一种同时检测19种喹诺酮类药物的HPLC－ESI－MS/MS测定方法

摘要

一种同时检测19种喹诺酮类药物的HPLC－ESI－MS/MS测定方法，属于抗生素类药物分折技术领域。本发明包括样品处理、液相分离、质谱检测三个步骤，对组织液中19种喹诺酮类抗生素进行正离子MRM扫描，以诺氟沙星－D5为内标，采用C18色谱柱分离，以含甲酸的水－甲醇为流动相作梯度洗脱，对洗脱液进行质谱检测；其特点为根据样品的实际情况和对检测灵敏度的不同要求，采用有机溶剂提取方法进行样品的预处理，以诺氟沙星－D5为内标，采用C18色谱柱，以含甲酸的水－甲醇为流动相作梯度洗脱。本方法前处理过程快速简便，检测结果可靠灵敏，适用于动物性食品中喹诺酮类药物残留的分析检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时检测动物性食品中多种喹诺酮类抗生素的方法，更具体是涉及一种可同时对鸡肉、鱼肉中19种喹诺酮类抗生素进行定量测定的HPLC-ESI-MS/MS方法。属于抗生素类药物分折技术领域。

背景技术

喹诺酮是一类合成抗生素类药物，在化学上与萘啶酮酸相关，其作用机理是直接作用于细菌的核、抑制细菌的DNA旋转酶，使酶不能在DNA双链上引入切口，破坏细菌的代谢和繁殖，迅速杀灭细菌。最初这类药物用于治疗尿道感染，现在已发展到治疗系统感染疾病，并且在动物饲养中作为预防和治疗药物普遍使用。近年来，这些药物在动物组织中的残留已引起广泛的注意。联合国粮农组织、世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。

喹诺酮类药物各种残留分析方法，主要包括高效液相法(HPLC)以及与此相关的HPLC-UV、HPLC-FD、HPLC-DVD、LC-MS/MS，LC-ESI-MS/MS。LesleyJohnston等用HPLC-MS法检测鱼类和海产品中的喹诺酮类和氟喹诺酮类药物的残留，所有被分析物均获得很好的回收率，检测极限达到1～3mg/kg。Gery vanVyncht等用LC-ESI-MS-MS法检测猪肾中的11种喹诺酮类药物。

但在上述液质联用法中均为针对少数喹诺酮类抗生素的研究，对不同种类药物尚没有一种通用性的分析方法，故对多数喹诺酮类抗生素的分析缺乏实用性。另外，尿样中毒品分析存在着明显的杂质干扰，因而影响了检验的准确性与可靠性。而且现有样品的分析操作步骤复杂，分析周期长，难以实现快速筛选分析。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中只能测定少数喹诺酮类抗生素的缺陷，提供一种可有效地检测出多种喹诺酮类抗生素的液质联用方法，该方法旨在建立同时测定动物肌肉组织中19种喹诺酮类抗生素药物(恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、双氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、丹诺沙星、氟罗沙星、马波沙星、伊诺沙星、奥比沙星、培氟沙星、萘啶酸、吡哌酸、洛美沙星和西诺沙星)多残留的HPLC-ESI-MS/MS检测方法。组织样品使用有机相提取。本方法前处理过程快速简便，检测结果可靠灵敏，适用于动物性食品中喹诺酮类药物残留的分析检测。

本发明的技术方案：一种同时检测19种喹诺酮类药物的HPLC-ESI-MS/MS测定方法，包括样品处理、液相分离、质谱检测三个步骤，对组织液中19种喹诺酮类抗生素进行正离子MRM扫描，以诺氟沙星-D5为内标，采用C18色谱柱分离，以含甲酸的水-甲醇为流动相作梯度洗脱，对洗脱液进行质谱检测；

(1)标准溶液的配制

分别称取恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、双氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、丹诺沙星、氟罗沙星、马波沙星、伊诺沙星、奥比沙星、培氟沙星、萘啶酸、吡哌酸、洛美沙星、西诺沙星19种标准品10mg，分别溶解于甲醇定容至10mL，即为1mg/mL的标准贮备液；分别量取适量19种标准贮备液，配制19种喹诺酮类药物的混合标准工作液10μg/mL；将混合标准工作液用甲醇配制成0.3ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL和50ng/mL的标准溶液，HPLC-ESI-MS/MS测定，以各组分的色谱峰面积对浓度作线性回归，得定量标准曲线；

