5,6－二甲基噻吩并2,3－DI嘧啶衍生物，其制备方法和用于抗病毒的包含其的药物组合物

摘要

本发明公开的是用作抗病毒剂的5，6－二甲基噻吩并[2，3－d]嘧啶衍生物。更具体而言，公开的是对于丙型肝炎病毒(HCV)的增殖具有优异的抑制作用的、由式1表示的5，6－二甲基噻吩并[2，3－d]嘧啶衍生物，其药用盐，其制备方法，和含有这些化合物作为活性成分的用于预防和治疗丙型肝炎病毒(HCV)的药物组合物。由式1表示的5，6－二甲基噻吩并[2，3－d]嘧啶衍生物具有抑制丙型肝炎病毒增殖的优异作用并且还具有低毒性。因而，这些化合物可用作为预防和治疗丙型肝炎的药剂。

说明书

【技术领域】

本发明涉及用作抗病毒剂的5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物，并且更具体涉及用于预防和治疗丙型肝炎的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的新的对于丙型肝炎病毒的增殖具有优异抑制作用的5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物。

【背景技术】

丙型肝炎病毒(HCV)是属于黄病毒家族的含膜病毒。其基因组是(+)-RNA(正链RNA)，其长度为9.6kb并且表达由3,010个氨基酸组成的多蛋白(poly-protein)。所述多蛋白由它的宿主细胞和病毒的酶分成3个结构蛋白质和6个非结构蛋白质。

HCV基因组的5’和3’末端具有非翻译的区域，其中几乎全部基因型的碱基序列是高度保守的。在5’末端的330-341个核苷酸，和在3’末端的多聚腺苷酸下游的98个核苷酸，是最近发现的，认为其在病毒的RNA复制和翻译中起重要作用。病毒基因组的氨基末端构成病毒的结构蛋白质，核心，E1和E2，并且其余区域构成非结构蛋白质。核心基因由病毒壳体蛋白质组成，并且E1和E2由病毒外壳蛋白组成。这些蛋白质通过内质网中的信号肽酶相互释放。非结构蛋白质是由丝氨酸蛋白酶NS3和辅因子NS4A加工的。NS5B是作为RNA-依赖的RNA聚合酶起作用的酶并且在病毒复制中是最重要的。

通过输血和社区获得的感染而发生HCV感染，并且有报道约70％的HCV感染是由肾透析引起的。已知，约20％的HCV感染在5年内引起伴随着肝硬化的急性肝炎，并且发展成肝癌(见Davis等，新英格兰医学杂志(New.Engl.J.Med.)，321，1501，1989；Alter等，在肝脏病学中的当前观点(Current Perspective in Hepatology)中，第83页，1989)。这样一种高的慢性感染率在RNA病毒中是罕见的，并且显示HCV是引起高比例肝癌的介体。关于HCV的连续感染的机理还没有研究。最近，由输血引起的HCV感染已经显著降低了，因为HCV试验对于全部血液是充分进行的，然而，社区获得的HCV感染还没有被控制，并且因而成为重要的世界范围的问题。

在流行病学方面，HCV是世界范围均匀分布的，不像HBV，并且报道世界人口的1.5-2％具有HCV-感染。HCV感染发展成慢性肝炎，并且HCV感染发展成肝硬化和肝癌的可能性显著高于乙型肝炎的感染。因为丙型肝炎病毒按照分类学属于完全不同于乙型肝炎病毒的病毒家族，不可以用乙型肝炎病毒疫苗预防丙型肝炎病毒。并且，虽然尝试用α-IFN治疗丙型肝炎病毒，但是对于α-IFN的反应根据丙型肝炎病毒的基因型而显著变化，并且该治疗方法的效果非常不显著。特别地，在被感染的许多人具有的基因型1b的情况下，α-IFN的治疗效果最不显著。

因为在1989年首次通过克隆分离了HCV的RNA基因组，所以已经进行了许多关于HCV的研究，但是还没有开发针对HCV的有效治疗药物。作为针对HCV感染的治疗剂，当前使用与抗病毒药物利巴韦林组合的干扰素，但是它具有不显著的效果，因为它具有低的治愈率并且显示副作用。因而，需要用于治疗和预防HCV感染的另外化合物。

因此，本发明人努力开发了具有低副作用和毒性并且显示优异的针对HCV的抗病毒活性的化合物，并且，因而，发现在下面由式1表示的5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物对于HCV的增殖具有优异的抑制作用。

【发明内容】

【技术问题】

本发明的一个目的是提供5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物。

本发明的另一个目的是提供用于制备5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物的方法。

本发明的又一个目的是提供用于预防和治疗丙型肝炎的药物组合物，所述药物组合物含有5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物并且对于丙型肝炎病毒(HCV)的增殖具有优异的抑制作用。

