利用除草剂巴尔板快速培育芦笋全雄株品系的方法

摘要

本发明公开了一种利用除草剂巴尔板快速培育芦笋全雄株品系的方法。包括如下步骤：1)从生产用的芦笋品种中选择两性株，两性株同株自交获得芦笋种子；2)利用巴尔板浸泡并催芽处理芦笋种子；3)经处理的芦笋种子在营养钵中育苗，生长30～35天后开花，各单株分别同雌性株杂交，按单株留种；4)单株留种的种子再利用巴尔板处理，开花后统计雌雄花的比例，鉴定超雄株；5)利用离体培养法保存与繁殖超雄株无性系；6)利用上述超雄株作为父本同优良雌性系杂交即可获得芦笋全雄品系。本发明极大地缩短了芦笋从幼苗到开花时间，加快了超雄株的鉴定过程，在芦笋全雄株品种的选育中有重要作用，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于作物品种选育技术领域，具体地说，本发明涉及一种芦笋全雄株品种选育的技术，特别是一种利用除草剂巴尔板快速培育芦笋全雄株品系的方法。

背景技术

芦笋学名Asparagus officinalis L，为百合科天门冬属多年生宿根草本植物，以抽生的嫩茎为蔬菜食用，芦笋食用价值高，食之甘香鲜美，有特殊风味；芦笋所含营养元素非常全面而且比例得当，药用价值悠久且使用广泛。芦笋中含有惊人丰富的抗氧化剂、免疫细胞激活剂以及正常细胞的生长调节剂等微量物质。芦笋经济效益显著芦笋用途广，除加工罐头，营养品外，芦笋在欧美、日本、台湾等国家及地区都是极受欢迎的蔬菜，被誉为“世界十大名菜之一”，近年在我国也逐渐受到消费者的认可和青睐，市场前景广阔。

我国自1974年引进美国品种UC500，并在浙江、山东、辽宁、福建等省进行商品性生产种植获得成功。20世纪80年代和90年代，生产上主要采用美国加州的玛丽华盛顿及UC系列品种，也相继引进美国，德国，荷兰，西班牙以及日本品种。例如UC157，Idalea(爱德里)，Franklim(弗兰克林)等，近几年F1杂种的选用已开始引起重视，例如阿波罗(Apollo)、格兰蒂(Grande)、泽西至上(Jersey supreme)、泽西巨人(Jesey knight)等。但目前我国芦笋生产用种几乎全来自国外，这与芦笋在我国发展成为一个大产业很不相称，因此要积极发展我们自己的芦笋种业。随着芦笋植株的更新，今后尚需不断进口种子，这样不仅大大增加了生产成本，而且种子纯度差，严重影响单位面积产量和质量，在芦笋生产大发展的中国，这已经成为阻碍其前进的十分严峻的问题。所以迫切要求加速我国芦笋自行育种和繁殖制种的进程。

芦笋是雌雄异株的植物，雌株的性染色体为XX，雄株的性染色体为XY，雄株质量好、产量高，在自然条件下，雌雄株的比例为1∶1，如果用花药培养的方法培育雄株花药，单倍体植株加倍后即可获得自然界不存在的超雄株(YY)，超雄株和正常植株交配，得到的后代全为雄株，在生产上有很高的经济价值。全雄杂交种的产量可比原来雌/雄混合品种增产30％以上。全雄杂交种生长一致且很少有不必要的果实。在生产田中不会产生大量的自生苗，免除了人工清除自生苗的麻烦。全雄杂交种外观均一，风味佳，抗病性提高，减少杂草，而且可以提前投产。全雄品种由于不产生F₂代种子，因而没有假冒种子。

全雄株品种选育过程中，超雄株的培养和筛选十分重要。而目前超雄株的培育主要通过两种途径获得，二是通过花药培养或花粉培养的方法，二是通过两性花的自交。尽管花药培养的方法已经成功地应用于许多品种的选育，但还存在着技术困难，例如花药培养再生频率很低(平均只有6.8)，并且不同基因型间差异很大(Falarigna et al 1985)。通过第二种方法即两性花杂交方法也很困难，虽然一旦获得两性花植株，1/4的后代为超雄株。因为芦笋为雌雄异株植株，1∶1的性别比例(male∶Mm；female∶mm)。但是一般超雄株与雄性株很难从形态上加以区分，一个超雄株需要从后代的性别分离比例来区分。由于证实雄性株和雌性株开花各自分别需要温室中播后210-235天及269-295天。所以目前利用该系统从两性花中鉴定超雄株需要24个月，这严重阻碍了芦笋全雄系的培育工作。并且由于其为雌雄异株作物，自交不大可能，所以通过杂交育种的方式形成同质的纯合品种非常困难，由于产量稳定评价需要几年的时间，所以利用传统方法培育一个芦笋新品种往往需要十多年甚至几十年的时间。

