具有抗氧化、老年保护和抗局部缺血活性的物质及其制备方法

摘要

本发明涉及药物领域，即涉及新的生物活性化合物，尤其是2，4，6－三甲基－3－羟基吡啶衍生物及其盐(化合物1)，其具有抗氧化、老年保护和抗局部缺血活性。通过在60℃－100℃的温度下，使摩尔数相等量的2，4，6－三甲基－3－羟基吡啶和二羧酸在低级醇的溶液中反应，接着用有机溶剂处理该反应物质，并且在10℃－15℃保持2－5小时，来制备化合物(1)的盐。

说明书

本发明涉及药物领域，即涉及新的生物活性化合物，尤其涉及具 有抗氧化、老年保护(geroprotective)和抗局部缺血活性的2，4，6-三 甲基-3-羟基吡啶与低级二羧酸所成的盐(化合物Ia-d)。化合物Ia-d 显示了对脂质过氧化物氧化过程的抗氧化活性，其适于所有3-羟基吡 啶衍生物。该性质允许设想，化合物Ia-d以及其类似物emoxypine(盐 酸2-甲基-6-乙基-3-羟基吡啶)和mexydole(琥珀酸2-甲基-6-乙基-3- 羟基吡啶)，可以用作眼科学中的医疗剂，也就是说，结膜下出血以 及进入眼睛任何部分和组织中的眼出血、不同病因学的血管型视网膜 病(包括糖尿病性、脉络膜视网膜营养障碍、视网膜中央静脉血栓形 成与静脉分支)、并发的近视、营养不良型角膜炎和用于视网膜脱离 症手术后强效光线影响下的角膜与视网膜的保护与治疗。此外，设想 具有所表达的抗局部缺血活性的化合物Ic可能在心脏病学中用于治 疗缺血性心脏病与动脉粥样硬化症。

也发现化合物Ic是脂质的光诱导的过氧化物氧化的有效抑制剂， 该氧化被从老年人眼中分离的“老年色素”即脂褐质颗粒敏化，这表明 化合物Ic能够使老年人体内蓄积的脂褐质颗粒的有毒活性失效，也就 是具有老年保护作用。因此，设想可以将化合物Ic用于灭活脂褐质的 毒性作用是可能的。目前普遍接受的脂褐质是导致老年性黄斑性视网 膜变性发展的基本因素。老年性黄斑性视网膜变性属于60岁以上的人 的最普遍的眼科疾病。根据统计学数据，导致全盲的该病影响了几乎 30％65岁以上的美国人，并且患病的人的百分比随年龄快速增长。

已知用于眼中介质与组织的抗氧化保护的药物是含亲水性 (hydrophylic)增塑添加剂的生物可溶性聚合物，并且包含作为药物 的emoxypine与piroxydine的盐酸盐(RU 2070010，1993)。

已知有生物活性的食物添加剂“glutapiron”尤其具有老年保护活 性，并且包含作为活性剂的2-(2，6-二甲基-3，5-二乙氧基腈 (dietoxycarbonile)-1，4-二氢吡啶-4-甲酰氨基)戊二酸的盐(RU 95116403，1995)。

也已知尤其显示出抗局部缺血活性的N-(3-氯-1，4- naphtohynonyl)-2-谷氨酸的二钾盐作为药剂的用途。

与本发明最接近的现有技术代表琥珀酸2-甲基-6-乙基-3-羟基吡 啶(mexydole)(M.D.Mashkovsky，“Pharmaceuticals”，第二部分， 1993，Moscow，Medicine，第216页)，其有抗氧化与膜保护作用， 通过加热2-甲基-6-乙基-3-羟基吡啶与琥珀酸的醇溶液1小时，制备该 物质(SU 509047，1973)。

本发明的目的是提供新的物质，即具有抗氧化、老年保护与抗局 部缺血性质的3-羟基吡啶家族的衍生物，其对眼组织不显示刺激性作 用。

本发明的实质在于新的化合物，其代表药学上可接受的通式Ia-d 的2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶与低级二羧酸所成的盐，其具有抗氧化、 老年保护和抗局部缺血的活性。