【技术方案】

为了实现上述目的，本发明提供5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物。

并且，本发明提供用于制备5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物的方法。

另外，本发明提供用于预防和治疗丙型肝炎的药物组合物，所述药物组合物含有5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物并且对于丙型肝炎病毒(HCV)的增殖具有优异的抑制作用。

【有益效果】

根据本发明的新的5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物具有抑制丙型肝炎病毒增殖的优异效果并且还具有低毒性。因而，这些化合物可以用作预防和治疗丙型肝炎的药剂。

【最佳方式】

在下文中，将详细地描述本发明。

本发明提供由式1表示的5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物：

[式1]

其中R₁表示并且R₂表示或

根据本发明的式1的本发明化合物可以以药用盐的形式使用。作为所述盐，与药用游离酸形成的酸加成盐是有用的。式1的化合物可以根据本领域中已知的任何常规方法形成药用酸加成盐。本发明中可以使用的游离酸包括有机的和无机的酸。所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等，并且所述有机酸包括柠檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甲磺酸、羟基乙酸、琥珀酸、对-甲苯磺酸、谷氨酸、天冬氨酸等。

在另一个方面中，本发明提供根据反应方案1用于制备5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：

1)容许反应方案1中的化合物2的2，4-二氯-5，6-二甲基-噻吩并[2，3-d]嘧啶与化合物3的取代的苯胺反应而获得具有在4位取代的苯胺衍生物的化合物4的2-氯-5，6-二甲基-噻吩并[2，3-d]-嘧啶；

2)容许所述化合物4与化合物5的哌嗪反应而获得化合物6；和

3)容许所述化合物6与化合物7反应而获得式1的5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物：

[反应方案1]

其中

R₁表示和R₂表示或

可以在所述制备方法中使用的反应溶剂的实例包括有机溶剂，诸如甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、氯仿、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮等。优选地，制备方法中的反应在所述溶剂中在一般有机碱存在下在0-150℃的温度进行2-20小时，所述有机碱诸如三乙胺、N，N-二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、1-甲基哌啶、吡啶、2，6-二甲基吡啶、4-二甲基氨基吡啶、或N，N-二甲基苯胺。

在又一个方面中，本发明提供用于治疗或预防丙型肝炎的药物组合物，所述药物组合物含有作为活性成分的式1的5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物和/或其药用盐。

根据本发明的式1的化合物可以经口或肠胃外给药用于在临床应用中治疗丙型肝炎，并且可以以通常的药物剂型形式使用。具体而言，式1的本发明化合物可以以经口或肠胃外(优选，注射)剂型的形式在急性临床应用中给药。可以利用一般的稀释剂或赋形剂诸如一般的填充剂、载体、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂配制本发明的化合物。用于口服给药的固体剂型包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、和胶囊，并且通过将式1的化合物与至少一种赋形剂混合而制备，所述赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶。用于口服给药的液体剂型包括混悬剂、溶液、乳剂、糖浆剂等，并且可以含有多种赋形剂，例如，润湿剂、调味剂、芳香剂和防腐剂，还有经常使用的简单稀释剂水和液体石蜡。用于肠胃外给药的剂型包括无菌的水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳化剂等。可以在本发明中使用的非水溶剂和悬浮剂的实例包括植物油诸如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油，以及可注射的酯诸如油酸乙酯。

虽然可以根据患者的性别、年龄和病症适合地选择式1的本发明的化合物的有效剂型，但是本发明的化合物通常可以以10-1000mg/天，并且优选20-500mg/天，一天1-3次的剂量给药至成人。

【具体实施方式】

在下文中，将关于实施例和试验例更详细地描述本发明。然而，应当理解，这些实施例仅是用于说明性目的，并且不应当解释成限制本发明的范围。

实施例1：4-[5，6-二甲基-4-(4-吗啉-4-基-苯基氨基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-2-基]-哌嗪-1-基-吡啶-2-基-甲酮的制备

