向件4，其角度可调节。具体的，本发明提供了一种适用于96孔微量板形式培养的细胞损伤试验的8通道机械损伤器。本发明还提供了使用所述多通道机械损伤器对细胞培养物进行损伤的方法和其在在研究细胞迁移及其潜在的生物学现象中的应用。

说明书

发明领域

本发明涉及一种用于对细胞进行损伤的多通道机械损伤器。具体的，本发明提供了一种用于96孔微量板形式培养的细胞的损伤试验的8通道机械损伤器。

背景技术

细胞迁移在多种正常生理过程中起着重要作用。这些过程包括胚胎形成、血管形成、损伤愈合、肠粘膜损伤修复和免疫防御。例如动脉硬化或胃肠道溃疡等一些病理情况中，常发现大面积的细胞剥脱，因此需要立即重建完好的单层细胞进行修复。

细胞迁移是一个复杂过程，需要多种细胞内和细胞外事件的协调，例如细胞骨架再组织、基质重建、细胞间黏着的调节以及化学引诱剂的诱导。

损伤试验是在研究细胞迁移及其潜在的生物学现象中的一种常用方法，如基质重建或细胞极化。另外，损伤试验还被用于研究血管生成、恶性肿瘤转移和其它生理及病理过程。

但是，许多情况下，细胞迁移的研究常常涉及铺满的单层细胞对于机械伤害(机械损伤)的反应。通常通过用吸液头、刀片、注射针头、机械摩擦器或刮刀除去生长在各个盖玻片上或多孔板内的一定比例的铺满细胞，以造成细胞损伤(参见Obeso JL，Auerbach R：A newmicrotechnique for quantitating cell movement in vitro using polystyrenebead monolayers.J Immunol Methods 1984，70(2)：141-52；和Sholley MM，Gimbrone MA Jr，Cotran RS：Cellular migration and replication inendothelial regeneration：a study using irradiated endothelial cultures.LabInvest 1977，36(1)：18-25)。然后可以用显微镜配制的数码相机或计算机成像系统观察、测量和量化一段时间内剥脱区域的闭合情况，也就是所称的上皮重新生成、内皮重新生成或损伤愈合的情况。

但是，多数损伤方法需要分别处理各个样品孔。没有简单的方法可以对铺满的细胞产生多个并且一致的机械损伤，用于筛选多种样品。因此，需要一种高通量的损伤方法以达到这一目的。

发明内容

本发明提供了一种用于对细胞进行损伤的多通道机械损伤器，适用于对多孔细胞培养板的方式培养的细胞进行机械损伤。它可以在各个孔的相同位置产生大小均一、形状一致、易于定量的损伤。

本发明的多通道机械损伤器包括：

销支持体1；多个平行排列的销2，其与销支持体1连接，所述销伸出销支持体的长度可调节；和手柄3，其与销支持体连接。其中销伸出销支持体的长度的调节可通过调节销的长度进行。

在本发明的一个方面，其中销支持体上设有多个孔5，销可插入所述孔内，并通过销支持体上的螺丝6对销进行固定和调节其伸出销支持体的长度。

在本发明的另一方面，所述销适于可更换的一次性吸头。

在本发明的另一方面，所述多通道机械损伤器还具有位于销支持体1两侧的导向件4，其角度可调节。例如可通过销支持体1上的螺丝7对导向件4进行固定和调节角度。

本发明的一个优选方案中，多通道机械损伤器为8通道机械损伤器，包括：

销支持体1，其设有8个孔；

8个平行排列的销2，其插入销支持体的孔5内，通过销支持体上的螺丝6固定所述销和调节所述销伸出销支持体的长度；

手柄3，其垂直固定于销支持体上；和

导向件4，其位于销支持体两侧，通过销支持体1上的螺丝7对导向件4进行固定和调节角度。

在本发明的一个方面，本发明的8通道机械损伤器中销的直径为3.5±0.1mm，每个销相距9±0.5mm，两个导向件之间的距离为8.2cm。在一个例子中，其中手柄为12cm长的中空不锈钢管。

