酶法制备黑刺菝葜总皂苷提取物的方法

摘要

本发明公开了一种酶法制备黑刺菝葜总皂苷提取物的方法。将黑刺菝葜干燥粉碎成30～120目的粉末，按照一定的固液比，将其和水置于生物反应器，控制pH值和温度，分别或依次加入纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶、复合酶等其中一种或任意几种酶进行酶反应，酶解后，40℃～100℃保温0.5h～5h；过滤，滤渣中加入去离子水再提取两次，合并滤液得粗总皂苷提取液；然后将其利用澄清处理法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流体萃取法、色谱法、液－液逆流分配色谱法等其中任意一种或这些方法的任意组合纯化得总皂苷提取物。该提取物可作制备拉肖皂苷元及其类似物的原料，也可制备药物或功能性食品。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶法制备黑刺菝葜总皂苷提取物的方法及其在医药和保健食品领域的应用，属于医药技术领域。

背景技术

黑刺菝葜(Smilax scobinicaulis C.H.Wright)又名短梗菝葜，是菝葜科菝葜属植物，生于低山灌丛或山谷河岸，主产于陕西、甘肃等省，广泛分布于北方地区，资源十分丰富。其根茎在我国北方代替威灵仙入药，商品上称为“铁丝威灵仙”、“金刚刺”、“金刚藤”等。煎汤或浸酒内服；研粉、磨汁调敷或煎水洗外用；具除风湿、活血解毒、镇惊息风和抗癌等功效，临床上用于治疗风湿性腰腿病、小儿惊风肠炎、瘰疬，疮疖、癌肿等病症。

中药黑刺菝葜中主要含有甾体皂苷类化学成分，其中主要皂苷类为含有拉肖皂苷元的甾体皂苷及其类似物，是制备拉肖皂苷元(Laxogenin)极好的原料(专利“一种从黑刺菝葜植物中制备拉肖皂苷元的方法”，申请号为200710199224.X)，而且具有抗肿瘤、抗菌等活性(张存莉等，林业科学，2006，42(9)：69-73；张存莉等，西北农林科技大学学报，2003，31(4)：163-166.)，因此研究黑刺菝葜总皂苷的制备方法具有重要的意义。

中草药成分复杂，有活性成分，也有如蛋白质、果胶、淀粉、植物纤维等非活性成分，这些成分既影响植物细胞中活性成分的浸出，又影响中药液体制剂的澄清度。选用相应的酶可将纤维素、淀粉、蛋白质、果胶等杂质分解去除，不仅有利于活性成分的提取，极大提高有效成分的得率，而且还可以回收利用酶解副产物，实现一物多用，清洁生产，保护环境。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶法提取黑刺菝葜总皂苷的方法。

本发明制备的黑刺菝葜总皂苷提取物所涵盖的各种皂苷类活性成分之中，最主要的是黑刺菝葜皂苷a、黑刺菝葜皂苷b、黑刺菝葜皂苷c及其类似物等成分。其中主要化合物结构如下：

 化合物  R  英文名称 黑刺菝葜皂苷a  α-L-Ara-(1→6)-β-D-glu-  smilaxin A 黑刺菝葜皂苷b  β-D-Glu-(1→4)-[α-L-ara-(1→6)]-β-D-glu-  smilaxin B 黑刺菝葜皂苷c  β-D-Glu-

作为黑刺菝葜总皂苷提取物，其中各皂苷类成分百分含量的总和为70～100％(W/W)。

为了实现上述目的，本发明的技术解决方案是；首先将中药黑刺菝葜材料，干燥，粉碎成30～120目的粉末；按照一定的固液比，将粉末和水置于生物反应器中，搅拌成匀浆，调节pH值和温度，分别或依次加入纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶、复合酶制剂等其中的一种或任意几种酶进行酶催化反应；酶解结束后，继续在40℃～100℃条件下保温0.5h～5h，促进甾体皂苷的浸出；然后过滤，滤渣中加入2～10倍量去离子水继续提取两次，每次1～3h，过滤，合并滤液，得粗总皂苷提取液；然后将粗总皂苷提取液进一步利用澄清处理法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流体萃取法、色谱法、液-液逆流分配色谱法等其中的任意一种方法，或这些方法的任意组合纯化得总皂苷提取物。

在使用这些方法进行制备时，一般包括以下几个步骤：

(1)原料处理

本发明所述材料，来源于百合科菝葜属植物黑刺菝葜(Smilaxscobinicaulis C.H.Wright)。作为提取黑刺菝葜总皂苷的原材料，可以是市售黑刺菝葜饮片，也可以是黑刺菝葜块根、须根、根茎、茎、卷须和叶子等任一部位或全部植株，其中优选的药材部位为黑刺菝葜干燥根及根茎。上述所述的黑刺菝葜包括未经任何炮制处理的原药材及饮片，还包括各种炮制品。