(2)样品处理：

称取均质的2.00±0.02g空白鸡或鱼肌肉组织置于50mL离心管中，添加适量的标准溶液，旋涡混匀，避光静置15min后，加入10mL乙腈进行提取，涡动15min，3500r/min离心5min，过滤；残留组织用10mL乙腈重复提取一次，合并上清液，用氮气吹干，然后加入1.0mL 30％甲醇溶液溶解吹干物，0.45μm滤膜过滤，作为待测组织液；

(3)液相分离：

色谱柱：C18反相色谱柱150×2.1mm i.d.3μm；

流动相：0.1％甲酸水溶液-甲醇混合液，梯度洗脱条件：

表1HPLC-ESI-MS/MS系统流动相梯度洗脱条件

即0～1min 0.1％甲酸水溶液-甲醇的体积比为90∶10，

1～4min 0.1％甲酸水溶液-甲醇的体积比为90～10∶10～90，

4～8min 0.1％甲酸水溶液-甲醇的体积比为10∶90，

8～8.5min 0.1％甲酸水溶液-甲醇的体积比为10～90∶90～10，

8.5～11min 0.1％甲酸水溶液-甲醇的体积比为90∶10；

流速：0.2mL/min；

进样量：25μL；

柱温：20℃；

(4)质谱检测：

离子源：            电喷雾离子源；

扫描方式：          正离子扫描；

检测方式：          多级反应检测；

电喷雾毛细管电压：  4.2kV；

毛细管温度：        350℃；

辅助气体流速：      5L/h；

鞘气体流速：        20L/h；

倍增器电压：        920V

二级碰撞气：        氦气。

正离子MRM扫描分析时，各喹诺酮类抗生素的离子选择通道m/z分别为：恩诺沙星360/316，环丙沙星332/231，诺氟沙星320/276，氧氟沙星362/318，氟甲喹262/244，噁喹酸262/244，双氟沙星400/382，沙拉沙星386/368，司帕沙星393/292，丹诺沙星358/340，氟罗沙星370/326，马波沙星363/320，伊诺沙星321/303，奥比沙星396/352，培氟沙星334/290，萘啶酸233/215，吡哌酸304/217，洛美沙星352/308，西诺沙星263/245，内标诺氟沙星-D5325/281，其中各化合物离子通道范围可为±0.5amu。

样品处理采用有机溶剂提取方法进行样品的预处理；液相分离采用直接进样法。

浓度计算方法和检测限：

按内标法以峰面积或峰高法计算出组织液中这19种喹诺酮类抗生素的浓度。19种喹诺酮类抗生素在低浓度范围0.3～50ng/mL线性良好，可以满足定量分析的需要。检测限均为0.3ng/mL。回收率实验在鸡肉或鱼肉中加入已知量的标准溶液后进行回收率实验，按样品的处理方法进行操作并进样分析，平行测定6次，根据工作曲线采用外标法定量计算回收率，平均回收率分别为：鸡肉75.3％～96.3％、鱼肉79.7～94.2％，日内和日间变异系数均小于10％。

本发明的有益效果：

1、本发明方法样品处理方法操作简便，基质对毒品的定量检测无干扰。

2、本发明方法所同时测定的喹诺酮类抗生素基本包括了现有养殖中中所涉及的种类，对样品的检测专一性强、灵敏度高，各项方法学指标均可简便、可靠地满足实际检测的需要。

附图说明

所述19种喹诺酮类抗生素的相关标准曲线、离子色谱图、质谱图、空白离子色谱图均巳建立，但由于篇幅所限，仅以达氟沙星的谱图曲线作为示例。

图1达氟沙星标准曲线。

图2达氟沙星离子色谱图。

图3达氟沙星质谱图。

图4空白猪肉离子色谱图(不含有达氟沙星)。

具体实施方式

一、实验部分

1.仪器与试剂

Accela高效液相色谱(美国菲尼根公司)，包括Autosampler和Accela pump；TSQ QuantumAccess质谱仪(美国菲尼根公司)；BP211D型电子分析天平(德国赛多利斯sartorius)；可调微量加样器系列(Thermo Labsystems公司)；KQ-250DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；氮吹仪(OrganomationAssociates，Jnc.公司)；WH-861.旋涡混合器(江苏省华利达试验设备公司)；RJ-LD-IIB低速台式离心机(无锡市瑞江分析仪器有限公司)；恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星等19种喹诺酮类药物(西格玛奥德里奇公司)；其他化学试剂均为分析纯。

