阴离子交换顶替色谱法及在阴离子交换顶替色谱法中作为置换剂化合物的阴离子有机化合物

摘要

一种顶替色谱方法，包括：将含有一种或多种待分离组分的混合物装载到含有阴离子交换材料的固定相上；通过向固定相施加含有聚芳香聚阴离子置换剂化合物的混合物以从固定相上置换出所述一种或多种组分中的至少一种，所述聚芳香聚阴离子置换剂化合物具有通式Cen(Ar)w，其中Cen为中心键或基团，Ar为芳香核，w＝2到一个Cen上位点的最大值，Ar可以被多个An－取代，其中，每一个An－独立地定义为磺酸根、羧酸根、膦酸根、磷酸根、硫酸根；Ar进一步可以被多个G取代，其中G定义独立地为H、C

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有多价有机阴离子盐(多价阴离子)的组合物，以及在阴离子交换顶替色谱纯化中将上述组合物作为置换剂的方法。

背景技术

Tswett在1906年第一次认识到色谱的顶替方式，他发现在过载洗脱色谱的情况下发生样品的置换。在1943年，Tiselius提出，色谱的广泛主题可分为三种截然不同的“方式”：迎头方式、洗脱方式和顶替方式。从那以后，特别是在分析色谱中，大部分的开发和应用是在洗脱色谱领域进行。确实，没有进一步的限定，术语“色谱”现在通常指洗脱方式的色谱。

洗脱方式和顶替方式在理论和应用中很容易区分。在洗脱色谱中，被纯化的样品溶液施加在通常在柱中的固定相上。选择既不是不可逆的吸收又不是完全不吸收，而是可逆地结合的样品作为流动相。当流动相流过固定相时，在流动相和固定相之间建立了一种平衡，由此，根据与固定相的亲和力，样品以能够反映出其相对于可能存在于初始样品中的其它组分的亲和力的速度通过柱子。在标准洗脱色谱中需要特别关注的事实是，洗脱溶剂前沿或等度洗脱中的零柱体积总是先于样品离开柱子。

台阶梯度色谱(step gradient chromatography)是等度洗脱色谱的修正和扩展，在所述台阶梯度色谱中，不同组合物的系列洗脱剂通过固定相。在离子交换色谱中，例如，将流动相中盐浓度和/或pH值的台阶变化用于洗脱或解吸附经历分离的分析物。

顶替色谱使用置换剂化合物以从柱中除去混合物中的组分。置换剂化合物与固定相亲和力通常比待分离混合物中的任何组分高得多。相比在洗脱色谱中，洗脱剂与固定相亲和力比待分离的组分更低。区分顶替色谱和洗脱或解吸附色谱的关键操作特征是置换剂化合物的使用。在顶替色谱中，柱子首先在待分离组分与固定相都具有相对高亲和力的情况下，用载体溶剂进行平衡。将一定体积的进料混合物装载到柱子上，所述进料混合物可以大量且非常稀释，进料混合物中的各个组分将被吸附到固定相上。即，进料混合物中的组分被分布并吸附到固定相上，并保留在那里。如果所有的组分通过置换被溶解，从柱中排出的载体溶剂将不含样品。进料混合物的组分此时停留在固定相中，柱上每个组分的位置与在该组分和初始情况下的固定相的相对亲和力相关联。理论上，一分子任意组分将置换位于固定相上给定点处的亲和力较低的一分子任意不同组分。结果，各个组分将最终以亲和力从最高到最低的顺序排列在柱上。

有时候，使部分进料混合物，如，与固定相没有显著亲和力的组分，通过带有载体溶剂的柱是有利的；在这种情况下，通过顶替色谱，将只有已保留的进料组分被溶解。

一旦样品装载到柱上，含有溶于适当溶剂中的置换剂化合物的溶液将被送入到柱中，以通过固定相。选择置换剂化合物以使其与固定相的亲和力比进料混合物中的任何组分都更高。假设置换剂和流动相选择适当，各个组分作以吸收的亲和力增加的顺序随着高度浓缩的、相对纯的原料的邻近区从柱中排出。在纯化的各个组分区之后，置换剂从柱中排出。通过实事很容易将顶替色谱与洗脱色谱区分开由于置换剂化合物接着样品流出，且进料组分随着高度浓缩的、相对纯的原料的邻近区从柱中排出。

顶替色谱用于工业色谱具有一些特别有利的特性。首先，顶替色谱能够在一个步骤中实现产品的分离和浓缩。相比之下，等梯度洗脱在分离过程中导致显著的产品稀释。第二，由于置换过程是在平衡等温线的非线性区进行操作，高的柱负载是可能的。相比洗脱色谱，这样可以更好地利用柱子。第三，相对于类似的洗脱方法，柱子的开发和组分的分离需要更少的溶剂。第四，顶替色谱能够浓缩和纯化低分离系数的混合物的组分，而在典型洗脱色谱中，得到满意的分辨率需要相对大的分离系数。

由于这些所有的优势，人们可能认为顶替色谱能够被广泛地应用。然而，在顶替色谱中依然存在一些问题。一个问题是：由于每次使用后将固定相丢弃是不经济的，因此，需要再生柱子。另外一个问题是：获得的适宜的置换剂化合物，其应是相对简单的化合物，容易合成和/或可以以合理(经济)的成本商业地获得。相对于洗脱色谱，这两个问题是顶替色谱的显著缺点。

关于再生，由于置换过程使用了与固定相具有非常高亲和力的置换剂化合物，再生和再平衡柱子所需的时间会比洗脱色谱长。而且，再生期间经常需要相对大量的溶剂。相对于洗脱色谱，这些问题大大降低了顶替色谱的优势。

第二个问题，即所获得的可用的置换剂化合物应能够相对容易地合成和/或可以以合理(经济)的成本商业地获得，是由于置换剂化合物既需要与固定相具有高的亲和力，且再生过程中还能够从柱上相对容易地被除去。现有技术提供的此类化合物没有满足这两个重要标准中的一个或两个。已有的各种化合物为低分子量的置换剂，但这些化合物相当难以合成和纯化，且还不能以合理的成本商业地获得，或完全不能商业地获得。

为了使顶替色谱成为主流色谱技术，对于有效的置换剂还存在显著的未满足的需要，所述置换剂的合成和纯化应是简单的，且适于大规模的生产，和/或适于商业应用，并允许固定相有效的再生以使固定相在顶替色谱过程中以后再次使用。

发明内容

现已发现，某种低分子量的带负电荷的有机化合物能够在顶替色谱方法中作为非常有效的置换剂化合物。这样，本发明涉及一种顶替色谱方法和一组阴离子置换剂化合物。依据本发明的阴离子置换剂化合物在顶替色谱方法中作为换剂化合物使用之后，可以从固定相中有效地被除去，允许进行再生和在后来顶替色谱方法中重新使用固定相。而且，这些阴离子置换剂化合物可以通过相对简单直接且经济的合成方法，以良好的收率和高的纯度制得。这样，本发明克服了现有技术顶替色谱方法中的上述问题。

在一个实施方案中，本发明包括作为有机置换剂化合物的芳香聚阴离子化合物(aromatic polyanionic compound)。在一个实施方案中，芳香聚阴离子化合物包括聚芳香聚阴离子化合物(polyaromatic polyanioniccompound)。在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子化合物具有低的分子量。在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子化合物本身为新的化合物，同样作为新的置换剂化合物用于顶替色谱方法中。

在一个实施方案中，本发明涉及含有一种或多种此处描述的置换剂化合物的置换剂组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种聚芳香聚阴离子置换剂化合物，所述化合物具有通式：

Cen(Ar)w

其中Cen＝键、烯基基团、炔基基团、苯环、亚联苯基、萘撑或

其中：

R＝独立地为-H、C₁-C₄烷基或C₁-C₄羟烷基；

Z＝独立地为-H、卤素、-OH、-OR、-NRCH₂CH(OH)CH₂OH、-NR₂、-N[CH₂CH(OH)CH₂OH]₂、-NRC(CH₂OH)₃、-NRCH(CH₂OH)₂或-N(R)(聚(烯化氧))；

w＝2到Cen上可取代位置的最高数值；和

Ar＝(a)、(b)和/或(c)；其中，在下列(a)、(b)和(c)中：

An-＝独立地为磺酸根、羧酸根、膦酸根、亚膦酸根、磷酸根、磷酸单酯或二酯、硫酸根、硫酸单酯或硼酸根；

G＝独立地为H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烯基、C₆-C₁₀芳基、卤素、硝基、羟基、C₁-C₆烷氧基、氰基、-NH₂、-NRH、-NR₂、NHC(O)R、-CHO、-C(O)R；和