X是单键(化合物Ia，乙二酸盐，C₉H₁₁NO·C₂H₂O₄)；

X是CH₂(化合物Ib，丙二酸盐，C₉H₁₁NO·C₃H₄O₄)；

X是CH₂CH₂(化合物Ic，琥珀酸盐，C₉H₁₁NO·C₄H₆O₄)；

X是CH₂CH(OH)基团(化合物Id，苹果酸盐，C₉H₁₁NO·C₄H₆O₅)。

本发明的另一个目的是提供制备具有抗氧化、老年保护和抗局部 缺血活性的2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶盐的方法，该方法包括在 60℃-100℃的温度下使摩尔数相等量的2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶和二 羧酸在低级醇的溶液中反应，然后用有机溶剂处理反应物质，并且在 10℃-15℃保持2-5小时。

实施例1.2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶有机盐的制备

A).2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶乙二酸盐(Ia)的制备。

将0.8g(0.00583mol)2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶碱、0.525g(0.00583 mol)无水乙二酸和10ml甲醇注入带有磁力搅拌器与回流冷凝器的烧 瓶中。搅拌状态下将反应混合物加热至沸腾，并持续沸腾0.5小时。 然后，停止加热，在真空状态下去掉溶剂，将5ml丙酮加入反应混合 物，并用玻璃棒研磨该混合物5-10分钟。通过过滤将得到的结晶状残 留物分离，并用丙酮在滤器上洗涤并且将其真空干燥。

获得了1.1g(理论的83％)的该盐。其熔点为140℃-142℃。得 到的，％：C 53.4，H 5.9。计算的，％：C 52.9，H 5.8。

NMR-¹H Bruker WH-400(400MHz)(DMSO-d₆)：2.20(3H，s， CH₃)；2.34(3H，s，CH₃)；2.37(3H，s，CH₃)；7.05ppm(1H，s， CH)。

B).2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶丙二酸盐(Ib)的制备。

将0.8g(0.00583mol)2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶碱、0.607g(0.00583 mol)丙二酸和10ml乙醇注入带有磁力搅拌器和回流冷凝器的烧瓶 中。在搅拌状态下将反应混合物加热至沸腾，并持续沸腾0.5小时。 然后，停止加热，在真空状态下去掉熔剂，并将5ml丙酮加入反应混 合物中，在10℃-15℃将混合物保持3小时。将得到的结晶状残留物研 磨，经过滤分离和在滤器上用丙酮洗涤，并且将其真空干燥。得到1.2 g  (理论的85.3％)的该盐。其熔点是118℃-120℃。得到的，％：C 55.0，H 6.5。计算的，％：C 54.8，H 6.3。

NMR-¹H Bruker WH-400(400MHz)(DMSO-d₆)：2.16(3H，s， CH₃)；2.30(3H，s，CH₃)；2.33(3H，s，CH₃)；3.11(2H，s，CH₂)； 6.93ppm(1H，s，CH)。

C).2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶琥珀酸盐(Ic)的制备。

将3.4g(0.025mol)的2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶碱、2.93g(0.025 mol)的琥珀酸和50ml异丙醇注入带有磁力搅拌器和回流冷凝器的烧 瓶中。在搅拌状态下将反应混合物加热至沸腾，并持续沸腾0.5小时。 然后，停止加热，并且将30ml丙酮分步加入到反应物质中，在 10℃-15℃将该物质保持3小时。将得到的结晶状残留物过滤分离，在 滤器上用丙酮洗涤，并且将其真空干燥。得到5.6g(理论的88.5％) 的该盐。其熔点是128℃-129℃。

得到的，％：C 56.5，H 6.9。计算的，％：C 56.5，H 6.7。

NMR-¹H(DMSO-d₆)：2.12(3H，s，CH₃)，2.26(3H，s，CH₃)， 2.31(3H，s，CH₃)，2.42(4H，s，CH₂)，6.79(1H，s，CH-Py)，10.57 (b.s，COOH)。