在本发明的一个方面，所述多通道机械损伤器由不锈钢制成。

本发明还提供了对细胞进行损伤的方法，包括：

a.将可更换的一次性吸头装在本发明的多通道机械损伤器的销上；

b.对销的长度进行调节，使得每个吸头伸出的长度相同，以便同时与细胞培养皿的孔的底部表面接触；

c.调节两个导向件的工作角度，以使销和其上的一次性吸头位于各个培养孔的中央线；

d.将损伤器的一次性吸头垂直放置在细胞培养皿的同一排的各个孔的一端，然后将损伤器横向移动至其相对一端；

e.任选重复同样的过程，直至细胞培养皿的上所有排的孔内的细胞都经过刮损。

在上述方法的一个方面，其中所述一次性吸头为p-10吸液头。

在上述方法的一个方面，其中所述细胞为单层细胞。所述细胞可以为HUVEC细胞或IEC-6细胞。

本发明的多通道机械损伤器可由不锈钢制成，因此整个损伤器可以通过高压加热进行灭菌。本发明的多通道机械损伤器具有多个平行排列的销2，其伸出销支持体1的长度分别可调节，这一设计可确保各个销，当配备吸头时，所有吸头与多孔细胞培养板的各个孔的底部同时良好接触。本发明的多通道机械损伤器的销支持体1可含有孔5，可以将销2插入各个孔内，通过销支持体上的螺丝6对销进行固定和调节其伸出销支持体的长度。销支持体1两侧可具有两个导向件4。导向件4工作角度可以调节，以确保销位于各个培养孔的中央线。可通过销支持体1上的螺丝7对导向件4进行固定和调节角度。在销上可插入可更换的一次性吸头，其与多孔细胞培养板的底部良好接触，对细胞产生一致的损伤。一次性吸头可以防止交叉污染，并避免吸头因重复用于损伤细胞而变钝。所述吸头可以是塑料吸液头，其具有几个优点：1)该吸头具有足够的弹性和硬度，可确保吸头与孔表面良好接触，2)吸头的平滑度可确保不对孔表面造成严重的机械损坏，3)吸头便宜并且可以买到。本发明的多通道机械损伤器具有手柄3，垂直固定于销支持体上。

在本发明的一个方面，提供了一种8通道机械损伤器，适用于对96孔微量板的方式培养的细胞进行机械损伤。此损伤器的销2与一次性的p-10吸液头相匹配。此器具由不锈钢制成，整个损伤器可以通过高压加热进行灭菌。手柄3永久性地垂直固定于销支持体1上。销支持体设有8个孔5，将销插入每个孔内，通过销支持体上的六角螺丝6对销2进行固定和调节其伸出销支持体的长度。使用8个可个别调节的销2，这一设计可确保当机械损伤器配备吸头时，各个吸头与96孔微量板的各个孔的底部同时良好接触。此损伤器适用于96孔板，两个导向件4的工作角度也是可以调节的，可确保销位于各个培养孔的中央线。这些销2与一次性的p-10吸液头相匹配。

本发明还提供了用上述8通道机械损伤器对细胞培养物进行损伤的方法，包括：

a.将p-10吸液头装在销上；

b.用六角扳手通过六角螺丝6对每个销伸出的长度进行调节，使得每个一次性吸头伸出的长度相同，以便与细胞培养皿的孔的底部表面同时接触；

c.通过六角螺丝7调节两个导向件4的工作角度，以使销和其上的p-10吸液头位于各个培养孔的中央线；

d.将损伤器的p-10吸液头垂直放置在细胞培养皿的同一排的各个孔的最左端，然后将损伤器横向移动至最右端；

e.任选重复同样的过程，直至细胞培养皿的上所有排的孔内的细胞都经过刮损。

在本发明的一个方面，所述方法用于对单层细胞进行损伤处理。其中所述细胞可以为HUVEC细胞或IEC-6细胞。

本发明还提供了使用上述多通道机械损伤器在研究细胞迁移及其潜在的生物学现象中的应用。

本发明的上述概述并不意味着代表了本发明的每一个实施例或者各个方面。通过以下列出的详细说明和附图，本发明的其它特点和优点将会变得显而易见。

附图说明

图1.本发明的8孔机械损伤器

手柄3垂直固定于销支持体1上。销支持体1设有8个孔5，平行排列的销2插入每个孔内，通过六角螺丝6固定和调节销2伸出的长度。销支持体两侧上有两个导向件4，两个导向件的工作角度可以通过六角螺丝7调节。

图2A插上吸头的机械损伤器照片

图2B.损伤器的销的调节.

每个销伸出的长度通过六角螺丝进行调节。通过这样细微的调节，可以确保每个吸头伸出的长度相同，以便与孔的底部表面连贯接触。

图3.工作状态的损伤器.

