一种天然高纯科罗索酸和山楂酸及其制备方法

摘要

一种天然高纯科罗索酸和山楂酸是自枇杷叶中提取、分离得到的纯度为80.0～99.2％科罗索酸和山楂酸。其制备方法为：将干燥的枇杷叶粉碎后，以乙醇或甲醇回流提取，将提取浓缩后，将浓缩液中沉淀用水洗涤，以乙醇溶解，加活性炭脱色，脱色后溶液常压浓缩至有固体物质析出，将浓缩液低温冷却一段时间，过滤后，将滤渣溶解后进行柱色谱分离，洗脱获得科罗索酸和山楂酸馏分，减压回收馏分中溶剂，干燥后即可获得高纯的科罗索酸和山楂酸产品。产品中的科罗索酸具有降血糖、减肥、抗肿瘤和抗炎作用，山楂酸具有抗肿瘤、抗病毒和抗心血管疾病作用。

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种植物中草药的活性成分及其制备方法，具体地说是一种天然高纯科罗索酸和山楂酸及其制备方法。

二、背景技术

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷(Eribotrya japonica(Thunb)Lindl)干燥叶，是常用中药材之一，具有化痰止咳、降气和胃之效，常用于支气管炎、肺热咳嗽。在我国的华东、中南、西南等地区广泛种植。

随着枇杷叶药用成分研究的深入，发现枇杷叶中三萜酸成分丰富，其中含有的科罗索酸具有降血糖、减肥、抗肿瘤和抗炎作用，山楂酸具有抗肿瘤、抗病毒和抗心血管疾病作用。国内已有文献报道枇杷叶总三萜酸成分的制备及其在降血糖、抗炎、止咳药物中的应用的专利。

CN1439648A公开了一种枇杷叶总三萜酸组分为乌苏酸、2α-羟基乌苏酸、2α-羟基齐墩果酸、齐墩果酸、坡模酸和蔷薇酸。其制备首先用95％乙醇回流提取、脱溶得到浸膏，然后依次用D101大孔吸附树脂处理和中性A203柱层析。该总三萜酸具有抗炎、止咳等药理作用。

CN1640885A公开了一种枇杷叶总三萜酸主要含熊果酸、齐墩果酸、可乐酸和2α-羟基齐墩果酸。其制备首先用乙醇或甲醇回流提取、脱溶后得到浸膏，用沸水洗涤除去水溶性成分，滤渣经洗涤、乙醇复溶、活性炭脱色最后脱去乙醇。该总三萜酸可用于防治糖尿病。

CN1634971A公开了以3-羰基熊果酸酯和3-羰基齐墩果酸酯为原料合成科罗索酸和山楂酸的方法，科罗索酸有降血糖、减肥、抗肿瘤和抗炎作用，山楂酸有抗肿瘤、抗病毒和抗心血管疾病作用。

US6485760、US6716459和US20040072906公开了大花紫薇(Largetroernia Speciosa L.)为原料制备含有科罗索酸医药原料的工艺及其在治疗II型糖尿病和肥胖症中的应用。

三、发明内容

本发明旨在提供一种可供药用的天然高纯的科罗索酸和山楂酸，所要解决的技术问题是自枇杷叶中直接制备高纯的科罗索酸和山楂酸。

本发明所称的天然高纯科罗索酸和山楂酸是自枇杷叶中提取、然后分离得到的两种五环三萜酸，与现有技术的区别是科罗索酸的含量80.0～99.2％(w/w)，山楂酸的含量80.0～99.2％(w/w)。

科罗索酸和山楂酸有以下化学通式：

当R1＝CH₃，R2＝H为山楂酸，

当R1＝H，R2＝CH₃为科罗索酸。

科罗索酸和山楂酸的制备方法，以枇杷叶为原料，包括乙醇或甲醇水溶液的回流提取、分离、浓缩、脱色、干燥和后处理，所述的回流提取是使用浓度为45～80％(w/w)的乙醇或甲醇水溶液回流提取，分离得到提取液，与现有技术的区别是提取液浓缩时控制浓缩比，即浓缩至原提取液体积的5～50％，优选10～30％，然后冷却静置、分离、洗涤，将滤渣溶于乙醇或甲醇后活性炭脱色，过滤分离，滤液脱溶后得到中间产物，呈淡黄色粉末状，中间产物是主要含科罗索酸和山楂酸的三萜酸。所述的后处理就是对中间产物用柱色谱分离、洗脱液洗脱，分别收集含科罗索酸和山楂酸的洗脱液，脱溶后分别得到白色粉末状的科罗索酸，纯度80.0～99.2％，以及山楂酸，纯度80.0～99.2％。色谱柱填料(固定相)选自正相硅胶或氧化铝，或者反相硅胶C₈或C₁₈，当选择正相硅胶色谱柱时，洗脱液为石油醚和乙酸乙酯，混合比1∶0～0∶1(v/v)；当选择反相硅胶色谱柱时，洗脱液是pH值为2～7的75～95％(w/w)的乙醇水溶液或甲醇水溶液。优选pH值为3～6的75～95％(w/w)的乙醇水溶液或甲醇水溶液。