2.标准溶液的配制

分别称取适量恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、双氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、丹诺沙星、氟罗沙星、马波沙星、伊诺沙星、奥比沙星、培氟沙星、萘啶酸、吡哌酸、洛美沙星和西诺沙星19种标准品10mg，分别溶解于甲醇定容至10mL，即为1mg/mL的标准贮备液；分别等量量取19种标准贮备液，配制19种喹诺酮类药物的混合标准工作液10μg/mL；将混合标准工作液用甲醇配制成0.3、1、2、5、10、20和50ng/mL的标准溶液，进行HPLC-ESI-MS/MS测定。以各组分的色谱峰面积对浓度作线性回归，得定量标准曲线。

3.样品处理

称取均质的2.00±0.02g空白鸡或鱼肌肉组织置于50mL离心管中，添加适量的标准溶液，旋涡混匀，避光静置15min后，加入10mL乙腈进行提取，涡动15min，3500r/min离心5min，过滤；残留组织用10mL乙腈重复提取一次，合并上清液，用氮气吹干，然后加入1.0mL 30％甲醇溶液溶解吹干物，0.45μm滤膜过滤，作为待测组织液。

4.色谱条件

色谱柱：C18反相色谱柱(150×2.1mm i.d.3μm)

流速：0.2mL/min

进样量：25μL

柱温：20℃

流动相：0.1％甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脱条件：0～1min，0.1％甲酸和10％甲醇；1～4min，0.1％甲酸和10％～90％甲醇；4～8min，0.1％甲酸和90％甲醇；8～8.5min，0.1％甲酸和90％～10％甲醇；8.5～11min，0.1％甲酸和10％甲醇

5.质谱条件

离子源：            电喷雾离子源

扫描方式：          正离子扫描

检测方式：          多级反应检测

电喷雾毛细管电压：  4.2kV

毛细管温度：        350℃

辅助气体流速：      5L/h

鞘气体流速：        20L/h

倍增器电压：        920伏

二级碰撞气：        氦气

其他条件见表2。

表2HPLC-ESI-MS/MS法测定电喷雾离子源的设置

注：加有下划线的为定量离子。

6.标准曲线的绘制

取空白动物组织按所述方法进行提取，在样品中分别加入0、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00ng/mL浓度的喹诺酮类药物(QNs)的混合标准工作液，吹干，用30％甲醇溶液定容1mL，经0.45μm的滤膜过滤，HPLC-ESI-MS/MS测定。每一浓度设3个平行，并进样三次，以标准工作液的浓度为横坐标，各药物定量子离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

7.检测限的测定

检测限是指在噪声背景上恰能产生可辨认样品峰时的最低样品量。一般定义为可辨认样品峰信号二倍于噪声信号时的样品浓度。

8.准确度、精密度、重复性的测定

准确度以组织添加样本的回收率表示，精密度用同批次样品的回收率的变异系数表示。重复性以随机选取3日的平均日间变异系数表示。

取2.00g鸡肉或鱼肉，以0.3ng/g、1.0ng/g、10ng/g三个添加水平，按上述样品前处理方法处理，HPLC-ESI-MS/MS检测。根据各组分的峰面积，计算相应浓度的回收率和变异系数。准确度和重复性试验随机选取3日进行测定，每日测定一批，每个添加浓度随机取6个样品，3日所测定的平均回收率为该方法的准确度，3日的日内变异系数为该方法的精密度，3日的日间变异系数为该方法的重复性。

二、实验结果

1.分离结果

本法分析速度快，完成一次分析只需11min。在该实验条件下，空白样品对19种药品和内标的分析均无干扰。空白组织液样品添加药品的色谱图见图1。

2.检测结果

1)标准曲线、线性范围和检出限

采用空白样品提取液来配制所使用的一系列基质标准工作溶液，绘制标准曲线进行定量，来消除因基质而带来的离子抑制对定量测定的影响。在确定的最佳条件下，进行测定。以各组分的峰面积(Y)对浓度(X)绘制标准曲线，线性关系和相关系数见表3。结果表明，19种QNs在低浓度范围0.3～50ng/mL线性良好，可以满足定量分析的需要。

表3线性分析、相关系数和检出限

2)回收率和精密度

回收率实验在鸡肉或鱼肉中加人已知量的标准溶液后进行回收率实验，按样品的处理方法进行操作并进样分析，平行测定6次，根据工作曲线采用外标法定量计算回收率，平均回收率分别为鸡肉75.3％～96.3％、鱼肉79.7～94.2％，日内和日间变异系数均小于10％。

表4鱼肉中的回收率及变异系数(n＝6)

表5鸡肉中的回收率及变异系数(n＝6)