将机械损伤器垂直放置在同一排内每个孔的最左端，然后水平移向最右端。对每一排孔重复相同的过程。

图4A和图4B.8通道机械损伤器的效果.

图4A损伤后整个96孔板的图象。将IEC-6细胞接种在96孔板上过夜，接种密度为4×10⁴。用8通道损伤器进行刮损，从而产生损伤。损伤后，用Hemacolour 3对这些细胞染色，仔细观察整个板。

图4B各个孔内损伤的统计分析。损伤之后，为检查损伤的一致性，立即测量各个孔内的损伤的宽度。96孔板内每个损伤的平均宽度为600μm，SD为36.6。

图5A和图5B.损伤后IEC-6细胞的迁移.

图5A损伤的IEC-6细胞在表皮生长因子(EGF)(20ng/ml)或DL-α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO)(5mM)存在或不存在的情况下，处理24小时。在0时间点、损伤16小时后及损伤24小时后拍摄愈合的显微照相图。

图5B EGF和DFMO对于IEC-6细胞迁移的作用以损伤闭合百分比反映。结果用平均值±平均值的标准偏差表示。相对于介质对照，p＜0.001。

图6A和图6B.损伤后HUVEG的迁移。

图6A FBS处理前后受损HUVEC的显微照相图。用不同浓度的FBS(0％、1％和20％)对受损HUVEC处理24小时，在0时间点、损伤后16小时及损伤后24小时拍摄显微照相图。

图6B FBS对于HUVEC迁移的效果通过损伤闭合百分比反映。结果用平均值±平均值的标准偏差表示。相对于介质对照，p＜0.001。

具体实施方式

尽管本发明容易受到各种改变和可替换形式的影响，但是我们通过附图中的例子给出了具体的实施方式并且在此作了详细说明。然而需要明白的是，本发明并不意味着局限于所公开的特定形式。而是，本发明包括在所附的权利要求书所限定的本发明精髓和范围之内的所有变形物、等同物和替代物。

如图1中给出了本发明其中一个实施方式的8通道机械损伤器，适用于对96孔微量板的方式培养的细胞进行机械损伤。

整个器具由不锈钢制成，可以通过高压加热进行灭菌。手柄3为12cm长的中空不锈钢管，垂直固定于销支持体1上。销支持体1设有8个孔5，平行排列的销2插入每个孔内，每个孔对应一个销，通过六角螺丝6固定和调节销2伸出的长度。使用8个销2，这些销的直径为3.5±0.1mm，适于一次性的p-10吸液头。每个销平行排列在销支持体上，相距9±0.5mm(中心间距)。销支持体两侧上有两个导向件4。两个导向件之间的距离设为8.2cm，等于96孔培养板(Iwaki，代码：3860-096)的宽度。两个导向件的工作角度可以通过六角螺丝7固定和调节，确保销位于各个培养孔的中央线。

使用时，用六角扳手调节六角螺丝，从而调节每个销伸出的长度。通过这样细微的调节，可以确保每个吸头伸出的长度相同，以便与孔的底部表面同时连贯接触。

对细胞进行损伤前，将p-10吸液头装在销上，每个销的伸出长度可以用六角扳手通过六角螺丝进行调节，使得平行排列的p-10吸液头与培养孔表面能够同时接触。这一设计，再加上塑料吸头具有适当的硬度和弹性，可以大大加强吸头与培养孔表面的良好接触，确保对单层细胞产生连贯、一致的损伤。

对细胞损伤进行损伤操作时，将吸液头装在损伤器上，垂直放置在同一排内各个孔的最左端，然后将损伤器横向移动至最右端。重复同样的过程，直至每一排的细胞层都经过刮损。

此机械损伤器已用于评价对在96孔板内培养的人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)和大鼠肠道上皮细胞(IEC)的单层细胞进行损伤的效果以及用于研究损伤后HUVEC细胞和IEC细胞的迁移。

实验方法和材料

细胞系和细胞培养物

大鼠肠道上皮细胞株(IEC-6细胞；ATCC CRL 1592)。IEC-6细胞株源于肠小囊细胞，按形态学和免疫学标准判断。储备细胞培养物保持在75cm²培养瓶内的Dulbecco改良Eagle介质(DMEM)中，补充10％的胎牛血清(FBS)，10μg/ml胰岛素和50μg/ml硫酸庆大霉素。将这些细胞在37摄氏度下于加湿的二氧化碳培养器(5％二氧化碳)中培养。第14代至20代细胞用于实验研究。