具体操作过程如下：

(1)用乙醇或甲醇含量大于45％(w/w)乙醇或甲醇水溶液回流提取，粉碎后枇杷叶与溶剂质量比为1∶6至1∶12，提取次数1至3次，每次1至5个小时；

(2)滤出提取液，减压浓缩，控制浓缩液为原提取液体积的0.05～0.5倍，冷却12h过滤，用10～15倍重蒸馏水洗涤滤渣；

(3)将洗涤后的滤渣用乙醇或甲醇溶解，加0.05至0.20倍重活性碳，于85℃下回流脱色20分钟，乘热过滤，将滤液蒸干，得到淡黄色粉末的中间产物；

(4)将淡黄色粉末进行固定相为正相硅胶、氧化铝或反相C8、C18硅胶柱色谱分离，正相色谱洗脱方式为石油醚与乙酸乙酯混合体系梯度洗脱(1∶0～0∶1)，反相色谱洗脱方式为加酸调整pH值为2～7的乙醇-水或甲醇-水等度洗脱，洗脱剂中水含量小于30.0％。

(5)柱色谱分离后的科罗索酸洗脱液和山楂酸洗脱液蒸干后得到白色粉末，即为高纯度科罗索酸和山楂酸。

测定方法为高效液相色谱法(HPLC-UV)，色谱固定相为碳十八烷基硅胶，流动相为甲醇-1.0％醋酸溶液(体积比为88∶12)，流速为0.8mL/min，柱温27℃，检测波长为215nm。

四、附图说明

图1是山楂酸的液相色谱图。

图2是科罗索酸的液相色谱图。

五、具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1

干燥枇杷叶2.0Kg粉碎后，加80％乙醇(w/w)20L回流提取3h，提取2次后合并滤液，浓缩至2L过滤，得滤渣124.2g，将滤渣溶解于500mL乙醇中，加入25.0g活性炭下回流脱色20分钟，乘热过滤，将滤液蒸干，得到淡黄色粉末54.2g，将淡黄色粉末，以甲醇溶解硅胶拌样，挥去溶剂后干法上硅胶柱分离，以石油醚与乙酸乙酯混合体系梯度洗脱(10∶0(v/v)至0∶10(v/v))按11个梯度洗脱，每个梯度10L，以500mL为单位分段收集，以TLC检测，按单一斑点合并得到科罗索酸和山楂酸馏分，蒸干后得科罗索酸粉末4.12g，山楂酸粉末3.24g，科罗索酸含量为96.2％，山楂酸含量为96.1％(以重量计)。

实施例2

干燥枇杷叶2.0Kg粉碎后，加80％乙醇(w/w)20L回流提取3h，提取2次后合并滤液，浓缩至4L过滤，得滤渣132.1g，将滤渣溶解于500mL乙醇中，加入25.0g活性炭回流脱色20分钟，乘热过滤，将滤液蒸干，得到淡黄色粉末56.2g，将淡黄色粉末，以乙酸乙酯溶解样品，在固定相填料为碳十八烷基硅胶制备色谱上进行分离，洗脱剂为83％甲醇水溶液，醋酸调pH值至3~6，根据制备色谱图收集科罗索酸和山楂酸馏分，蒸干后得科罗索酸粉末4.42g，山楂酸粉末3.26g，科罗索酸含量为99.2％，山楂酸含量为99.1％(以重量计)。

山楂酸结构测定

IR(KBr)3415cm-1为-OH伸缩振动锋；2973，2927，2872cm-1为-CO-强伸缩振动锋，为缔合羟基的羰基峰；1691cm-1为双键伸缩振动区，包括羰基(C＝O)吸收、碳-碳(C＝C)双键吸收；1458cm-1(C-H)弯曲振动锋。1300~400cm-1，为指纹区。

1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：0.71(3H，s，H29)，0.71(3H，s，H30)，0.88(3H，s，H25)，0.88(3H，s，H24)，0.91(3H，s，H26)，0.93(3H，s，H27)，1.1(3H，s，H23)，4.33(1H，d，J＝9.0Hz，H-2β)，4.24(1H，dd，J＝8.9，11.5，H-3α)，5.17(1H，t，J＝3.4Hz，H12)，3.42(1H，t，J＝H18)，2.74(2H，d，J＝H19)

13C-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：45.6(C-1)，67.1(C-2)，82.2(C-3)，38.9(C-4)，54.7(C-5)，18(C-6)，33.2(C-7)，46.8(C-8)，47(C-9)，37.6(C-10)，23.3(C-11)，121.4(C-12)，143.8(C-13)，41.3(C-14)，27.1(C-15)，22.5(C-16)，45.4(C-17)，23.3(C-18)，40.7(C-19)，30.3(C-20)，33.3(C-21)，32(C-22)，28.7(C-23)，16.2(C-24)，16.8(C-25)，17(C-26)，25.6(C-27)，178.5(C-28)，32.8(C-29)，22.9(C-30)。

科罗索酸结构测定

IR(KBr)与山楂酸基本相同。

1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：0.71(3H，s，H29)，0.75(3H，s，H30)，0.82(3H，s，H29)，0.92(3H，s，H24)，0.92(3H，s，H26)，0.92(3H，s，H27)，1.0(3H，s，H23)，4.22(1H，d，J＝8.7Hz，H-2β)，4.33(1H，dd，J＝9.0，11.5，H-3α)，5.17(1H，t，J＝3.4Hz，H12)3.42(1H，t，J＝H18)，2.74(1H，t，J＝H19)。

13C-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：46.8(C-1)，67.1(C-2)，82.2(C-3)，38.8(C-4)，54.7(C-5)，18.0(C-6)，32.6(C-7)，39.0(C-8)，47.0(C-9)，37.5(C-10)，22.9(C-11)，124.4(C-12)，138.2(C-13)，41.6(C-14)，27.4(C-15)，23.7(C-16)，46.9(C-17)，52.3(C-18)，38.4(C-19)，38.4(C-20)，30.1(C-21)，36.2(C-22)，28.8(C-23)，17.1(C-24)，16.4(C-25)16.9(C-26)，23.2(C-27)，178.2(C-28)，21.0(C-29)，16.9(C-30)。