(a)，(b)和(c)是：

其中(a)中：x＝1-3、y＝2-4、x+y＝5；和/或

其中在任一(b)中：x＝1-3、y＝4-6、x+y＝7；

和/或

其中在(c)中：x＝1-3；y＝1-3，x+y＝4。

在一个实施方案中，Ar基团的任意两个或多个除了结合到Cen还可以相互结合。在这样一个实施方案中，G形成连接到另一个Ar基团的键。

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子置换剂化合物包括作为连接至Cen的Ar基团的(a)、(b)或(c)中的两个或多个的组合。如上所定义，在任何给出的化合物中，每个An^-，每个G，每个R和每个Z可以独立于每一个其它的An^-、G、R和Z而被选择。从不同的Cen和Ar部分延伸的线或键代表位于每个Ar和与其连接的Cen之间的键。

在一个实施方案中，本发明涉及一种顶替色谱方法，所述方法包括：

将包含至少一种待分离组分的混合物装载到适宜的固定相上；

通过向固定相施加包含阴离子置换剂化合物的混合物，将上述至少一种组分从固定相置换出，所述置换剂化合物包括具有通式Cen(Ar)w的聚芳香聚阴离子化合物，其中Cen、Ar、w及其上的取代基和其它变型定义为如上文关于上述聚芳香聚阴离子化合物所定义。

这样，本发明提供用于顶替色谱的阴离子置换剂化合物，组合物和方法，其满足了有效阴离子置换剂化合物的需要，所述置换剂化合物合成和纯化简单，适于大规模生产，并允许固定相有效再生以使固定相可以有效地再利用。

附图说明

图1是描绘根据本发明的一个实施方案，在牛β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B混合物的顶替色谱过程中，在不同波长下UV/Vis HPLC检测器的输出的曲线图；

图2是描绘根据本发明的一个实施方案，在牛β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B混合物的顶替色谱过程中所收集的馏分的浓度的曲线图；

图3描绘了根据本发明的一个实施方案的多种化合物的结构式。

具体实施方式

应该理解，这里所描述的方法步骤和组合物可以不形成诸如用于实际的应用中的、用以实现顶替色谱方法的完整的系统或工艺流程。本发明可结合当前本领域所使用的合成有机的和顶替色谱技术和设备进行实施，且本申请仅包括对于理解本发明所需要的常规使用的原料、设备和工艺步骤。

此处所用的“卤(halo)”指包含卤素，如氯、溴、氟、或碘的基团。

根据具体情况，此处所用的“烷基”或“亚烃基”指通过除去烷烃分子的一个或两个氢原子而衍生的碳和氢原子的基团。“烷基”或“亚烃基”可以包括带有直链、环状或支链部分的饱和的单价或二价的碳氢化合物基团。“烷基”或“亚烃基”基团可以包括任选的碳-碳双键或三键，其中所述烷基基团包含至少两个碳原子。可以理解是，对于上述烷基基团中的环状部分，至少三个碳原子是需要的。在本发明中，烷基和亚烃基可以包括任意数目的碳原子。在本发明的一个实施方案中，可以使用约20或更少碳原子数。例如，在一个实施方案中，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20碳的烷基基团可以用于本发明。当然，更长的或带支链的烷基基团可以用于本发明。可以使用亚烃基团，例如，在一个实施方案中，其中一个环待由否则为烷基基团的两个基团形成。

此处所用的“芳基”指没有取代的或取代的芳香结构，如苯基、萘基、芴基、菲基等。芳基，当取代时，可以被如这里所定义的卤基、烷基基团、其它的芳香基团或芳烷基基团取代。

此处所用的“芳烷基”是指芳基基团取代了烷基氢原子的基团。“芳基”如以上所定义。在本发明中，芳烷基可以包括任意数量的碳原子。在本发明的一个实施方案中，“芳烷基”含有约20或更少碳原子。例如，在一个实施方案中，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20碳的芳烷基基团可以用于本发明。当然，更多碳原子的芳烷基基团可以用于本发明。

此处所引述的任何数值包括所有的以一个单位从低值到高值增加的值，条件是在任意低值和任意高值之间具有至少两个单位的间隔。例如，如果表述的是组分的量或工艺变量如，例如温度、压力、时间及其类似的量的值为，例如从1至90，优选从20至80，更优选从30至70，该意思为在说明书中诸如15-85、22-68、43-51、30-32及其类似值为明确的列举。对于比1更小的值，根据具体情况，一个单位可以被认为是0.0001、0.001、0.01或0.1。这些仅是具体意指的实例，且所列举的介于最低值和最高值之间的数值的所有可能组合被认为是在本申请中以类似的方式进行了清楚的陈述。

芳香阴离子置换剂化合物

在一个实施方案中，本发明涉及一种聚芳香聚阴离子置换剂化合物，所述化合物的通式为：

Cen(Ar)w

其中，Cen＝键、烯基、炔基、苯环、亚联苯基、萘撑或

其中：

R＝独立地为-H、C₁-C₄烷基或C₁-C₄羟烷基；

Z＝独立地为-H、卤素、-OH、-OR、-NRCH₂CH(OH)CH₂OH、-NR₂、-N[CH₂CH(OH)CH₂OH]₂、-NRC(CH₂OH)₃、-NRCH(CH₂OH)₂或-N(R)(聚(烯化氧))；

w＝2到Cen上可取代位置的最高数；和

Ar＝(a)、(b)和/或(c)；其中，在下列(a)、(b)和(c)中：

An-＝独立地为磺酸根、羧酸根、膦酸根、亚膦酸根、磷酸根、磷酸单酯或二酯、硫酸根、硫酸单酯或硼酸根；

G＝独立地为H，C₁-C₆烷基、C₁-C₆烯基、C₆-C₁₀芳基、卤素、硝基、羟基、C₁-C₆烷氧基、氰基、-NH₂、-NRH、-NR₂、NHC(O)R、-CHO、-C(O)R；和

(a)，(b)和(c)是：

其中(a)中：x＝1-3、y＝2-4、x+y＝5；和/或

其中在任一(b)中：x＝1-3、y＝4-6、x+y＝7；

和/或

其中在(c)中：x＝1-3；y＝1-3，x+y＝4。

在一个实施方案中，Ar基团的两个或更多个除了结合到Cen之外，还可以相互结合。在这样一个实施方案中，G构成结合至另一个Ar基团上的键。

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子置换剂化合物包括作为连接至Cen的Ar基团的(a)、(b)或(c)中的两个或多个的组合。如上所定义，在任意给出的化合物中，每个An^-，每个G，每个R和每个Z可以独立于每一个其它的An^-、G、R和Z选择。从不同的Cen和Ar部分延伸的线或键表示为位于每个Ar和与其连接的Cen之间的键。

依据本发明的聚芳香聚阴离子置换剂化合物属于称为芳香聚阴离子的一类化合物，所述化合物可以是酸或盐或芳香聚阴离子化合物，所述化合物中有两个或更多个其上面带有多个阴离子部分的芳香核。本发明聚芳香聚阴离子化合物通常为聚多酸，当解离时，形成多个带负电荷的基团(聚阴离子)。在本发明的公开内容中，所述结构通常表示为其各自酸的形式。可以理解的是，在本发明聚芳香聚阴离子置换剂化合物使用的pH范围内，这些化合物将解离成阴离子形式到一定的程度。即，通常，相对强的酸性基团如磺酸根通常将完全解离，而不太强的酸性基团如羧酸根可不完全解离。如本领域所知，在给定的pH值下的解离度取决于化合物的pK值。为了一致和方便，这里显示化合物酸的形式，但并不意味着这样的化合物必须是以酸的形式。

在一个实施方案中，依据本发明的聚芳香聚阴离子化合物包含多个带负电荷的原子。在一个实施方案中，阴离子有机化合物可以包含多于一种类型的阴离子部分。在一个实施方案中，阴离子部分可以是羧酸根、磺酸根、膦酸根、硫酸根和磷酸根中的一种或多种，并通常用An^-表示。在芳香阴离子化合物的任意给出的实施方案中，可以存在多个这些An^-部分中的任何一个，或可以存在这些An^-部分中的任何两个或多个中的每一个或多个的混合物。在许多实施方案中，给出的芳香阴离子化合物中的An^-阴离子部分全部相同，但在其它实施方案中，为两种或多种的这种An^-阴离子部分的组合或混合。这样，例如，可以是磺酸和羧酸基团的组合。