Abe and kameya(1986)率先发现了利用Atrazine及diuron处理芦笋种子可以诱导幼苗在定植后一个月可以开花。亦有报道表明Triazines，Ureas，anilides，benzamides与carbarnates有类似的效应(Abe et al.，1987；Hara et al.，1992；Ozaki etal.，1999)。美国专利(Patent 6174712)也提供了一种促进芦笋开花的脂肪酸。利用化学试剂处理诱导1-2个月苗龄的幼苗开花可以快速形成各个世代，在短时间内可以形成纯系，从而缩短育种进程，在芦笋遗传研究和新品种选育中大有用处。

芦笋常规育种与现代生物技术有机结合仍将是今后培育新品种的主要手段。芦笋常规育种技术简单，可操作性强，但周期很长.利用组织培养技术，可以大大加快芦笋育种的选育进度，简化育种程序，缩短育种年限。

参考文献：

Abe T.&T.Kameya.1986.Promotion of flower formation by atrazine anddiuron in seedlings of Asparagus.Planta 169：289-291.

Abe T.，R.Shimizu，H.Iwamura&T.Kameya.1 987.Flower induction byatrazine analogs in seedlings of Asparagus officinalis.Physiol Plant 70：228-230.

Hara T.，N.Wada&H.Iwamura，1992.Flower induction in asparagus seedlingsby anilide and benzamide derivatives.J Agric Food Chem 40：1692-1694.

Ozaki Y.，T.Kurahashi，T.Tashiro&H.Okubo.1999.Carbamate inducedflowering in asparagus(Asparagus officinalis L.)seedlings：optimization of treatmentand cultivar variation in flowering response and pollen germination.Euphytica 110：77-83.

Peng MS，Ziauddin A，Wolyn D.Development of asparagus microspores in vivoand in vitro is influenced by gametogenic stage and cold treatment In Vitro Cellularand Development Biology-Plant.1997，33：263-268

发明内容

本发明的目的是针对目前芦笋杂交种选育周期过长、超雄株不易鉴定、杂交种子主要依赖进口、价格昂贵且纯度难以保证这一现状，提出一种利用除草剂巴尔板快速培育芦笋全雄株品系的方法。巴尔板，又称燕麦灵及氯炔草灵，化学名为4-氯-2-丁炔基-N-(3氯苯基)氨基甲酸酯，属于一种氨基甲酸酯类除草剂。

利用除草剂巴尔板快速培育芦笋全雄株品系的方法包括如下步骤：

1)从生产用的芦笋品种中选择两性株，两性株同株自交获得芦笋种子；

2)利用巴尔板浸泡并催芽处理芦笋种子；

3)经处理的芦笋种子在营养钵中育苗，生长30～35天后开花，各单株分别同雌性株杂交，按单株留种；

4)单株留种的种子再利用巴尔板处理，开花后统计雌雄花的比例，鉴定超雄株；

5)利用离体培养法保存与繁殖超雄株无性系；

6)利用上述超雄株作为父本同优良雌性系杂交即可获得芦笋全雄品系。

所述步骤2)利用除草剂巴尔板浸泡并催芽处理种子的方法包括如下步骤：

a)将巴尔板溶于二甲基亚砜中，然后缓慢地溶于去离子水中，得到浓度为50mgl^-1巴尔板溶液；

b)培养皿中放三层滤纸，加20ml巴尔板溶液，用两层纱布包裹芦笋种子，在25℃下照光培养12天，光照强度为54.2μmol^-1m^-2s^-1，光周期为12小时，发芽后种子在清水中清洗10～15分钟，播种。

所述步骤4)鉴定超雄株的方法包括如下步骤：

c)利用巴尔板浸泡并催芽处理芦笋种子；

d)发芽后的芦笋种子播于营养钵中，30～35天后开花，统计雌雄花的比例；

e)根据开花后的子代性型从父本中鉴定超雄株。

4、根据权利要求1所述的一种利用除草剂快速培育芦笋全雄株品系的方法，其特征在于所述步骤5)离体培养超雄株的方法包括如下步骤：

f)超雄株嫩茎用自来水冲洗30～45分钟，用洗涤剂清洗10～20分钟，用70％酒精浸泡5分钟，再用含1-2滴吐温的0.1％升汞处理25分钟，最后用无菌水漂洗3～4次，用无菌滤纸吸干材料表面水分后，切取0.5～0.6厘米的带芽茎段，剥去腋芽表面的鳞片后接种；

g)带芽茎段接种到添加有0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1mg/L萘乙酸，25g/L蔗糖和6g/L琼脂的MS培养基上诱导不定芽；

h)不定芽培养1个月后，转接到含1.0mg/L多效唑PP₃₃₃+0.5mg/L吲哚-3-丁酸+蔗糖25g/L+琼脂6g/L的1/2MS培养基上诱导生根；

i)生根试管苗在移栽前一周置于自然光照下进行炼苗，逐日松开培养瓶封口膜直至最后撤去，将泥炭土、蛭石和珍珠岩以3∶1∶1比例混合，高温高压下灭菌后用作移栽基质，试管苗移栽后保持通风及80～90％的环境湿度。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：

