一种产角蛋白酶的粘金黄杆菌及其分离方法

摘要

本发明公开了一种产角蛋白酶的粘金黄杆菌及其分离方法。所述粘金黄杆菌拉丁名为Chryseobacterium L99，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2295。本发明公开了该菌的形态学特征为：菌体杆状，不产孢子，无运动性，革兰氏染色呈阴性。本发明公开了该菌的全细胞脂肪酸主要成份为：十三甲基十四酸47.59％，二羟基－13－甲基十四酸和(或)Ω－7－顺式－13甲基－十五酸15.72％，三羟基－15－甲基十六酸13.91％，Ω－9－顺式－14甲基棕榈酸9.48％。本发明还公开了该菌的16S核糖体DNA(16S rDNA)全序列。本发明公开的分离方法包括三个步骤：普通营养培养基富集培养，以角蛋白为唯一碳氮源固体培养基初筛，以角蛋白为唯一碳氮源液体培养基的复筛。该方法快捷有效，所得菌种产酶能力强。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株产角蛋白酶的粘金黄杆菌及其分离方法。

背景技术

角蛋白的化学结构稳定，不溶于水，不易被生物降解，是一种抗性很强的硬性蛋白。在自然界中，角蛋白主要以动物的毛发、羽毛、鳞片、蹄和角等形式存在。角蛋白不能被一般的蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶)水解，高温高压处理角蛋白方法成本高、营养成分破坏严重、水解程度不均一。角蛋白酶可特异性地降解角蛋白，筛选角蛋白酶的高产菌株对于角蛋白废物的回收利用和环境保护都有着重大的意义。

角蛋白酶能够温和高效地水解羽毛等角蛋白废弃物，生产饲料、肥料。该法生产的饲料节约能源、成本低、质量好，能够较好的被动物利用。在含有角蛋白的饲料中，添加角蛋白酶也可以提高动物对角蛋白的吸收利用，提高经济效益。角蛋白能够选择性的水解羊毛、皮革表面的角蛋白，有望取代传统的羊毛剥鳞和鞣革工艺，实现传统产业的绿色环保改造。角蛋白酶能改善化妆品、外用药物在皮肤中的通透性，在医药、化妆品等工业都有着广泛的应用前景。产角蛋白酶的粘金黄杆菌Chryseobacterium L99，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2295。

发明内容

本发明的目的是提供一株产角蛋白酶的粘金黄杆菌及其分离方法。

产角蛋白酶的粘金黄杆菌Chryseobacterium L99，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2295。

所述的粘金黄杆菌形态学特征为：菌体为杆状，不产孢子，无运动性。革兰氏染色呈阴性，在营养琼脂培养基上形成黄色群落。

粘金黄杆菌的16S核糖体DNA(16S rDNA)全序列为：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCGGGAGGCCTAACACATGCAAGCCGAGCGGTAGAGA

TTCTTCGGAATCTTGAGAGCGGCGCACGGGTGCGGAACACGTGTGCAACCTGCCTTTATCTGGGGGAT

AGCCTTTCGAAAGGGAGATTAATACCCCATAATATACTGAGTGGCATCACTTATTATTGAAAACTCCG

GTGGATAGAGATGGGCACGCGCAAGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCAATGATCT

TTAGGGGGCCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCA

GCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGTGAGAGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGAAGGACGACGGCCCT

ATGGGTTGTAAACTTCTTTTGTACAGGGATAAACCTTTCCACGTGTGGAAAGCTGAAGGTACTGTACG

AATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTT

ATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGATCTGTAAGTCAGTGGTGAAATCTCATAGCTTAACTATGAAA

CTGCCATTGATACTGCAGGTCTTGAGTAAGGTAGAAGTAGCTGGAATAAGTAGTGTAGCGGTGAAATG

CATAGATATTACTTAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTTACTATGTCTTAACTGACGCTGATGGACGA

AAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGCTAACTCGTTTTT

GGGTTTTCGGATTCAGAGACTAAGCGAAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGAACGCAAGTTT

GAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGATTATGTGGTTTAATTCGATGATACGCG

AGGAACCTTACCAAGACTTAAATGGGAATTGACAGATTTAGAAATAGATCCTCCTTCGGGCAATTTTC

AAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAAC

CCCTGTCACTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGGACTCTAGTGAGACTGCCTACGCAAGTAGAGAGGAAG

GTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCTTGGGCCACACACGTAATACAATGGCCGGTAC

AGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCAAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCA

ACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCG

GGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGTCTGGGGTACCTGAAGTCGGTGACCGTAACAGGA

GCTGCCTAGGGTAAAACAGGTAACTAGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAACC

粘金黄杆菌的全细胞水解脂肪酸含量为：

脂肪酸种类        含量(％)