在一个实施方案中，本发明聚芳香聚阴离子化合物在多个芳香核上带有多个阴离子部分。即，在一个带有多个芳香核的实施方案中，所述多个芳香核中的每一个带有多个阴离子部分。在一个实施方案中，一个或多个芳香核不带有阴离子部分。例如，在一些实施方案中，一个芳香核为中心的连接基团，其上连接有多个带有阴离子部分的芳香核。

在一个实施方案中，阴离子有机化合物包含多个芳香核，每一个芳香核上有多个阴离子基团同一地分布在多个芳香核中的每一个上。即，在带有多个芳香核且多个芳香核被取代的一个实施方案中，阴离子部分连接在每一个芳香核的相同的位置上。例如，两个苯核(苯基基团)每一个都可以在每一环的1位结合到剩余的阴离子有机化合物上，且两个磺酸根基团结合到每个环的3位和5位。

在一个实施方案中，阴离子有机化合物包含多个芳香核，在每一个芳香核上，多个阴离子基团同一地分布在多个芳香核的每一个上，其中阴离子有机化合物作为一个整体具有至少一个对称轴。即，在带有多个芳香核且多个芳香核被取代的一个实施方案中，阴离子部分连接在每个芳香核的相同位置，且该分子作为一个整体具有至少一个对称的轴。例如，两个苯环每一个可以在每个环的1位结合到另外一个，且两个磺酸基连接到每个环的3位和5位。该分子左右对称，该分子的每一侧是另外一侧的镜像。

在一个实施方案中，芳香核Ar可以被取代或不被取代，所述芳香核Ar除了包括以上描述的基团之外的各种杂环芳香族，包括但不限于，苯并呋喃、异苯并呋喃、苯并三唑、苯并噻唑、苯并[b]噻吩、苯并[c]噻吩、吲哚、苯并咪唑、噌啉、喹唑啉、萘啶(naphthyridine)、吡啶并[3，4-b]吡啶、吡啶并[3，2-b]吡啶、吡啶并[4，3-b]吡啶、喹啉、异喹啉、酚噻嗪、吖啶、苯并异噁唑(benzisooxazole)、氨茴内酐(anthranil)、和聚芳香基团如蒽和菲。

当取代时，芳香核Ar可以被如上所定义的任何G基团取代，并与同样存在的An^-取代基保持一致。

在一个实施方案中，阴离子有机化合物为水溶性。当溶于水中时，这些化合物显示出带有多个负电荷的有用的性质，其经常以均匀的方式进行展开。

在一个实施方案中，本发明包括作为有机置换剂化合物的芳香聚阴离子化合物。在一个实施方案中，芳香聚阴离子化合物包括在此进行更为详细描述的聚芳香聚阴离子化合物。在一个实施方案中，芳香聚阴离子化合物有低分子量。在一个实施方案中，芳香聚阴离子化合物本身为新化合物，同样是用于顶替色谱方法中的新置换剂化合物。

以下，列举出如上所定义的具有通式Cen(Ar)w的化合物的各种实例。这些实例不意味构成限制，而是对本发明的一些可能的实施方案提供说明。

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子化合物具有如下通式(I)：

其中在(I)中，每个An^-，每个G，每个x和每个y可以独立地选自以上述定义。在一个实施方案中，在每个分子(I)中，每个Ar核上的每个An^-都相同，而在另一实施方案中，一个或多个An^-不同于其它的An^-基团。在一个实施方案中，在每个分子(I)中，在每个Ar核上的每个x值与每一个其它Ar核上的x值相同，而在另一实施方案中，x值的一个或多个不同于其它的x值。在一个实施方案中，在每个分子(I)中，在每个Ar核上的每个G是相同的，而在另一实施方案中，一个或多个G与其它的G不相同。在一个实施方案中，在每个分子(I)中，在每个Ar核上的每个y值与每一个其它Ar核上的y值是相同的，而在另一个实施方案中，y值的一个或多个不同于其它的y值。在一个实施方案中，An-基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，G基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，该分子作为整体有至少一个对称的轴。

在一个实施方案中，具有通式结构(I)的芳香聚阴离子化合物为例如具有通式(I-A)的下述芳香聚阴离子化合物的化合物，所述化合物可方便地称之为AD1(阴离子置换剂1)

在化合物(I)的该实施方案中，An-在所有的实例中为磺酸根，在所有的实例中，x＝1，磺酸根位于每个芳香核的4位(对位)。化合物(I-A)的合成在实施例1中描述，化合物(I-A)在顶替色谱方法中的应用在实施例3中描述。

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子化合物具有以下通式(II)：

其中，在(II)中，每个An^-，每个G，每个R，每个x和每个y可以独立地选自上述定义。在一个实施方案中，每个分子(II)中，在每个Ar核上的每个An^-都相同，而在另一实施方案中，一个或多个An^-不同于其它的An-基团。在一个实施方案中，在每个分子(II)中，在每个Ar核上的每个x值与每一个其它Ar核上的x值是相同的，而在另一实施方案中，x值的一个或多个不同于其它x值。在一个实施方案中，在每个分子(II)中，在每个Ar核上的每个G是相同的，而在另一实施方案中，一个或多个G与其它的G不相同。在一个实施方案中，在每个分子(II)中，在每个Ar核上的每个y值与每一个其它Ar核上的y值是相同的，而在另一实施方案中，y值的一个或多个不同于其它的y值。在一个实施方案中，在每个分子(II)中，每一个N上的每个R都是相同的，在另外一实施方案中，一个或多个R不同于其它N上的其它R。在一个实施方案中，An- -基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，G基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，该分子作为整体有至少一个对称的轴。

在一个实施方案中，具有通式结构(II)的芳香聚阴离子化合物为例如具有通式(II-A)的以下芳香聚阴离子化合物的化合物，所述化合物可方便地称之为AD2，并具有以下结构：

在(II-A)中，在每一个苯基基团中x＝2，在每个苯基基团中两个An-是不同的，一个An-代表磺酸根，一个An-代表羧酸根，且两个An-位于苯基团的3位和5位(间)。

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子化合物具有以下通式(III)：

其中，在(III)中，每个An^-，每个G，每个R，每个x和每个y可以独立地选自上述定义。在一个实施方案中，每个分子(III)中，在每个Ar核上的每个An^-都相同，而在另一实施方案中，一个或多个An^-不同于其它的An-基团。在一个实施方案中，在每个分子(III)中，在每个Ar核上的每个x值与每一个其它Ar核上的x值是相同的，而在另一实施方案中，x值的一个或多个不同于其它的x值。在一个实施方案中，在每个分子(III)中，在每个Ar核上的每个G是相同的，而在另一实施方案中，一个或多个G与其它的G不相同。在一个实施方案中，在每个分子(III)中，在每个Ar核上的每个y值与每一个其它Ar核上的y值是相同的，而在另一个实施方案中，y值的一个或多个不同于其它的y值。在一个实施方案中，在每个分子(III)中，每一个N上的每个R都是相同的，在另外一个实施方案中，一个或多个R不同于其它N上的其它R。在一个实施方案中，An-基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，G基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，该分子作为整体有至少一个对称轴。

在一个实施方案中，具有通式结构(III)的芳香聚阴离子化合物为例如具有通式(III-A)的以下芳香聚阴离子化合物的化合物，具有以下结构：

在一个实施方案中，具有通式结构(III)的芳香聚阴离子化合物为例如具有通式(III-B)的以下芳香聚阴离子化合物的化合物，所述化合物可方便地称之为AD-4，并具有以下结构：

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子化合物具有如下通式(IV)：

其中(IV)中，每个An^-，每个G，每个x和每个y可以独立地选自上述定义。在一个实施方案中，在每个分子(IV)中，在每个Ar核上的每个An^-都相同，而在另一实施方案中，一个或多个An^-不同于其它的An-基团。在一个实施方案中，在每个分子(IV)中，在每个Ar核上的每个x值与每一个其它Ar核上的x值是相同的，而在另一实施方案中，x值的一个或多个不同于其它的x值。在一个实施方案中，在每个分子(IV)中，在每个Ar核上的每个G是相同的，而在另一实施方案中，一个或多个G与其它的G不相同。在一个实施方案中，在每个分子(IV)中，在每个Ar核上的每个y值与每一个其它Ar核上的y值是相同的，而在另一个实施方案中，y值的一个或多个不同于其它的y值。在一个实施方案中，An-基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，G基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，该分子作为整体有至少一个对称的轴。