综合产品的收率和纯度两个因素，黑刺菝葜原材料的粉碎粒度以30～120目的粉碎粒径提取效果最佳。

(2)酶催化反应制备粗皂苷提取液

按照固液比1∶1～1∶20(原料的质量克数和水的体积毫升比)将原料粉末和水置于生物反应器中，调节pH值，按照原料的质量克数与酶液的毫升体积比10000∶1～1000∶5，分别加入纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶等其中一种酶或其中两种或三种酶组成的复合酶，或阶梯法加入各种酶，即依次加入其中的两种或三种、四种酶，按照下表所示控制最适酶解温度和pH值，酶解1～5h。

酶催化反应的pH值和温度

  酶种类  酶活力(U/g)  最适pH值  最适酶解温度(℃)  纤维素酶  ≥1000  4.5～6.5  30～55  果胶酶  ≥1000  3.0～10  25～60  淀粉酶法  ≥1500  4.0～7.5  50～90  糖化酶  ≥50000  3.5～6.5  55～70  复合酶  ≥1500  3.0～7.0  40～65

酶解过程中时时有氧搅拌；酶解结束后，在40℃～100℃继续保温0.5h～5h，促进甾体皂苷的浸出；然后过滤，滤渣中加入2～10倍量去离子水继续提取两次，每次1～3h，过滤，合并滤液，得粗总皂苷提取液。

(3)粗总皂苷提取液的纯化：

虽然运用酶技术对黑刺菝葜中的淀粉、胶体、蛋白进行了处理，但粗皂苷提取液中仍含有大量淀粉、胶体及蛋白等物质，需要进一步纯化处理。

可以使用澄清处理法，或溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流体萃取法、色谱法、液-液逆流分配色谱法等其中的任意一种方法，或这些方法的任意组合纯化粗总皂苷提取液，得总皂苷提取物。

当采用澄清处理法纯化粗总皂苷提取液时，处理法包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任意一种澄清剂或其组合：醇沉剂、明胶、高岭土、各种树脂、聚乙二醇、聚乙三醇、壳聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等。

当采用萃取法进行制备进行时，先用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性杂质，然后用合适的极性溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的总皂苷成分，得到总皂苷提取物。

当采用大孔吸附树脂法纯化粗总皂苷提取液时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任意一种类型，如D101、D4020、D3500、D941、D21、HP-20、HP-20、XDA-1、AB-8、HPD400、S-8、HZ-806等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、HPD400、D101等。所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中优选的为70～95％的乙醇。

当采用超临界流体萃取法纯化粗总皂苷提取液时，可以对黑刺菝葜粗皂苷提取液的直接进行萃取，也可以对上述任一方法和步骤所获得的产物进行萃取。萃取时可以使用或不使用以下任一种类溶剂及溶剂混合物：水、醇类、酮类及酯类溶剂。

当采用柱色谱法纯化粗总皂苷提取液时，其处理的对象可以是上述提取步骤所获得的粗皂苷提取液，也可以是经上述澄清处理法、溶剂提取法、大孔吸附树脂法或超临界流体萃取法初步纯化后的产物。所用的固定相可以是硅胶、聚酰胺、氧化铝、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex-20系列)、C-8、C-18、活性碳、纤维素等，所用的洗脱液因固定相的不同而不同，一般是水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚等组成的混合溶剂。

当采用液-液逆流萃取法纯化粗总皂苷提取液时，其处理的对象可以是上述提取步骤获得的粗皂苷提取液，也可以是经上述澄清处理法、溶剂提取法、大孔吸附树脂法或超临界流体萃取法初步纯化后的产物。一般是将粗总皂苷提取液混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的总皂苷成分，得总皂苷提取物。

(4)浓缩：常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮等浓缩除去皂苷提取物中的溶剂。

(5)干燥：真空干燥或喷雾干燥、冷冻干燥等方法，除去皂苷中残留溶剂，制备得黑刺菝葜总皂苷提取物。

该提取物可以单独或与其它任何中西药或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等，也可以作为制备拉肖皂苷元(Laxogenin)及其类似物的原料。

本发明质量控制方法可包括以下含量测定方法中的一种或两种：

1.溶血指数法测定皂苷含量

0.5％药材浸出液的配制：黑刺菝葜药材粉末以等渗磷酸盐缓冲液(或生理食盐水)精确配制成0.5％浓度。

溶血指数的测定：取直径、长短一致的9支小试管，分别精确吸入0.1、0.2、0.3、……0.9mL黑刺菝葜提取物，精密加缓冲液补足体积为1mL，各试管中再各精密加1mL 2％血球悬浮液，各管摇匀后由可以产生完全溶血的黑刺菝葜提取物最低浓度来计算溶血指数。

皂苷含量的测定：用标准皂苷黑刺菝葜皂苷a或黑刺菝葜皂苷b配成适当浓度的溶液，同上法测定溶血指数，从标准皂苷与黑刺菝葜提取物的溶血指数计算黑刺菝葜皂苷的百分含量。

2.HPLC-ELSD法分析黑刺菝葜皂苷的含量

色谱条件：蒸发光散射检测器，色谱柱：反相C18(4.6×150mm，5μm)；流动相：乙腈-水梯度洗脱，40～80％(0～70min)；流速：1.0mL/Min；柱温：25℃。