11:0iso 3-OH      0.11

13:0iso           1.89

Unknown 13.566    2.65

14:0              0.22

14:1ω5c          0.39

15:0iso           47.59

15:0iso3-OH       2.89

15:0anteiso       0.82

16:0              0.83

16:03-OH          0.59

16:0iso 3-OH      0.21

16N alcohol       0.15

Unkown 16.580     0.89

17:0iso           1.14

17:0iso 3-OH      13.91

17:1iso ω9c         9.5

18:1iso ω5c         0.24

16:1ω7c/15iso 2-OH  15.7

17:1isoI/antei B     0.29

产角蛋白酶的粘金黄杆菌的分离方法包括如下步骤：

1)分别取不同来源的含角蛋白废弃物的污水5～10ml加入到50～200ml富集培养基中，20～37℃、摇床转速100～250rpm，富集培养24～72小时；

2)取上述富集物5～10ml加入到50～200ml液体筛选培养基中，同样条件下培养，重复上述筛选步骤2～5次后，取10～50ul培养液稀释后涂到固体筛选培养基上；

3)挑取单菌落，再在液体筛选培养基中培养，比较并选取角蛋白酶酶活较高的菌株。

所述的富集培养基的成份为：每1000毫升中含NaCl 5～10克、牛肉膏5～10克，蛋白胨5～10克和水900～1000毫升。

所述的液体筛选培养基的成份为：每1000毫升中含羽毛粉10～100克、K₂PO₄2～6克、NaH₂PO₄·2H₂O 2～6克、MgCl₂·6H₂O 0.1～5克和水900～1000毫升。

所述的固体筛选培养基的成份为：每1000毫升中含羽毛粉10～100克、K₂PO₄2～6克、NaH₂PO₄·2H₂O 2～6克、MgCl₂·6H₂O 0.1～5克、水900～1000毫升和10～20克琼脂粉。

经与其他菌种和分离方法比较、反复试验验证，本发明的优点是：

1)所述的粘金黄杆菌产角蛋白酶所需的发酵周期短、角蛋白酶活高、操作过程简便、发酵成本低、后处理步骤简单。

2)所述的粘金黄杆菌角蛋白酶对羽毛降解效率高，降解后的产物营养成份均一，氨基酸含量高，在畜牧业和饲料业应用前景好。

3)所述的粘金黄杆菌角蛋白酶对于羊毛织物和皮革表面有明显的降解作用，用于毛纺工业能够降低污染、提高产品性能、增加产品的附加值。

4)所述的菌种产生的角蛋白酶切割活性较广，可用于消化蛋白，在分子生物学、细胞生物学有着广泛的应用前景。

5)所述的分离方法简单有效，针对性强，假阳性结果少的优点。

附图说明

附图是粘金黄杆菌Chryseobacterium L99的16SrDNA序列系统进化分析实例示意图。

具体实施方式

实施例1

1)取含有羽毛废弃物的污水5ml，加入到50ml富集培养基中，30℃，200rpm，富集培养72小时；富集培养基的成份为：每1000毫升中含NaCl 5克、牛肉膏5克，蛋白胨5克和水980毫升。

2)取上述富集培养物5ml，加入到50ml液体筛选培养基中，同样条件下培养，重复上述筛选步骤3次后，取10μl培养液稀释后涂到固体筛选培养基上。固体筛选培养基的成份为：每1000毫升中含羽毛粉20克、K₂PO₄ 4克、NaH₂PO₄·2H₂O 2克、MgCl₂·6H₂O 0.2克、琼脂粉20克和水980毫升。

3)挑取单菌落，再在液体筛选培养基中培养，比较并选取角蛋白酶酶活较高的菌株。液体筛选培养基的成份为：每1000毫升中含羽毛粉20克、K₂PO₄ 4克、NaH₂PO₄·2H₂O 2克、MgCl₂·6H₂O 0.2克和水980毫升。

实施例2

1)取含有羊毛废弃物的污水10ml，加入到100ml富集培养基中，30℃，200rpm，富集培养48小时；富集培养基的成份为：每1000毫升中含NaCl 10克、牛肉膏6克，蛋白胨6克和水980毫升。

2)取上述富集培养物10ml，加入到100ml液体筛选培养基中，同样条件下培养，重复上述筛选步骤5次后，取20μl培养液稀释后涂到固体筛选培养基上。固体筛选培养基的成份为：每1000毫升中含羽毛粉40克、K₂PO₄ 5克、NaH₂PO₄·2H₂O 2克、MgCl₂·6H₂O 0.3克、琼脂粉15克和水980毫升。

3)挑取单菌落，再在液体筛选培养基中培养，比较并选取角蛋白酶酶活较高的菌株。液体筛选培养基的成份为：每1000毫升中含羽毛粉40克、K₂PO₄ 5克、NaH₂PO₄·2H₂O 2克、MgCl₂·6H₂O 0.3克和水980毫升。