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子化合物(IV)为两个以下结构(IV-A)或(IV-B)之一，所述化合物可分别方便地称之为AD5和AD6。

在另一个实施方案中，聚芳香聚阴离子化合物(IV)具有如下通式(IV-C)：

在所有(IV-A)、(IV-B)和(IV-C)中，取代基具有上述用于结构(IV)所提供的定义。在一个实施方案中，具有结构(IV-C)的化合物为如图3所示的那些化合物的示范性的化合物，或异构体或同种物的一种或多种。所述化合物的同种物包括，例如，烷基基团、烷氧基基团，卤素包括在以上关于具有通式结构(IV)的化合物的那些描述中。这样，除了图3所示的具体化合物，在通式结构(IV)范围之内的任何其它化合物都包括在该定义之内。注意的是上述化合物(IV-B)或AD-6与图3中的结构(I)对应。

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子化合物具有以下通式结构(V)：

其中，在(V)中，每个An^-，每个G，每个x和每个y可以独立地选自上述定义。在一个实施方案中，每个分子(V)中，在每个Ar核上的每个An^-都相同，而在另一实施方案中，一个或多个An^-不同于其它的An-基团。在一个实施方案中，在每个分子(V)中，在每个Ar核上的每个x值与每一个其它Ar核上的x值是相同的，而在另一实施方案中，x值的一个或多个不同于其它的x值。在一个实施方案中，在每个分子(V)中，在每个Ar核上的每个G是相同的，而在另一实施方案中，一个或多个G与其它的G不相同。在一个实施方案中，在每个分子(V)中，在每个Ar核上的每个y值与每一个其它Ar核上的y值是相同的，而在另一个实施方案中，y值的一个或多个不同于其它的y值。在一个实施方案中，An-基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，G基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，该分子作为整体有至少一个对称的轴。

在一个实施方案中，具有通式结构(V)的芳香聚阴离子化合物为例如具有通式(V-A)的以下芳香聚阴离子化合物的化合物，所述化合物可方便地称之为AD3，并具有以下结构：

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子化合物具有以下通式结构(VI)：

其中，在(VI)中，每个An^-，每个G，每个x和每个y可以独立地选自上述定义。在一个实施方案中，每个分子(VI)中，在每个Ar核上的每个An^-都相同，而在另一实施方案中，一个或多个An^-与其它的An-基团不同。在一个实施方案中，在每个分子(VI)中，在每个Ar核上的每个x值与每一个其它Ar核上的x值是相同的，而在另一实施方案中，x值的一个或多个不同于其它的x值。在一个实施方案中，在每个分子(VI)中，在每个Ar核上的每个G是相同的，而在另一实施方案中，一个或多个G与其它的G不相同。在一个实施方案中，在每个分子(VI)中，在每个Ar核上的每个y值与每一个其它Ar核上的y值是相同的，而在另一个实施方案中，y值的一个或多个不同于其它的y值。在一个实施方案中，An-基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，G基团对称地排列在Ar核上。在一个实施方案中，该分子作为整体有至少一个对称的轴。

在一个实施方案中，具有通式结构(VI)的芳香聚阴离子化合物为例如具有通式(VI-A)的以下芳香聚阴离子化合物的化合物，所述化合物可方便地称之为AD7，并具有以下结构：

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子置换剂化合物为顺式或反式的二苯乙烯衍生物。在该实施方案中，Cen定义如上，是＞C＝C＜，乙烯基团为顺式或反式构型。在该实施方案中，聚芳香聚阴离子置换剂化合物具有通式(VII)，且当Ar＝苯基时，该化合物为反式的，置换剂化合物具有通式(VII-A)，这里表示为：

这样，例如，在该实施方案中，置换剂化合物具有以下示范的结构式(VII-B)或(VII-C)之一，

在一个实施方案中，聚芳香聚阴离子置换剂化合物是具有以下结构式(VII-D)的化合物：

具有结构VII-D的实施方案为Cen的实例，当如上所定义时，Cen是＞C＝C＜，且乙烯基团为顺式构型，其中两个苯基Ar基团相互结合。在该实施方案中，y＝1，G形成从一个Ar基团到另一个Ar基团的键。

在一个实施方案中，任意上述式的聚芳香聚阴离子化合物在结构中包含附加的取代基以使其能够通过紫外/可见分光光度计、荧光法、或任意其它本领域已知的方法容易地进行检测。这样的取代基可能影响用于阴离子交换色谱的化合物的亲和力，可使所述化合物更弱或更强地结合至固定相。在一些实例中，没有将干扰利用常规方法对通过顶替色谱纯化的化合物的检测的取代基将是有利的。这种后者情况的一个实例为式I的置换剂化合物，所述化合物在紫外光280nm波长处没有吸收，在此处某些生物聚合体(蛋白质、寡肽、抗体，等等)具有特征吸收。用于提高检测能力的适宜的衍生化试剂为已知的，并能够适于为本领域技术人员选择。

在一个实施方案中，本发明置换剂化合物中的一个或多个取代基可以是能够通过一种或多种电磁或放射检测方法进行检测的基团。这样的电磁方法包括例如，紫外/可见分光光度计，荧光分光光度法。适宜的放射检测方法为本领域已知。用于该方法的检测这种基团的适宜的取代基和适当的方法为本领域技术人员已知。

适宜的、示范性的阴离子置换剂化合物包括，例如，以下用于说明置换剂化合物的实例的具体实施例。这些实施例不意味构成限制，而是为了提供具体的实施例以说明本发明不同实施方案中的阴离子置换剂。

根据本发明的一个实施方案，适宜的固定相是阴离子交换树脂。适宜的阴离子交换树脂在本领预是已知的，通常包括树脂如，甲基丙烯酸树脂、硅质(silica)、聚苯乙烯或聚苯乙烯-二乙烯基苯，所述树脂已被衍生带有阳离子部分，如二级、三级、或四级的铵基，其上吸引有阴离子。本领域技术人员能够通过待分离原料的类型来选择适宜的阴离子交换材料。在一个实施方案中，用于本发明适宜的阴离子交换树脂包括，例如，Mono Q、Source 15Q、QPP和QFF(Amersham Biosciences)；Super Q-5PW、DEAE-650、TSK-GEL SuperQ-5PW和Super Q-650M(Tosoh Biosep)；Unosphere Q、Macroprep High Q(Bio-Rad)；PL-SAX(Polymer Labs)；IEC QA-825和IEC DEAE-825(Showa Denko)；Q-8HR和DEAE-15HR(Waters)；和TMAE和DEAE(EMD Chem.)。

也可以使用本领域已知的其它适宜的阴离子交换树脂。

所述树脂通常用多倍体积的阴离子负载缓冲液平衡。

顶替色谱方法

在一个实施方案中，本发明涉及一种顶替色谱方法，包括：

将含有至少一种待分离组分的混合物装载到适宜的固定相上；

通过将包含有阴离子置换剂化合物的混合物施加于固定相，从固定相中置换所述至少一种组分，所述阴离子置换剂化合物在一个或多个芳香核上包含多个阴离子基团。

通常，如上述背景部分所描述，顶替色谱方法对本领域技术人员是已知的。因此，除了以下的实施例中，在这里详细描述该方法，对于本领域普通技术人员理解本发明不是必需的。

根据本发明的一个实施方案，顶替色谱方法能够用于分离和纯化DNA、RNA、核酸、核苷酸、寡核苷酸、反义寡核苷酸、蛋白质和多肽。这里所用的DNA为通过任何来源，天然或重组获得的脱氧核糖核酸。这里所用的RNA为通过任何来源，天然或重组获得的核糖核酸，包括但不限于RNA、mRNA、cRNA、tRNA、nRNA、rRNA和任何已知的或后来制备或发现的RNA。这里所用的核苷是形成核酸作为RNA和DNA的核苷链的单体或结构单元。核苷酸由杂环核碱基、戊糖(核糖或脱氧核糖)和磷酸或多聚磷酸基团构成。寡核苷酸包括两个或多个核苷酸，直到约50个核苷酸，比RNA或DNA分子小很多。寡核苷酸经常作为用于DNA或RNA的探针，并能用于PCR(聚合酶链反应)方法中。反义寡核苷酸被设计和用于和特定靶RNA杂交以影响靶RNA的功能。反义序列的用途可以用于抑制mRNA的表达，以阻碍遗传信息从DNA到蛋白的传递，所述反义序列通过Watson-Crick碱基对互补杂交到特定的mRNA上。在mRNA被翻译成组成蛋白质的氨基酸之前，反义分子被设计为与例如，mRNA相互作用。这样，能够阻止与疾病相关的蛋白质的形成。这些寡核苷酸分子被称为反义，因为它们是靶RNA的Watson-Crick互补物。