1)利用氨基甲酸酯类化合物快速培育芦笋全雄株品系的方法极大地缩短了芦笋从幼苗到开花时间(从播后200多天减少到35天左右)，加快了超雄株的鉴定过程，使得超雄株的鉴定从24个月减少到6个月以下；

2)利用氨基甲酸酯类化合物处理芦笋种子可提高雄花的比例，在芦笋超雄株筛选中有重要作用；

3)离体培养超雄株发展超雄株系一方面可以保持超雄株系的优良种性，另一方面可以大大减少超雄品种稳定时间，加快全雄株品种的育种进程；

4)本发明在芦笋全雄株品系选育方面取得了重大突破，具有良好的经济和社会效益，应用前景广阔。

附图说明

附图芦笋超雄株快速鉴定过程。

具体实施方式

利用除草剂快速培育芦笋全雄株品系的方法包括如下步骤：

1)从生产用的芦笋品种中选择两性株，两性株同株自交获得芦笋种子；

芦笋通常是雌雄异株，但有些品种中常会出现1-5％的两性株，有些品种中也发现结籽率酷似雄株的两性株，极少数的雄性两性株。一般雄株雌蕊花柱和柱头完全退化，子房退化仅留退迹。而雄性两性株雌蕊花柱和柱头发育良好，子房不完全退化或发育正常。这些两性花可以结籽，结籽率约为2-10％。

两性株单株自交留种。在大田中发现的两性株，取雄花花粉进行人工授粉，将其授粉于相应单株两性花的柱头上，约50天后种子成熟收获。统计结实率以及种子数。

2)利用除草剂巴尔板浸泡并催芽处理芦笋种子；

将巴尔板溶于二甲基亚砜中，然后缓慢地溶于去离子水中，得到浓度为50mgl^-1巴尔板溶液；

芦笋种子先用50mgl^-1巴尔板溶液浸泡8-10个小时；在培养皿中放三层滤纸，加20ml巴尔板溶液，用两层纱布包裹芦笋种子，在25℃下照光培养12天，光照强度为54.2μmol^-1m^-2s^-1，光周期为12小时，发芽后种子在清水中清洗10～15分钟，播种。

3)经处理的芦笋种子在营养钵中育苗，生长30～35天后开花，各单株分别同雌性株杂交，按单株留种；

选择雄株和雌株  由于两性株同株自交产生3/4的雄株(Mm)，其中1/3为同质型雄株(MM)，2/3为异质型雄株(Mm)，1/4的同质型雌株(mm)。采用测交法就可以将同质型雄株(MM)筛选出来。经巴尔板处理的种子播种后30～35天右开花，根据花型区分雄株和雌株。

测交留种  将上述雄株按单株编号，将雄花跟同质性雌株(mm)上的雌花进行人工杂交。

4)单株留种的种子再利用巴尔板处理，开花后统计雌雄花的比例，鉴定超雄株；

利用巴尔板浸泡并催芽处理芦笋种子；发芽后的芦笋种子播于营养钵中，

按雄株单株分小区播种。播种后30～35天时鉴定雄花和雌花，统计数目，计算比例。若在后代中均为雄花的，其父本单株为超雄株；若在后代中雌花和雄花比例接近1∶1，则父本为异质性雄株。

5)利用离体培养法保存与繁殖超雄株无性系；

超雄株嫩茎用自来水冲洗30～45分钟，用洗涤剂清洗10～20分钟，用70％酒精浸泡5分钟，再用含1-2滴吐温的0.1％升汞处理25分钟，最后用无菌水漂洗3～4次，用无菌滤纸吸干材料表面水分后，切取0.5～0.6厘米的带芽茎段，剥去腋芽表面的鳞片后接种；

带芽茎段接种到添加有0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1mg/L萘乙酸，25g/L蔗糖和6g/L琼脂的MS培养基上诱导不定芽；

不定芽培养1个月后，转接到含1.0mg/L多效唑PP₃₃₃+0.5mg/L吲哚-3-丁酸+蔗糖25g/L+琼脂6g/L的1/2MS培养基上诱导生根；

生根试管苗在移栽前一周置于自然光照下进行炼苗，逐日松开培养瓶封口膜直至最后撤去。将泥炭土、蛭石和珍珠岩以3∶1∶1比例混合，高温高压下灭菌后用作移栽基质。试管苗移栽后保持通风及80～90％的环境湿度。成活后浇水，施复合肥1次，苗床保持湿润，温度保持25-30℃.育苗1个月左右即可定植到大田。