实施例3

1)取含有头发废水5ml，加入到100ml富集培养基中，25℃，200rpm，富集培养72小时；富集培养基的成份为：每1000毫升中含NaCl 10克、牛肉膏5克，蛋白胨5克和水980毫升。

2)取上述富集培养物10ml，加入到100ml液体筛选培养基中，同样条件下培养，重复上述筛选步骤4次后，取30μl培养液稀释后涂到固体筛选培养基上。固体筛选培养基的成份为：每1000毫升中含羽毛粉30克、K₂PO₄ 4克、NaH₂PO₄·2H₂O 2克、MgCl₂·6H₂O 0.5克、琼脂粉20克和水980毫升。

3)挑取单菌落，再在液体筛选培养基中培养，比较并选取角蛋白酶酶活较高的菌株。液体筛选培养基的成份为：每1000毫升中含羽毛粉300克、K₂PO₄ 4克、NaH₂PO₄·2H₂O 2克、MgCl₂·6H₂O 0.5克和水980毫升。

实施例4：粘金黄杆菌Chryseobacterium L99，CGMCC No.2295与其他粘金黄杆菌形态及理化特征的比较鉴定如下：

菌种名称：1，Chryseobacterium L99；2，C.meningosepticum(n＝49)；3，C.defluvii；4，C.daeguense 5，C.wanjuense；6，C.taiwanense；括号中的数字表示发现的菌株数目。+，阳性；W，弱阳性；-，阴性；NA，未知.

Characteristic     1  2    3  4  5  6

Growth on/at：

MacConkey agar     +  +    -  -  w  NA

5℃                -  -    -  -  +  +

37℃               +  +    +  +  +  +

42℃               -  -    +  -  -  +

Nitrate reduction  -  -    -  -  -  NA

Nitrite reduction  -  +    +  -  NA -

Hydrolysis of：

Aesculin           +  47/49+  NA NA NA

Starch             -  -    +  +  +  +

Production of：

Hydrogen sulphide  w  -    -  NA NA -

Indole             -  24/49+  -  -  +

Acid production from：

L-Arabinose        -  1/49 -  w  -  +

D-Cellobiose       w  4/49 w  +  -  +

D-Glucose          +  +    +  +  +  -

D-Lactose          -  27/49-  NA -  NA

D-Maltose          +  46/49+  +  -  -

Sucrose            -  -    -  -  -  NA

D-Mannitol         -  31/49-  NA -  NA

D-Trehalose    +  42/49 +  +  +  -

D-Xylose       -  3/49  -  w  -  NA

实施例5：粘金黄杆菌Chryseobacterium L99，CGMCC No.2295与其他粘金黄杆菌的全细胞脂肪酸比较分析如下：

菌种名称和编号：1，Chryseobacterium L99；2，C.meningosepticum；3，C.taiwanense；4，Bergeyella zoohelcum；5，C.wanjuense；6，C.defluvii，tr，微量(＜1％)；ND，未检出

FATTY ACID       1     2     3         4    5    6

13:0iso          1.9   1.4   1.0±0.1  1.5  tr   2.8

Unknown 13.566*  2.7   1.5   2.6±0.1  1.8  2.9  tr

14:0             tr    ND    ND        ND   ND   ND

14:1 ω5c        tr    ND    ND        ND   ND   ND

15:0iso          47.6  41.2  43.2±0.7 47.8 40.0 58.5

15:0iso 3-OH     2.9   3.5   3.8       4.0  3.7  2.6

15:0anteiso      tr    2.2   1.0±0.1  ND   tr   3.2

16:0             tr    tr    1.4±0.1  tr   tr   1.3

16:0 3-OH        tr    2.2   tr        ND   ND   tr

16:0iso 3-OH     tr    tr    ND        1.2  tr   tr

16N alcohol      tr    ND    ND        ND   ND   ND

Unkown 16.580    tr    1.7   0.8±0.2  1.4  ND   tr

17:0 2-OH        ND    tr    tr        ND   ND   0.3

17:0iso          1.1   tr    1.3±0.1  ND   2.9  2.0

17:0iso 3-OH     13.9  16.3  16.6±1.1 13.5 21.9 14.1

17:1iso ω9c     9.5   7.0   17.5±0.2 19.5 11.7 4.8

18:1iso ω5c     tr    tr    ND        ND   ND   ND

Summed feature15.7  18.0  7.9±0.1  9.0  11.0  8.4

Summed featuretr    tr    ND        1.5  ND    ND

*未知脂肪酸

Summed feature 4包括15:0iso 2-OH and/or 16:1v7c/t.Summed feature5包括17:1 isoIand/or 17:1 anteiso B.

实施例5：粘金黄杆菌Chryseobacterium L99，CGMCC No.2295的16SrDNA序列的系统进化分析实例见附图1：

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。

本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。