在一个实施方案中，本发明能够用来分离和隔离碱基，通常如，腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶，和通常的嘌呤和嘧啶。在一个实施方案中，本发明能够用于分离核苷，如腺苷、尿苷、鸟嘌呤核苷、胞苷、脱氧腺苷、胸苷、脱氧鸟嘌呤核苷、脱氧胞苷。在一个实施方案中，本发明能够用于分离和隔离核苷酸，包括，例如AMP、UMP、GMP、CMP、ADP、UDP、GDP、CDP、ATP、UTP、GTP、CTP、cAMP和cGMP。在一个实施方案中，本发明能够用于分离和隔离脱氧核苷酸，包括dAMP、dTMP、dUMP、dGMP、dCMP、dADP、dTDP、dUDP、dGDP、dCDP、dATP、dTTP、dUTP、dGTP和dCTP。在一个实施方案中，本发明能够用于分离和隔离核酸，如，DNA、RNA、LNA、PNA、mRNA、ncRNA、miRNA、rRNA、siRNA、tRNA和mtDNA。

如这里所用，蛋白广泛地定义为分子量大于约5kDa(千道尔顿)的聚合氨基酸，多肽为分子量小于约5kDa的聚合氨基酸。本领域技术人员可以理解，蛋白质和多肽的区别为更进一步。通常，蛋白质显示为三级结构，而多肽通常不是。

在一个实施方案中，本发明特别可用于从含有例如多肽和蛋白质的混合物中分离此类组分。在一个实施方案中，混合物中的一种或多种组分包含一种或多种多肽、一种或多种蛋白质或任何两种或多种此类蛋白质和/或多肽的混合物。即，本发明方法可用于分离蛋白质混合物、多肽混合物及蛋白质和多肽的混合物。在一个实施方案中，一种或多种蛋白质包含约5kDa或更高的分子量。在一个实施方案中，混合物包含两种或多种蛋白质、两种或多种多肽或它们的混合物。

在一个实施方案中，来自混合物中的蛋白质和/或多肽在馏分中从固定相中被置换出来，所述馏分充分富集蛋白质和/或多肽，和/或所述馏分中的蛋白质和/或多肽已与其它的蛋白质和/或多肽组分充分分离开。即，在一个实施方案中，当将含有感兴趣的蛋白质和多肽的混合物施加到固定相时，当蛋白质或多肽从固定相中置换出来，并收集在一种或多种馏分中时，蛋白质和/或多肽在以富集，即更浓的形式，或者或者以与初始混合物中的其它不同的蛋白质和/或多肽组分实质上分离开的形式之一或同时为两种形式的馏分获得。这样，清楚地，混合物可能包括两种或更多种的待分离组分。如以下所讨论，在一些实施方案中，经过本发明顶替色谱处理的混合物可能包括来自各种不同来源的多种不同的原料的组合，本发明方法可以有效地用于这种复杂混合物以分离其中的各种组分。

在另一实施方案中，本发明可用于含有至少一种组分(如DNA、RNA、核苷、寡核苷酸、蛋白质、多肽、药物、药物中间体等)和至少一种杂质的混合物。在该实施方案中，本发明方法可以用于从混有所希望组分的一种或多种杂质中的纯化组分。这种杂质的去除可以是或者(1)在所寻找的和想要的组分被置换之后，通过固定和保留在固定相上(如，固定相作为过滤器)，或者(2)通过从固定相上洗出或洗脱，杂质通过一种更类似于“传统”的洗脱色谱方式被除去。在该实施方案中，当杂质或被固定上或从柱中除去时，然后将所希望的组分通过这里记载的顶替色谱从柱中除去。

本发明可用于各种不同的组分，不仅包括上述提到的DNA、RNA、核苷酸、寡核苷酸、其混合物和其中混有的杂质，还包括许多其它组分。

在一个实施方案中，混合物可以包括一种或多种天然的或重组的抗体或任意两种或多种这种抗体的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包括一种或多种天然的或重组的酶，或任意两种或多种这种酶的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包括一种或多种天然的或重组的用于诊断用的蛋白质或多肽，或任意两种或多种这种蛋白质和/或多肽的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包括一种或多种天然的或重组的用于人和兽医治疗用的蛋白质或多肽，或任意两种或多种这种蛋白质和/或多肽的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包括从一种或多种天然的或重组的动物或人的血浆中衍生的一种或多种蛋白质或多肽，或任意两种或多种这种蛋白质和/或多肽的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包括从一种或多种天然的或重组的植物原料衍生的一种或多种蛋白质或多肽，或任意两种或多种这种蛋白质和/或多肽的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包括从一种或多种动物或人奶或重组动物的奶中衍生的一种或多种蛋白质或多肽，或任意两种或多种这种蛋白质和/或多肽的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包括从一种或多种天然的或重组的鸟蛋中衍生的一种或多种蛋白质或多肽，或任意两种或多种这种蛋白质和/或多肽的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包括从一种或多种天然的或重组的细菌、酵母、菌类、病毒、或昆虫中衍生的一种或多种蛋白质或多肽，或任意两种或多种这种蛋白质和/或多肽的混合物。在一个实施方案中，混合物可以包括从一种或多种天然的或重组的哺乳动物细胞培养物或动物组织中衍生的一种或多种蛋白质或多肽，或任意两种或多种这种蛋白质和/或多肽的混合物。

在一个实施方案中，混合物可以包括一种或多种的有机化合物，药物或药物中间体，或上述任意两种或两种的混合物。在一个实施方案中，一种或多种的有机化合物，药物或药物中间体中的一种或多种为手性的。在一个实施方案中，混合物可以包括上述物质的任意的混合物或结合物，如抗体和酶的混合物，或从植物原料或鸟蛋中获得的蛋白质和/或多肽的混合物，或可用于本发明方法的任意前述示范性组分的任意混合物。

在一个实施方案中，本发明方法进一步包括当离子置换剂化合物出现在固定相时，检测阴离子置换剂化合物的步骤，其中所述检测是通过紫外/可视吸收光谱，荧光发射光谱、质谱、pH、传导率和一种或多种的电子化学方法中的一种或多种进行。上述方法为检测置换剂化合物最常用的方法；可以使用本领域已知的其它适宜方法。这种检测可以是一种或多种如上所讨论的可检测的取代基。

在一个实施方案中，用于检测被从固定相置换出的组分的方法可基于具体所寻找的组分适宜地地确定。这样，例如，蛋白质和多肽可以基于它们的紫外/可视吸收光谱或特征吸收波长而被检测，或通过用可视化试剂对它们进行衍生。同样，药物和药物中间体可以基于它们的紫外/可视吸收光谱或特征吸收波长而被检测。

在一个实施方案中，本发明方法进一步包括再生固定相的一个或多个步骤。在一个实施方案中，再生可以包括例如，用碱金属氢氧化物、碱金属盐、碱土氢氧化物、碱土盐、有机酸、烷基磺酸、季铵氢氧化物、季铵盐、烷基胺的一种或多种的溶液处理固定相，其中所述溶液进一步包含适当的pH缓冲液。当需要和适当时，可以加入其它适当的再生步骤，包括使用纯化水进行简单地洗涤。在一个实施方案中，再生包括使用带水的有机共溶剂。

在以下实施例中，提供了示范性的合成工艺，通过所述合成工艺可以合成这些示范性的阴离子置换剂化合物。本发明范围内的其它适宜的阴离子置换剂化合物能够通过已知的和/或由上述方法改进的方法进行合成，本领域技术人员可以理解之一点。

在一个实施方案中，置换剂组合物不用加入硫酸葡聚糖，在一个实施方案中，置换剂组合物基本不用任何来源的硫酸葡聚糖。在一个实施方案中，该置换剂化合物不用硫酸化碳水化合物。

在一个实施方案中，本发明置换剂化合物在分子中不含醚基。在一个实施方案中，本发明置换剂化合物含有聚阴离子基团，其中邻近的聚阴离子基团不通过含醚部分连接。在一个实施方案中，本发明置换剂化合物不含树枝状聚醚。

