基因或核酸序列的酶切－连接长序列半合成方法

摘要

本发明涉及基因或核酸序列的酶切－连接长序列半合成方法，是通过以下步骤实现的，目标基因或核酸序列分析：对要求合成或获得的目标序列进行分析，设计分段化学合成的片段长度、分割位点；目标基因或核酸序列的片段化学合成：根据上述分析的结果，用化学合成法合成目标基因或脱氧核糖核酸序列的片段，在合成时人为引入适当的限制性内切酶识别位点；目标基因或核酸序列各片段的限制性酶切反应：用能够识别上述位点的限制性内切酶进行酶切反应，产生含有粘性末端的片段；目标基因或核酸序列各片段的正确连接：用适当连接酶对分段合成的基因或核酸序列的片段进行常规的酶促连接反应；可获得10000个碱基对，最长达到13000碱基对；并且错误率低、成本也低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸序列，尤其涉及一种特定长核酸序列的获得方法。

背景技术

在生命科学及医学研究中，特定核酸(如全基因或复杂脱氧核糖核酸)序列的获得已经成为一种必不可少的过程。目前其获得特定序列的途径主要有反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR法)和化学合成法两种。

前者的基本原理是：设计特异性引物，用目标生物的核糖核酸或脱氧核糖核酸为模板，进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR反应)，扩增得到目标序列，能够得到的序长度一般在1500个碱基对以下。

化学法是用人工合成互补引物，然后应用聚合酶链式反应(PCR)扩增得到目的片段，一般能够得到序列的长度一般在3000个碱基对以下，此外，化学合成序列的错误率与所合成序列的长度呈正相关。所以，如何得到10000个碱基对或以上的长片段基因或复杂脱氧核糖核酸序列一直是困扰基因和基因组研究，特别是关于一些长度较大的重要功能基因研究的问题。

如何克服上述缺陷是科技技术人员要解决的问题。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供了一种基因或核酸序列的酶切-连接长序列半合成方法，旨在解决上述的问题。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下步骤实现的：

目标基因或核酸序列分析：对要求合成或获得的目标序列进行分析，设计分段化学合成的片段长度、分割位点；

目标基因或核酸序列的片段化学合成：根据上述分析的结果，用化学合成法合成目标基因或脱氧核糖核酸序列的片段，在合成时人为引入适当的限制性内切酶识别位点；

目标基因或核酸序列各片段的限制性酶切反应：用能够识别上述位点的限制性内切酶进行酶切反应，产生含有粘性末端的片段；

目标基因或核酸序列各片段的正确连接：用适当连接酶对分段合成的基因或核酸序列的片段进行常规的酶促连接反应。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：可获得10000个碱基对，目前最长达到13000碱基对；并且错误率低、成本也低。

附图说明

图1是本发明以限制性内切酶BpiI的一个实施例。请按照提示修改

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

由图1可见：

目标基因或核酸序列分析：对要求合成或获得的目标序列进行分析，设计分段化学合成的片段长度、分割位点，以避免片段中含有不适当的限制性内切酶识别位点，以及达到片段的大小适合化学合成、错误率最小和成本最低之目的；最重要的是：在化学合成前进行精确设计，使得各片段左右两端的粘性末端均不相同，以保证各片段能够按照设计的顺序正确连接。设计时将目标基因或合算序列分为3段进行化学合成，其中有2个拟利用的区段，即NNNNNN/OOOOOO区段和RRRRRR/QQQQQQ区段，其中，N、O、R、Q为任意碱基，但必须符合以下原则：

a)N与O是互补配对碱基，R和Q是互补配对碱基；

b)NNNNNN/OOOOOO区段和RRRRRR/QQQQQQ区段不完全一致；

目标基因或核酸序列的片段化学合成：根据上述分析的结果，用化学合成法合成目标基因或脱氧核糖核酸序列的片段(如图1中的化学合成片段1、2、3等)，在合成时人为引入适当的限制性内切酶识别位点(如图1中的BpiI限制性内切酶识别位点，用箭头表示)；

目标基因或核酸序列各片段的限制性酶切反应：用能够识别上述位点的限制性内切酶进行酶切反应，产生含有粘性末端的片段(图1中含有粘性末端的片段1、2、3等)；

目标基因或核酸序列各片段的正确连接：用适当连接酶对分段合成的基因或核酸序列的片段进行常规的酶促连接反应。由于在化学合成前的精确设计，使得各片段左右两端的粘性末端均不相同，以保证各片段能够按照设计的顺序正确连接。以图1为例：由于N与O是互补配对碱基，R和Q是互补配对碱基，所以含有粘性末端的片段1(含有粘性末端OOOO)和含有粘性末端的片段2(含有粘性末端NNNN)能够正确连接，而含有粘性末端的片段2的另一端同时还含有粘性末端QQQQ，但由于粘性末端QQQQ与片段1的粘性末端OOOO不配对，所以含有粘性末端的片段2不可能反向连接在片段1上。其余片段的连接类推。最后，即可得到按照设计正确连接的目的基因或核酸的全长序列。