标准曲线绘制：分别精密吸取黑刺菝葜标准皂苷黑刺菝葜皂苷a、黑刺菝葜皂苷b或黑刺菝葜皂苷c对照品溶液(1.0μg/μL)0、2、5、10、15、20μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照进样量(μg)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取3批黑刺菝葜提取物样品各3份，每份约20mg，置于10mL量瓶中，加70％乙醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为黑刺菝葜皂苷含量测定的供试样品溶液，精密吸取上述供试样品溶液20μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。

具体实施方式：

实施例1：酶法提取黑刺菝葜总皂苷提取物的方法

黑刺菝葜干燥根，粉碎，过80目筛，取粉末25g，按照固液比1∶14(每g原料粉末加入pH值为4.5的NaAc-HAc缓冲液14mL)加入原料粉末和缓冲液于生物反应器中，调节温度为45℃，再加入活力为40000U/g的纤维素酶0.025mL，酶解120min，酶解期间时时搅拌；然后升温至60℃，在此条件下保温120min促进甾体皂苷的浸出，离心分离固体残渣和滤液，用100mL去离子热水洗涤滤渣，合并滤液，真空浓缩至100mL，冷冻干燥，得黑刺菝葜总皂苷，测定黑刺菝葜总皂苷提取物中总皂苷含量为85％，测定黑刺菝葜皂苷a、黑刺菝葜皂苷b和黑刺菝葜皂苷c三种成分的含量之和为76％。

实施例2：酶法制备黑刺菝葜总皂苷提取物的方法

黑刺菝葜干燥块根，粉碎，过30目筛，取粉末25g，按照固液比1∶7加入原料粉末和缓冲液置于生物反应器中，调节温度为80℃，再加入活力为20000U/g的淀粉酶0.01mL，酶解100min；然后降温至50℃，加入活力为10000U/g的糖化酶0.02mL，酶解30min，离心分离固体残渣和滤液，残渣中加入用5倍量去离子浸提2次，合并滤液，真空浓缩至生药浓度为5∶1(W/W)，调节温度为80℃，加入15％壳聚糖溶液，静置8h，过滤，滤液上已处理好的大孔型弱碱性阴离子D392交换柱，用2倍树脂床体积的2％NaOH溶液冲洗，冲洗液弃去，再用3倍纯水冲洗，水冲洗液弃去；用5倍树脂床体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至稠膏(50℃下相对密度为1.28～1.33)干燥，得黑刺菝葜总皂苷提取物。测定黑刺菝葜总皂苷提取物中总皂苷含量为96％，测定黑刺菝葜皂苷a和黑刺菝葜皂苷b两种成分的含量之和为91％。

实施例3：酶法制备黑刺菝葜总皂苷提取物的方法

黑刺菝葜干燥根茎，粉碎，过50目筛，取粉末25g，加入蒸馏水120mL，调节pH值为4.5，再加入纤维素果胶复合酶，其中活力为15000U/g的纤维素酶用量为0.04mL、活力为1000U/g的果胶酶酶用量0.05mL，升温至50℃，酶解100min酶解期间时时搅拌，然后升温至80℃保温180min促进甾体皂苷的浸出。离心分离固体残渣和滤液，同法再用去离子水浸提滤渣2次，，合并滤液，将滤液通过AB-8型大孔吸附树脂层析柱，吸附流速4BV/h，数值柱径高比为1∶7，上样量为0.1g/mL(以生药量计)；用水洗剂树脂12BV，洗脱流速为6BV/h，冲洗液弃去；用90％乙醇洗脱8倍树脂体积，洗脱流速为5BV/h，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，减压干燥得黑刺菝葜总皂苷。测定黑刺菝葜总皂苷提取物中总皂苷含量为90％，测定黑刺菝葜皂苷a、黑刺菝葜皂苷b和黑刺菝葜皂苷c三种成分的含量之和为89％。

实施例4：酶法制备黑刺菝葜总皂苷提取物的方法

黑刺菝葜干燥根茎，粉碎，过100目筛，加入粉末25g和60mL水置于生物反应器中，加入0.03mL的淀粉酶液，调节pH值为4.5，反应温度为75℃，当碘试剂遇反应液不再变蓝，酶反应结束，继续保温2h，促进甾体皂苷的浸出。离心分离固体残渣和滤液，用100mL去离子热水洗涤滤渣，合并滤液；依次用等体积的石油醚、正丁醇分别萃取5次，减压回收、干燥正丁醇萃取物得黑刺菝葜总皂苷提取物。测定黑刺菝葜总皂苷提取物中总皂苷含量为92％，测定黑刺菝葜皂苷a、黑刺菝葜皂苷b和黑刺菝葜皂苷c三种成分的含量之和为88％。

实施例5：利用黑刺菝葜总皂苷提取物制备拉肖皂苷元的方法

将总皂苷50毫克溶解在30mL浓度为1mol/L H₂SO₄(MeOH∶H₂O＝1∶1)溶液中，85℃热水浴回流水解2h，反应液冷却后，减压浓缩除去甲醇，再用环己烷萃取，回收溶剂，N₂干燥得拉肖皂苷元，纯度98％。