在一个实施方案中，本发明置换剂化合物和组合物基本不用含偶氮基的化合物(偶氮基为-N＝N-)。在一个实施方案中，本发明置换剂化合物和组合物基本不用含蒽醌化合物。在一个实施方案中置换剂组合物基本不含四硫酸靛青(indigotetrasulfonate)。

在一个实施方案中，本发明涉及一种制备聚磺酸聚芳香化合物(polysulfonated polyaromatic compound)的方法。在一个实施方案中，该方法包括的步骤为：提供硫酸溶液；向硫酸溶液中直接加入聚芳香化合物。该方法的优点为直接形成聚磺酸聚芳香化合物，没有形成必须分离和纯化的中间体。

在一个实施方案中，该方法进一步包括从溶液中获得聚磺酸聚芳香化合物。以下实施例1中，提供了获得该化合物的方法的实施例。

在一个实施方案中，硫酸为浓硫酸。在一个实施方案中，当聚芳香化合物向其中加入时，硫酸的温度为约70℃至约140℃。

在该方法的一个实施方案中，聚芳香化合物为四苯乙烯。在该实施方案中，在一次合成中，聚磺酸聚芳香化合物为化合物(I-A)，其在这里也称为AD-1。

虽然这里所描述的是关于四苯乙烯和形成化合物(I-A)的合成方法，但该方法不限于用于制备该产品，可以认为用于制备相似的聚磺酸聚芳香化合物也是有用的。

实施例

以下所包括的实施例是为了展示本发明优选的实施方案。本领域技术人员可以理解，接下来实施例中所公开的技术代表了发明人发现的技术以使本发明得到很好的实施，且可以认为构成了其实施的优选方式。然而，在本发明公开的启示下，本领域技术人员应当理解的是，可以对公开的具体实施方案进行多种变化，并获得类似或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围，其仅由所附权利要求限制。

实施例1-AD-1的合成

向装有热电偶的1000mL3颈圆底烧瓶中加入500mL的浓硫酸和磁搅拌棒，所述热电偶涂有四氟乙烯。用干燥氮气净化烧瓶，同时在粉末添加漏斗中加入35g四苯乙烯。粉末添加物漏斗置于圆底烧瓶的适宜位置，在稍微超过环境压力的干燥氮气的气氛下密封烧瓶。搅拌下将硫酸加热到约115℃，然后以小份的方式将四苯乙烯加入到硫酸中超过约1小时。每份四苯乙烯的加入应在前面的份于液体反应混合物中完全溶解之后进行。当完全加入后，将黑暗中的反应混合物保持在115℃约1小时，然后冷却到室温。将冷却的反应混合物转移到加料漏斗，并滴加超过约4个小时到冷却到约5℃的约5升的不含乙醇的乙醚中，以沉淀灰白色固体状的产物。当加入完毕时，停止搅拌，静置固体产品。将约4.5L的上清液仔细地倒出，产品在剩余的溶剂中为浆状，然后在干燥氮气下于烧结玻璃板(sintered glass frit)上收集，用新鲜的乙醚(不含乙醇)洗涤两次并在干燥氮气流下干燥。得到约64g的AD1，为精细的自由流动的灰白色粉末，通过HPLC检测，纯度为99.5％。乙醚洗涤之后，如果产品中留有微量硫酸，则可将该产品溶解到水中并用碳酸钡处理，直到所有硫酸作为硫酸钡被除去。过滤、蒸发将得到适宜用作阴离子交换媒介的置换剂化合物的纯四磺酸。

实施例2-AD-2的合成

AD-2的合成可以通过以下的两个步骤进行。

步骤1：2-氯-4，6-双(3-羧基-4-羟基-5-磺基苯胺基)-1，3，5-三嗪二钠盐(分子量＝621.85)的合成

将23g蒸馏水和56g冰(来自蒸馏水)放置在烧瓶中，磁力搅拌。用玻璃pH探头和温度探头监测后来反应的pH和温度。将100mgTriton-X100清洁剂加入到搅拌混合物中，接着一次性加入1.90g三聚氰氯(Aldrich)(10.3mmol，分子量＝184.4)。对于该反应的第一部分，如果需要，可通过外部冷却使温度保持在0-5℃，根据需要，通过加入少量的固体LiOH.H₂O使pH值保持在3.5-4.0。分份加入超过两小时，向搅拌的反应混合物中加入少量的固体5-氨-3-磺水杨酸(4.8g，20.6mmol，Aldrich)。温度和pH值维持在如上所述。在保持上述温度和pH值下，然后再搅拌反应混合物4小时。反应混合物慢慢加热到室温。在这点上，pH稳定在3.6并看到微小的变化。室温下搅拌混合物过夜(18个小时)，在此期间pH值在没有加入任何酸和碱的情况下变为3.5。在这点上并贯穿该反应顺序，接下来的反应进展为通过阴离子交换HPLC以确保消耗单苯胺产品，而不能形成三苯胺产品(三聚氰胺)。滴加入足量的2M HCl降低pH值到1.5，然后过滤反应溶液。在室温下搅拌滤出液，并滴加饱和的NaCl溶液(盐水)直到产品从溶液中完全结晶(约20mL盐水)。过滤反应混合物，固体产品用95％的乙醇重复洗涤，然后真空干燥。该步骤得到5.58g(87％的收率)所希望的产品，通过HPLC，其纯度为约96％。

步骤2：2-(三(羟甲基)甲氨基)-4，6-双(3-羧基-4-羟基-5-磺苯胺)1，3，5-三嗪，钠盐(AD2，分子量＝684.55)

将15.75g(130mmol，分子量＝121.1)三(羟甲基)甲胺(Aldrich)和4.04g(6.5mmol，分子量＝621.85)2-氯-4，6-双(3-羧基-4-羟基-5-磺苯胺)-1，3，5-三嗪，二钠盐(上述制备)悬浮在40mL的干的、试剂级的二甲基亚砜中。搅拌下，将混合物在氮气氛下加热到110℃约24小时。将反应混合物冷却到室温并保持过夜。开始胺的晶体从溶液中结晶出，并滤除。向滤液中加入60mL的蒸馏水，然后滴加6M HCl直到pH为约1.5，最后在室温滴加饱和的氯化钠溶液(盐水)直到产品从溶液中结晶出(约30mL盐水)。此反应混合物在室温下搅拌约1小时，然后过滤。固体产品用95％的乙醇重复洗涤，然后真空干燥得到3.66g(收率82％)所希望的产品，通过HPLC，所述产品的纯度为约96％。

实施例3-蛋白混合物的顶替色谱

穿透实验。使用在负载缓冲液中的牛β-乳球蛋白A和在负载缓冲液中的牛β-乳球蛋白B的5mM溶液。以0.1-0.5mL/min之间的不同流量进行穿透实验。负载缓冲溶液由25mM的BHEP(1，4-双(羟乙基)哌嗪)制成，并用盐酸调节到pH＝7.7。在流量为0.18mL/min条件下获得可重复的结果。对于β-乳球蛋白B的柱饱和容量为459mg(108mg/mL)，对于β-乳球蛋白A的柱饱和容量为463mg(109.2mg/mL)。在这些试验中，未纯化的乳球蛋白(Sigma)直接从瓶中取出并使用。

柱的制备。用方法A(以下)清洗和再生柱子(Tosoh SuperQ-5PW，6.0×150mm)，然后在氯化钠缓冲溶液中以氯化物的形式保存，所述氯化钠缓冲溶液为2.0M NaCl+25Mm BHEP，用盐酸调pH＝7.7。柱的输出通过在280nm和312nm处检测的紫外/可视流量检测仪、传导率流通池和pH流通池。柱子用0.18mL/min流量的负载缓冲溶液(参见以上)平衡。一旦所有三个信号(紫外吸收度、传导率、pH)形成稳定的水平基线(约24min，1CV)，立即开始顶替实验。