6)、配制组合，选择优良全雄株品系

同质型雌性系的选择  引入UC157，UC800，Atlas，Apollo(美国)，Lucullus(德国)，Franklim(法国)等对本省适应性较强的品种中选择雌性系单株，经过多年筛选，形成了较稳定的雌性系。选择其中4个优良雌性系作为母本，包括：991407，990712，002204，010207。

配制杂交组合  鲜花以及干冷贮藏的花被用作杂交花粉来源。鲜花在开花前立刻采收花药，干花粉贮于3℃，可保持12天。干冷贮藏可用于调整花期。

各组合田间比较试验  结合配合力测定以及抗病性鉴定筛选获得的各组合，进行3年期产量以及品质特性的连续观察。田间试验统计产量以及嫩茎的商品性，包括抽生嫩茎的平均数量、重量、横径、色泽、紧实度等，从而确定优良的杂交组合。

实施例1

1.在西德全雄的生产田中发现了9株两性株，同株自交人工授粉后其中的6株获得了58粒成熟种子。

2.芦笋种子先在烧瓶中用30ml 50mgl^-1的巴尔板溶液浸泡8-10个小时；在培养皿中放三层滤纸，加20ml巴尔板溶液，用两层纱布包裹芦笋种子，在25℃下照光培养12天，光照强度为54.2μmol^-1m^-2s^-1，光周期为12小时，发芽后种子在清水中清洗10～15分钟，播种。

3.播种后育苗，约35天后多数开花，开花率为58.7％，根据花型区分雄株和雌株。结果雄株与雌株比例为21∶6，高于预期的3∶1的比例。说明在氨基甲酸脂化合物巴尔板处理下，雄株比例显著提高。

4.将上述雄株按单株编号，将雄花跟两年生的品种‘UC157’同质型雌株(mm)上的雌花进行人工杂交，选择另一品种雌株有利于提高其结实率。每个雄株同12个雌株测交。

5.分单株收获的种子按前述方法利用巴尔板处理。芦笋种子先在烧瓶中用30ml 50mgl^-1的巴尔板溶液浸泡8-10个小时；在培养皿中放三层滤纸，加20ml巴尔板溶液，用两层纱布包裹芦笋种子，在25℃下照光培养12天，光照强度为54.2μmol^-1m^-2s^-1，光周期为12小时，发芽后种子在清水中清洗10～15分钟，分区播种。播种后35天时鉴定雄花和雌化，统计数目，计算比例。结果发现有5个株系测交后代均为雄株或绝大多数为雄花，由此推断该5株亲本为超雄株。

6.超雄株无性繁殖体系的建立

(1)田间取回超雄株嫩茎用自来水冲洗30～45分钟，用洗涤剂清洗10～20分钟，70％酒精浸泡5分钟，再用含1-2滴吐温的0.1％升汞处理25分钟，最后无菌水漂洗3～4次，无菌滤纸吸干材料表面水分后，切取0.5～0.6厘米的带芽茎段，剥去腋芽表面的鳞片后接种；

(2)接种到添加有0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.1mg/L萘乙酸，25g/L蔗糖和6g/L琼脂的MS培养基上培养14天后不定芽出现。

(3)待不定芽长至4～5cm高时接种到含1.0mg/L多效唑PP₃₃₃+0.5mg/L吲哚-3-丁酸IBA+蔗糖25g/L+琼脂6g/L的1/2MS培养基上诱导生根。

(4)40天后生根试管苗在移栽前一周置于自然光照下进行炼苗，逐日松开培养瓶封口膜直至最后撤去。将泥炭土、蛭石和珍珠岩以3∶1∶1比例混合，高温高压下灭菌后用作移栽基质。移栽后保温保湿，促进缓苗。

(5)苗期管理。缓苗后，可追施10-15kg/667m²的复合肥，施肥后立即浇水，如发现蚜虫等虫害，可用乐果等杀虫剂等防治。在育苗过程，需喷施百菌清、代森锰锌等杀菌剂保护。在基质中培养30-35天后即可定植。

(6)最后形成了2个不同来源的超雄株系，分别为ME14，MF12-3。

7.超雄株系的利用

(1)从德国引入的芦笋品种Lucullus(德国)经过多年自交筛选，形成了一个生长一致，稳定的雌性系，即012204。

(2)配制杂交组合  取ME14或MF12-3的雄花花粉授于012204的雌花花柱上，待种子成熟后分别采收，统计结实率。

(3)各组合田间比较试验  将以上组合种植于大棚中，进行小区比较试验，第二年开始统计产量，连续3年对其产量和品质进行评价，选择优良组合。