向50ml乙醇中的240mg(1.02mmol)的2，4-二氯-5，6-二甲基-噻吩并[2，3-d]嘧啶中添加220.20mg(1.23mmol)的4-(4-吗啉代)苯胺和130.90mg(1.23mmol)的苯胺，并且然后将混合物在回流下搅拌。在反应完成后，将反应溶剂乙醇在减压下蒸发，并且将残渣从乙醇结晶并过滤，产生430mg(定量的)2-氯-5，6-二甲基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-基-4-吗啉-4-基-苯胺。将220mg(0.53mmol)得到的产物在密封管中溶解在20ml的1-丁醇中，并且向其添加223μl(1.59mmol)的三乙胺和45.9mg的哌嗪，并且将混合物在120℃搅拌。在反应完成后，将得到的固体过滤并将滤液在减压下浓缩，然后从乙酸乙酯结晶，产生30mg(15％收率)的5，6-二甲基-2-哌嗪-1-基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-基-4-吗啉-4-基-苯胺。向5ml二甲基氯中的9mg(0.02mmol)所得到化合物和5，6-二甲基-2-哌嗪-1-基--噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-基-4-吗啉-4-基-苯胺添加3.5μl(0.02mmol)的三乙胺和4.1mg(0.02mmol)的皮考啉酰氯盐酸盐，然后将混合物在室温搅拌3小时。在反应完成后，在减压下蒸发反应溶剂二甲基氯，并且将残渣从二甲基氯结晶，因而获得6mg(30％收率)的标题产物。

¹H NMR(CDCl₃)ppm：8.85-8.95(d，1H)，8.27-8.35(m，1H)，7.79-8.01(m，1H)，7.60-7.79(m，1H)，7.25-7.30(m，2H)，6.87-6.95(m，2H)，3.92-3.70(m，10H)，3.40(br，2H)，3.18-3.13(t，J＝3.4Hz，4H)，2.50(s，3H)，2.37(s，3H)。

实施例2：4-[5，6-二甲基-4-(4-吗啉-4-基-苯基氨基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-2-基]-哌嗪-1-基-吡啶-3-基-甲酮的制备

以实施例1中的相同方式获得标题产物(45％收率)，不同之处在于使用烟酰氯盐酸盐替代皮考啉酰盐酸盐。

¹H NMR(CDCl₃)ppm：9.20(s，1H)，8.99-9.05(m，1H)，8.88-8.99(m，1H)，8.11-8.30(m，1H)，7.25-7.38(d，2H)，6.85-6.95(d，2H)，3.92-3.76(m，10H)，3.42(br，2H)，3.18-3.14(t，J＝3.4Hz，4H)，2.53(s，3H)，2.39(s，3H)。

实施例3：4-[5，6-二甲基-4-(4-吗啉-4-基-苯基氨基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-2-基]-哌嗪-1-基-吡啶-4-基-甲酮的制备

以实施例1中的相同方式获得标题产物(48％收率)，不同之处在于使用异烟酰氯盐酸盐替代皮考啉酰盐酸盐。

¹H NMR(CDCl₃)ppm：8.75(d，J＝5.6Hz，2H)，7.46(d，J＝9.0Hz，2H)，7.34(d，J＝1.6Hz，2H)，7.04(s，1H)，6.93(d，J＝8.8Hz，2H)，3.92-3.76(m，10H)，3.41(br，2H)，3.19-3.14(t，J＝3.4Hz，4H)，2.51(s，3H)，2.39(s，3H)

实施例4：4-[5，6-二甲基-4-(6-吗啉代吡啶-3-基氨基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-2-基]-哌嗪-1-基-吡啶-2-基-甲酮的制备

向50ml乙醇中的240mg(1.02mmol)的2，4-二氯-5，6-二甲基-噻吩并[2，3-d]嘧啶中添加226.40mg(1.26mmol)的6-吗啉代吡啶-3-胺和130.90mg(1.23mmol)碳酸钙，并且然后将混合物在回流下搅拌。在反应完成后，将反应溶剂乙醇在减压下蒸发，并且将残渣从乙醇结晶并过滤，产生440mg(定量的)2-氯-5，6-二甲基-N-(6-吗啉代吡啶-3-基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺。将200mg(0.50mmol)得到的产物在密封管中溶解在20ml的1-丁醇中，并且向其添加220μl(1.50mmol)的三乙胺和45.9mg的哌嗪，并且将混合物在120℃搅拌。在反应完成后，将得到的固体过滤并将滤液在减压下浓缩，然后从乙酸乙酯结晶，产生25mg(12％收率)的5，6-二甲基-N-(6-吗啉代吡啶-3-基)-2-(哌嗪-1-基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-胺。向5ml二甲基氯中的9mg(0.02mmol)所得到化合物，5，6-二甲基-2-哌嗪-1-基-噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-基-4-吗啉-4-基-苯胺添加3.5μl(0.02mmol)的三乙胺和4.1mg(0.02mmol)的皮考啉酰氯盐酸盐，然后将混合物在室温搅拌3小时。在反应完成后，在减压下蒸发反应溶剂二甲基氯，并且将残渣从二甲基氯结晶，因而获得7mg(35％收率)的标题产物。