顶替实验。牛β-乳球蛋白B(12.6mg/ml，Sigma#L8005)和牛β-乳球蛋白A(13.4mg/ml，Sigma#L7880)的溶液制备到负载缓冲液中(参见上述)。用BCA-铜和Bradford检测法测定蛋白质的浓度。将等体积的两种细胞色素溶液混合，装载到20.0ml样品回路，然后以0.36ml/min的固定流量泵到清洁的、被适当平衡的阴离子交换柱上，约57分钟。回路切换出输入流道，泵负载缓冲液以0.36ml/min的速度通过柱子约12分钟。最后，将5.0mM在缓冲液中的AD1置换剂溶液以0.18ml/min的流量泵到柱上，所述柱的输出通过紫外/可视流量检测仪(10μL流通池，在280、312、380nm处检测)并进入馏分收集器。每隔1min收集馏分，根据以前的经验，丢弃没有蛋白质的初始馏分。传导率和pH流通池(参见上述)通常位于输出通道中的紫外可视监测器之后以检测顶替实验的过程；然而，当收集馏分时，这两个流通池切换出流道，以便不加宽顶替峰之间的跨度。一旦收集后，馏分被密封和冷冻用于接下来的HPLC分析。该顶替实验在环境温度为22℃下进行。顶替迹线如图1中所示。

乳球蛋白的HPLC分析。以下给出详细的HPLC馏分分析。

柱：不锈钢柱4.6×200mm的内部尺寸，由PolyLC制造(马里兰州哥伦比亚)，PolyWAX LP，弱阴离子-交换硅胶基质，颗粒尺寸5μ，孔尺寸300埃。

缓冲溶剂：HPLC级蒸馏水。

洗脱缓冲剂：

A-50mM N(CH₂CH₂OH)₃，pH＝7.8用盐酸调节，溶剂10/90(v/v)乙腈/水

B-0.50M氯化钠+50mM N(CH₂CH₂OH)₃，pH＝7.8用盐酸调节，溶剂10/90(v/v)乙腈/水

洗脱缓冲剂用0.2μ的过滤器过滤除去颗粒。

流量：固定流量为：1.0ml/min。

梯度方法：

0-2min    100％A等梯度

2-25min     100％A到100％B，线性梯度

52-56min    100％B等梯度

UV检测器波长：

312nm和318nm-仅应用于AD1

280nm-蛋白质+AD1

样品制备：10μL的馏分样品和14μL稀释缓冲液混合，将50μL所述混合物注入柱中。通过重量测量精确的稀释系数。

在该分析条件下，由于杂质蛋白质，每个Sigma乳球蛋白显示为一个主峰，一个主亚型峰和几个(3-4)小亚型峰和几个(4-5)小峰。从瓶中取出，牛β-乳球蛋白B为约95％的纯度(基于蛋白杂质)和牛β-乳球蛋白A为约97％的纯度。不像β-乳球蛋白A，β-乳球蛋白B含有显著水平的无机盐和缓冲液。所有151个收集的样品都进行这样的分析，280nm处的数据如图2和以下表中所示。从柱中的总蛋白质的回收率为97％。

纯化蛋白质：        乳球蛋白B    乳球蛋白A

样品池：            12-61           77-137

HPLC纯度：          ＞99.9％        ＞99.9％

回收：              103.2mg         112.0mg

回收百分率％¹       84.6％          86.2％

回收百分率％²       81.9％          83.6％

测量AD1：^*          ND(＜0.5ppm)    1.3ppm

估计AD1：^*          ＜50ppb         1.1ppm

ND＝没有检测到

^*在合并的馏分浓缩及分离之前。

1：主峰。

2：总蛋白。

柱清洗和再生方案。由于AD1对大部分阴离子交换树脂具有强结合力，我们发现对于大多数基质，溴化钠比氯化钠更为有用。有时使用琥珀酸钠或柠檬酸钠。

方法A：清洁+再生(再生效率99％)(所有流量为0.64ml/min)

2.0M溴化钠+0.1M甘氨酸，pH＝2.5

w/HBr，80/20(v/v)水/乙腈           133min    20CV

0.1M三乙醇胺，pH＝7.8w/HBr         17min     2.5CV

0.1M NaOH                          30min     4.5CV

0.1M三乙醇胺，pH＝7.8w/HBr         17min     2.5CV

2.0M NaCl+25mM BHEP，pH＝7.7                 34min

5CV

方法B：清洁+再生(再生效率100％)(所有流量为0.64ml/min)

2.0M(CH₃)₄NBr+0.1M甘氨酸，pH＝2.5

w/HBr，80/20(v/v)水/乙腈              100min    15CV

0.1M三乙醇胺，pH＝7.8w/HBr            17min     2.5CV

0.1M(CH₃)₄NOH                                   30min

4.5CV

0.1M三乙醇胺，pH＝7.8w/HBr            17min     2.5CV

2.0M NaCl+25mM BHEP，pH＝7.7          34min     5CV

实施例4：聚阴离子联苯基化合物的合成

这里所公开的置换剂化合物包括具有以上所示的通式结构(IV-C)的聚阴离子联苯化合物。这种聚阴离子联苯化合物的具体实施例如图3所示。

以下公开提供了图3中举例的聚阴离子联苯化合物的至少一些的详细的合成。本领域技术人员可以认识到，这些举例的聚阴离子联苯化合物的许多其它的异构体或同种物可以根据需要采用相似的方法进行合成。具有通式结构(IV-C)的所有聚阴离子联苯化合物具有作为置换剂化合物的用途，如这里所描述。

如图3中所示，示范性化合物被指定为字母A-M，所述字母标示在芳香环的一个上。在以下，根据具体情况，化合物用这些字母A-M表示。如上文提及，图3中的化合物I相对应于以上所示的结构(IV-B)。

起始的联苯化合物为以下所示，首先是它们的化学名称，然后是便于参考的名称a-m，相对应于所得聚阴离子联苯化合物A-M。

起始联苯化合物a-m可以通过已知的方法从下表1中所示的起始原料进行合成。

每种聚阴离子联苯化合物可以通过以下描述的方法进行制备并概括在表2中。

表1起始联苯的合成

表2聚芳香联苯化合物的合成

a)起始原料。

b)主要杂质：3，3’-二羧基-4-羟基-4’-甲氧基联苯-5，5’-二磺酸(保留＝30.6)

c)主要杂质：3，3’-二羧基联苯-4，5’-二磺酸(保留＝25.1)

d)难溶性中间体结晶出并然后慢慢再溶解。

e)将待磺化的化合物分份加入，并有冷却以阻止初始放热。

f)在结晶期间不加入丙腈和乙腈。

上述表1和2中所涉及的方法，如，用于制备联苯化合物方法1-4，用于制备聚阴离子联苯化合物方法5a-5c，将在以下进行描述。正如本领域技术人员能够理解的，根据需要可以将以下方法进行修改以获得所希望的产品。

方法1：4，4’-二甲基联苯-3，3’-二羧酸|(b)(分子量＝270.28)

将28.02gNaOH溶液(50％水性的，350mmol，分子量＝40.01)，90.0g蒸馏水和0.42g 5％Pd/C催化剂加入250mL的三颈圆底烧瓶，然后在磁力搅拌下加热到40℃约5分钟。加入2.11g的甲酰肼(35mmol，分子量＝60.06)，该混合物在40℃下再搅拌10分钟。然后分份加入21.51g 5-溴-邻-甲苯甲酸(100mmol，分子量＝215.05)超过15分钟，导致强烈N₂的生成和温和的热量释放(约60℃)。反应混合物被加热到85℃并保持该温度约3小时。

为了除去催化剂，将热的反应混合物通过滤纸。将滤液加热到90℃，然后小心地滴加浓盐酸水溶液(37％)直到混合物的pH值小于1.0。一旦加入酸，白色产品从热溶液中开始结晶。热混合物(约70-80℃)迅速地用玻璃过滤器过滤，用稀释的水性盐酸(环境温度)进行洗涤，然后用蒸馏水(环境温度)进行洗涤。通过过滤器吸取空气的方法对产品进行干燥。分离产量为约11.62g(86％)的白色结晶粉末。

方法2：4，4’-二氟联苯(m)(分子量＝190.19)

将60.02gNaOH溶液(50％水性的，750mmole，分子量＝40.01)，77.08g(CH₃)₄OH溶液(37％水性的，313mmol，分子量＝91.12)和1.60g 5％Pd/C催化剂加入500mL的三颈圆底烧瓶，然后在强烈的磁力或机械搅拌下加热到40℃约5分钟。加入15.80g的甲酰肼(263mmol，分子量＝60.06)，该混合物在40℃下再搅拌10分钟。然后通过加料漏斗加入75.0g 1，2-二甲氧基乙烷(DME)和131.3g 4-溴基氟基苯(750mmol，分子量＝174.96)的混合物约超过15分钟。可以观察到强烈N₂的生成并伴有温和的热量释放(约65℃)。反应混合物被加热到75℃并保持该温度约3小时。对于相似化合物，该反应混合物通常被加热到85℃，但此处使用75℃，以减少由不必要的升华造成的产品损失。有时使用低沸点的四氢呋喃代替DME。