人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自Clonotics(TCS Biologicals，UK)。HUVEC在M199介质中培养，补充20μg/ml内皮细胞生长补充剂(ECGS)，20％热钝化胎牛血清(FCS)，1％青霉素-链霉素(PS)，50ng/ml两性霉素-B和90μg/ml肝素，在涂有0.1％明胶的培养瓶上培养。将这些细胞于37摄氏度下在于加湿的二氧化碳培养器(5％二氧化碳)中培养。第2代至7代细胞用于实验研究。

材料

Dulbecco改良Eagle介质(DMEM)、FBS、FCS、磷酸盐缓冲液(PBS)、青霉素-链霉素(PS)、胰蛋白酶、硫酸庆大霉素、胰岛素和丙酮酸钠从Invitrogon(Carlsbad，California，USA)获得。M199介质，内皮细胞生长补充剂(ECGS)、肝素、两性霉素-B和表皮生长因子(EGF)由Sigma获得(Saint Louis，Missouri，USA)。Matrigel由BDBioscionce(Palo Alto，California，USA)获得。Hemacolour 3购自Merck，而DL-α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO)购自Calbiochem(USA)。

细胞损伤试验

将IEC-6细胞接种在96孔平底微量板内(Iwaki，代码：3860-096)，密度为每孔4×10⁴个细胞，预先用PBS稀释的Matrigel(1∶7(v/v))覆盖过夜。在补充了10％FBS的DMEM中培养24小时后，将这些细胞在不含血清的介质中再培养24小时。为进行HUVEC的损伤试验，将细胞接种在预先涂有0.1％明胶的96孔平底微量板(Iwaki，代码：3860-096)内，密度为每孔3×10⁴个细胞。用装有p-10吸液头(Axygen，T-30)的8通道机械损伤器刮损单层细胞，造成细胞剥脱区域。用六角扳手调节六角螺丝，对销的长短进行校正，以保证吸头与孔的底部之间连贯的接触。在导向件的帮助下，将损伤器固定在96孔板上，使每个通道(吸液头)位于同一排8个孔内同样的深度水平。损伤期间，将损伤器从孔的左侧内部边缘移到孔的右侧内部边缘(图3)，将单层细胞刮损。然后，每个孔内沿孔的直径形成锐利的损伤。对96孔板的每一排孔重复该损伤过程(图4A)。然后，对于对照孔，用新鲜的无血清介质代替孔内介质；对于IEC-6细胞，用含有20ng/ml EGF或5mM DFMO的新鲜无血清介质代替孔内介质；对于HUVEC，用不同百分比的FBS代替孔内介质。

图像捕获

通过捕获细胞图象，可以观察受损单层细胞的情况。

通过以不同的时间间隔捕获细胞迁移图象，可以容易地对细胞迁移程度定量。拍摄0时间点的图像，以记录最初的损伤宽度，在16小时后和24小时后，利用Motic图像及2.0软件定量(Motic InstrumentsInc.，Richmond，Canada)对于因细胞向剥脱区域的迁移而导致的受损单层细胞的恢复进行评价。细胞向损伤的迁移用损伤闭合百分比表示。

损伤闭合百分比＝[(Wt₀-Wt_16 or 24)/Wt₀]×100％

其中，Wt₀＝0是刮损后立即测得的损伤宽度，Wt_16 or 24是刮损后16小时或24小时测得的损伤宽度

统计分析

每项试验至少进行三次，每一种处理重复8份。数据以平均值±标准偏差表示。采用斯氏t检验进行统计分析。p＜0.05，则认为有显著性差异。

用本发明的细胞损伤器，并用肠上皮细胞(IEC-6)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为模型，根据上面描述的细胞培养和损伤操作方法，在96孔板内验证本发明的细胞损伤器对培养的细胞进行损伤操作的效果，特别是评价其产生损伤的一致性。

通过捕获细胞图象，可以观察受损单层细胞的情况。拍摄受损单层细胞的图像，测量每个损伤的宽度。从图4A可以看到每个孔的中央有一致的损伤痕迹。96孔板中每个损伤的尺寸分布如图4B所示，平均宽度为600μm，标准偏差为36.6。