¹H NMR(CDCl₃)ppm：9.05(s，1H)，8.85-8.95(d，1H)，8.27-8.35(m，1H)，7.79-8.01(m，1H)，7.60-7.79(m，1H)，7.25-7.30(m，1H)，6.87-6.95(m，1H)，3.72-3.50(m，8H)，3.22-3.45(m，8H)，2.40(s，3H)，2.27(s，3H)，1.59-1.51(m，6H)

实施例5：4-[5，6-二甲基-4-(6-吗啉代吡啶-3-基氨基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-2-基]-哌嗪-1-基-吡啶-3-基-甲酮的制备

以实施例4中的相同方式获得标题化合物(35％收率)，不同之处在于使用烟酰氯盐酸盐替代皮考啉酰盐酸盐。

¹H NMR(CDCl₃)ppm：9.17(s，1H)，8.85-8.95(d，1H)，8.27-8.35(m，1H)，7.79-8.01(m，1H)，7.60-7.79(m，1H)，6.99-6.99(d，1H)，6.65-6.77(d，1h)，3.51-3.70(m，8H)，3.23-3.46(m，8H)，2.41(s，3H)，2.25(s，3H)，1.59-1.52(m，6H)

实施例6：4-[5，6-二甲基-4-(6-吗啉代吡啶-3-基氨基)-噻吩并[2，3-d]嘧啶-2-基]-哌嗪-1-基-吡啶-4-基-甲酮的制备

以实施例4中的相同方式获得标题化合物(42％收率)，不同之处在于使用异烟酰氯盐酸盐替代皮考啉酰盐酸盐。

¹H NMR(CDCl₃)ppm：9.17(s，1H)，8.85-8.92(d，2H)，7.83-8.01(d，2H)，6.99-6.79(d，1H)，6.77-6.65(d，1H)，3.70-3.51(m，8H)，3.22-3.47(m，8H)，2.45(s，3H)，2.27(s，3H)，1.56-1.58(m，6H)

实验例1：HCV复制子抑制试验结果

为了检验由式1表示的本发明的5，6-二甲基噻吩基[2，3-d]嘧啶衍生物的HCV复制子抑制活性，进行下列试验。

用于试验HCV抑制活性的复制子是由HCV IRES、新霉素抗性基因、FMDV 2A蛋白酶、renilla萤光素酶、EMCV IRES、HCV非结构蛋白NS3至NS5B、和HCV 3’非翻译区域(NTR)组成的NK-R2AN。将含有丙型肝炎病毒复制子NK-R2AN的肝癌细胞系Huh-7以约30,000个细胞的密度分配到24-孔板的每个板中，并且在37℃在CO₂培养箱中培养24小时，以便将细胞固定到板底部。培养基是含有10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的DMEM动物细胞培养基。将待试验的化合物溶解在DMSO溶剂中并以需要的浓度分配到每个孔中。这里，将相同量的DMSO添加到每个孔中，以便每个孔中的DMSO终浓度是0.5％。在含有2％胎牛血清和1％青霉素链霉素的DMEM动物细胞培养基中，将细胞在37℃在CO₂培养箱中培养48小时，并且将每个培养基用吸出而除去。在用PBS溶液洗涤每个孔以后，将用于Renilla萤光素酶检测的60μl的细胞裂解缓冲液分配到每个孔中，并且将细胞在室温培养30分钟以裂解所述细胞。

将5μl的细胞裂解液添加到30μl的renilla萤光素酶底物溶液并且测量renilla萤光素酶的活性。将20μl的细胞裂解液进行Bradford检测以测量每单位细胞裂解液的蛋白质的量，并且将renilla萤光素酶活性除以通过Bradford检测测量的蛋白质量以计算相对于细胞量的报道基因表达。使用测量的关于丙型肝炎病毒增殖的数据和使用的化合物浓度，用Prism4^TM软件(Graphpad)分析丙型肝炎病毒抑制的结果。

下面的表1显示利用上述试验方法测量的HCV复制子抑制试验结果。

[表]

如上所述，因为本发明的化合物具有抑制丙型肝炎病毒(HCV)的优异效果，所以这些化合物可以用于抑制HCV的增殖。因而，这些化合物可以用作用于预防和治疗丙型肝炎的药剂。

试验例2：细胞毒性试验

为了检验式1的化合物是否显示细胞毒性，利用Hep G2细胞将这些化合物在体外进行众所周知的MTT检测。结果，发现试验中使用的化合物全部显示高于100μg/ml的CC₅₀值，暗示这些化合物具有非常低的细胞毒性。

【工业实用性】

如上所述，根据本发明由式1表示的新的5，6-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物具有抑制丙型肝炎病毒(HCV)增殖的优异效果，并且还具有低毒性。因而，这些化合物可以用作用于预防和治疗丙型肝炎的药剂。