剩余的碱用浓盐酸中和，然后使热的反应混合物通过滤纸除去催化剂，接着用乙醚洗涤滤纸。用分离漏斗将上部有机层和下部水性层分离。水性层用250ml的乙醚提取一次；将上部有机层分离并与第一次的有机层合并。合并的有机层用无水硫酸镁干燥，并过滤除去固体，所述固体用同样用醚洗涤。有机层放置在减压的旋转蒸发器中；醚首先被除去，接着为DME。无色油状形式变成美观的白色晶体。但在减压下除去大部分而不是全部的DME，原因是太多的产品通过升华而损失。将剩余的液体小心从白色晶体中排出，然后用冷的正戊烷(-20℃)洗涤晶体。排出的液体与等体积的正戊烷混合，并冷却到-20℃过夜，得到第二次结晶产品。产物通过简单的玻璃漏斗抽取空气进行干燥；该方法不能进行太长以避免过多产品损失。分离产率为约54.92g(77％)的白色晶体粉末。终产品具有足够的纯度(＞99％)，可用于大多数的应用。如果需要，该产品可以进行升华或通过热正己烷进行重结晶。

方法3：4，4-二甲基联苯-3-羧酸(e)(分子量＝226.27)

将28.54g四甲基铵碳酸盐溶液(27％水性的，37mmol，分子量＝208.30)，24.0g蒸馏水和30.0g PEG-2000加入100mL的三颈圆底烧瓶，然后在磁力搅拌下加热到50℃。将系统除去气体并置于氮气氛下。将23mg的醋酸钯(0.10mmol，分子量＝224.50)加入到搅拌的混合物中。经过几分钟后，钯化合物完全溶解，将该系统再次除气，并将温度降到30℃。将2.15g(10mmol，分子量＝215.05，精制粉末)5-溴-邻-甲基苯甲酸一次性加入搅拌的混合物中，然后系统除气。几分钟内完成溶解。最后，向搅拌混合物中加入1.64g(12mmol，分子量＝135.96，精制粉末)4-甲苯基硼酸，再次除气。反应混合物保持在30℃约1小时，然后升温到55℃，直到溴甲基苯甲酸完全反应(＞99.5％的转化率，通过AIX HPLC检测)。反应物加入之后的全部加热时间为约1.5小时。

为了除去沉淀的钯，通过#5华特门滤纸上的硅藻土床(a bed of Celiteover #5 Whatman paper)过滤热反应混合物，然后在环境温度下用85mL2.5％的四甲基铵碳酸盐溶液洗涤硅藻土。将合并的反应混合物和洗涤物加热到90℃，然后小心地滴加浓盐酸水溶液(37％)直到混合物的pH值小于1.0。一旦加入酸，就释放出相当多的CO₂，且白色产品开始从热溶液中结晶。热混合物(约80℃)用玻璃过滤器快速过滤，并用稀释的水性盐酸(环境温度)洗涤，然后用50/50的乙腈-水(环境温度)洗涤，最后通过滤器抽取空气干燥。分离产量为2.07g(91％)的白色结晶粉末。

方法4：4-甲基-4’-羟基联苯(i)(分子量＝184.24)

将2.34g无水碳酸钠(22mmol，分子量＝105.99)，1.73g4-溴苯酚(10mmol，分子量＝173.01)，35ml蒸馏水和35ml丙酮加入100mL的三颈圆底烧瓶中，然后在磁力搅拌下加热到35℃。将11mg的醋酸钯(0.049mmol，分子量＝224.50)加入到搅拌混合物中。经过几分钟后，钯化合物完全溶解，将1.77g(13mmol，分子量＝135.96)对甲基苯硼酸一次性地加入到搅拌混合物中。系统除气并置于氮气氛之下，反应混合物保持在35℃约1小时。

滴加浓盐酸水溶液以中和剩余的碱(碳酸盐)，然后减压下除去丙酮。过滤除去带有一些剩余催化剂的产物。固体用50ml乙醚溶解并用无水硫酸镁干燥。过滤除去固体，减压除去醚，得到1.61g粗产品，粗产品用热的乙醇-水(50/50v/v)或热的正己烷重结晶，得到1.22g(66％)的白色结晶。

方法5a：3，3’-二羧基-4，4’-二羟基联苯-5，5’-二磺酸(D)(分子量＝434.35)

纯化的4，4’-二羟基联苯-3，3’-二羧酸在110℃下在烤箱中干燥几小时以除去剩余的水，然后将13.72g(50mmol，分子量＝274.23)该化合物一次性加入到含有53.4g30％发烟硫酸(已知浓度的新瓶，200mmol SO₃，SO₃分子量＝80.06)的单颈100mL的烧瓶中。该烧瓶装有一个高效的冷凝器以使SO₃返回到反应混合物中，并装有一个涂有聚四氟乙烯的磁力搅拌器。反应在具有轻微正压力的干燥氮气氛下进行以阻止潮湿的空气。粘性混合物在环境温度下搅拌约30分钟，以确保固体均匀地分散到硫酸溶剂中。烧瓶部分地浸在保持70℃的油浴中，然后搅拌至所需要的时间，通常约24小时。在几分钟到几小时内，反应变得清晰，在低粘度的均匀介质中，搅拌变得更加有效。反应混合物用AIX HPLC监测以观察中间产物单磺酸盐的出现，然后完全消失。撤除油浴之后，反应混合物冷却到环境温度，然后小心地向搅拌的混合物中滴加14.8g蒸馏水。水的加入为非常放热，可通过水的加入速度或有时外部冷却进行控制。反应混合物的温度保持在70-85℃之间直到水加入完毕。反应产物略微溶于纯硫酸，而在75％的硫酸中会少溶很多。在搅拌下将反应混合物冷却到室温。几小时之后(有时过夜)，从溶液中结晶出白色产品经常形成固体块状。如果将冷却的混合物加入产物的晶种，结晶进行的快得多。所有的4，4’-二羟基联苯在高温下应避免空气以防止不必要的氧化。反应混合物冷却到4℃约几小时，然后搅拌下加入110ml冷的丙腈；有时用乙腈取代丙腈。该混合物进一步提高了结晶，并有助于通过过滤将酸除去。在4℃保持几个小时后，该混合物用玻璃过滤器过滤，并通过过滤器通入干燥空气或氮气干燥过夜，得到22.5g(96％)的纯二磺酸化产物，其为二水白色结晶。

方法5b：3-羧基-4-羟基-4’-甲基联苯-3’，5，5’-三磺酸(F)(分子量＝468.43)

如5a相同的方法，使用11.42g干的4-羟基-4’-甲基联苯-3-羧酸(50mmol，分子量＝228.25)和80.1g30％发烟硫酸(300mmol，分子量＝80.06)，30℃搅拌24小时，然后搅拌加热到70℃再保持24小时。用22.2g蒸馏水和145ml丙腈进行结晶。产量为21.2g(84％)三磺酸产物，其为二水的白色结晶。

方法5c：4，4’-二氟基联苯-3，3’，5，5’-四磺酸(K)(分子量＝510.44)

如5a相同的方法，使用9.51g干的4，4’-二氟基联苯(50mmol，分子量＝190.19)和106.8g30％发烟硫酸(400mmol，分子量＝80.06)，30℃搅拌24小时，然后搅拌加热到110℃再保持72小时。用29.6g蒸馏水和185ml丙腈进行结晶。产量为17.2g(65％)四磺酸产物，其为单水的白色结晶。

本领域技术人员可以理解的是，相似或类似的方法可以用于制备图3中的化合物，所有的这些化合物用如上所示的通式(IV-C)表述。

在本发明公开的启示下和基于本领域技术人员的常识，本领域技术人员无需过量的实验就能够制造和执行本发明公开的和要求保护的所有组合物和方法。尽管本发明的组合物和方法以某种优选实施方案方式描述，在没有脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，对本发明所描述的组合物和/或方法和该方法中的步骤或步骤顺序的变型对于本领域普通技术人员是显而易见的。更具体地，在此描述的试剂显然可以由某种化学或生理学相关的试剂代替而获得相似或相同的效果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些相似的替代和修改都意味着落在本发明所附权利要求保护的精神、范围和概念之中。