结果证明此损伤器使用一次性的塑料吸液头，可于96孔板中每个孔的中央部分均匀地剥脱每个孔内一定面积的单层细胞，平均的损伤大小为600±36.6μm。

用本发明的细胞损伤器，研究细胞迁移促进剂(EGF或FBS)或细胞迁移抑制剂(DFMO)对于愈合的影响。

1.受损IEC-6细胞的重构过程

IEC-6细胞常被用作损伤试验中的细胞模型，因为其具有迁移性质，能显示出典型的损伤愈合反应。为了模拟肠道中上皮损伤的恢复，用损伤器除去IEC-6单层细胞中的部分细胞，在造成损伤后的16小时和24小时观察由于细胞迁移导致的剥脱区域的恢复情况。引入可能调节IEC-6细胞迁移性质的物质，以进一步评价这种损伤器的适用性。DFMO是一种已知的细胞迁移抑制剂，DFMO抑制鸟氨酸脱羧酶并减少聚胺的合成。由于在恢复的早期需要聚胺，所以缺乏聚胺会影响细胞迁移。另一方面，选择EGF作为细胞迁移的诱导剂。在本实验的损伤体系中，IEC-6细胞对于DFMO和EGF的作用具有典型的反应[图5A和5B]。对照细胞损伤后16小时的损伤闭合百分率大约为60％，而EGF处理的细胞损伤后16小时的损伤闭合百分率增加至90％；DFMO处理的细胞损伤后16小时的损伤闭合百分率下降至仅33％。损伤后24小时，损伤闭合的百分率进一步增加。对照细胞损伤后24小时的损伤闭合百分率为76％，而EGF处理的细胞损伤后24小时的损伤闭合百分率几乎为100％；DFMO处理的细胞损伤后24小时的损伤闭合百分率仅大约50％。本发明的损伤系统清楚地显示出，处理后24小时，EGF对IEC-6细胞迁移的促进作用和DFMO对IEC-6细胞迁移的抑制作用。因此，本损伤系统可用于细胞迁移诱导剂或抑制剂的大规模筛选。

2.受损HUVEC细胞的重构过程

HUVEC常用于研究血管生成和损伤愈合。在损伤后16小时和24小时观察细胞迁移[图6A]。用不同比例(0％、1％和20％)FBS处理的细胞，迁移速率不同，显示出浓度依赖性的损伤愈合反应[图6B]。仅用介质处理的细胞迁移速率相对较低，24小时后的损伤闭合低于40％，而用20％FBS处理的细胞迁移较快，24小时后损伤完全闭合，用1％FBS处理的细胞迁移速率居中，16小时后损伤闭合为60％，24小时后损伤闭合为72％。

结论

已经成功地证明，本发明的8通道机械损伤器是进行损伤试验有用的工具，可以在96孔微量培养板内，使单层细胞在限定的区域内发生一致而连贯的剥脱。这种容易组装且便于使用者使用的装置非常适用于细胞迁移研究中或损伤愈合试验中高通量的样品筛选。

从以下表1可以看出本发明的8通道机械损伤器和用其对细胞进行损伤的方法相对于传统损伤器和方法的优点。

表1.本发明的8通道机械损伤器和使用与传统损伤器和方法的比较。

  传统的损伤器和方法  本发明的损伤器和方法  吸液头或摩擦器等大多数  损伤器由塑料制成，容易损坏。  本发明的损伤器由不锈钢制  成，非常耐用。  大多数损伤器由于塑料的  性质而不耐高压加热。  本发明的损伤器可经高压加  热。

  很难达到连贯的细胞损伤  效果  本发明的损伤器的销伸出的  长短可以调节，确保吸头与孔表面  可以同时良好的接触，因此可以获  得同时的、连贯的损伤。导向件的  设计能保证每个孔内的损伤位置  一致。  当用金属刮刀进行损伤  时，常对培养孔造成严重的机械  损伤。这样的损伤会严重影响细  胞迁移和图象分析。  用塑料吸液头进行损伤，其弹  性可确保与孔底部表面的连贯接  触，但不会对培养孔造成损伤。  整个试验使用同样的损伤  器(例如刮刀)，交叉污染的机  会相对较大。  用一次性的吸液头，可防止孔  与孔之间的交叉污染，便于大规模  的试验和高通量的筛选。

本发明很容易有各种改动和替换形式，其具体的实施方式已经通过附图中的例子被表示出来并在此作了详细说明。然而，需要明白的是，并不意味着本发明仅局限于所公开的特殊方式，而是相反，本发明的目的是包括了在所附的权利要求书中限定的本发明精髓和范围之内的所有改动、等同物和替代物。