D).2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶苹果酸盐(Id)的制备。

将0.8g(0.00583mol)的2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶碱、0.782g (0.00583mol)的羟基-丁二酸与10ml甲醇注入带有磁力搅拌器和回 流冷凝器的烧瓶中。在搅拌状态下，将反应混合物加热至沸腾，并持 续沸腾0.5小时。然后，在真空状态下去掉熔剂。在搅拌状态下，用 丙酮将该油状残留物洗涤两次，并通过倾析将溶剂去除。将得到的物 质抽真空，并在0.5mm Hg的剩余压力下保持1小时。然后，将该物 质保持结晶48-72小时。得到熔点为70℃-75℃的白色固体化合物。

产量是1.12g(理论的70.8％)。得到的，％：C 53.5，H 6.4。 计算的，％：53.1，H 6.3。

NMR-¹H Bruker WH-400(400MHz)(DMSO-d₆)：2.12(3H，s， CH₃)；2.26(3H，s，CH₃)；2.30(3H，s，CH₃)；3.11(2H，s，CH₂)； 2.41(1H，双重双峰，J²_HAHB＝15.7Hz；J³_HACH＝5.4Hz CH_AH_B)；4.2ppm (1H，双重双峰，J³_CHHA＝5.4Hz；J³_CHHB＝7.4Hz，CH)。

实施例2.化合物1的老年保护作用，以对光诱导的

人脂褐质颗粒脂质体过氧化作用的抑制为例。

通过蒸发甲醇并将心磷脂溶解于磷酸盐缓冲溶液中，由心磷脂的 甲醇溶液(初始浓度：5mg/ml)制备脂质体。使包含脂质体与从人 眼视网膜色素上皮组织中分离的脂褐质颗粒的混悬液的混合物在持续 搅拌状态下经受强烈的蓝光照射。20、40、60与90分钟后，测定脂 质过氧化产物(TBK-活性产物)的浓度。实验样品包含2mM的化合 物Ic溶液或2mM mexydole溶液。将实验结果列于表1中。

表1.化合物Ic(与mexydole比较)对脂褐质诱导的

心磷脂光过氧化作用的抑制作用

结果表明，化合物1对老年色素-人眼脂褐质颗粒的光毒性作用的 保护作用。在这些条件下，mexydole实际上几乎没有显示抑制作用。

实施例3.化合物Ic对抗坏血酸诱导的猪眼光感受器

过氧化的抗氧化作用。

以蔗糖密度梯度，使用差速离心的方法，根据标准程序从猪视网 膜中获得光感受器细胞的外片段。将包含磷酸钠缓冲溶液(pH 7.3)、 10⁸片段/毫升光感受器细胞的外片段、0.5mM抗坏血酸和17mM化 合物Ic的混合物于黑暗中持续搅拌状态下温育15和30分钟。然后， 用15％三氟乙酸中止所述过程，并测定TBK-活性产物的浓度。将不 含化合物Ic的样品用作对照。将得到的结果显示于表2a中。

表2a.化合物Ic对抗坏血酸诱导的光感受器细胞

外片段过氧化的抑制作用。

将化合物Ia、Ib、Ic和Id的抗氧化活性的比较显示于表2b中。 在这些实验中，进行了抗坏血酸诱导的猪眼光感受器细胞外片段过氧 化的速度的比较，上述比较是相对于在不同化合物I盐存在下TBK- 活性产物的蓄积测定的。

表2b.化合物Ia、b、c和d对于抗坏血酸诱导的光感受器细胞 外片段过氧化的抑制作用的比较。

  化合物I，   浓度，mM   反应30分钟的TBK-活性产物   的蓄积速度，nmol/mg   抑制，％   对照，0mM   0.77   -   化合物Ia，44mM   0   100   化合物Ib，44mM   0.23   70   化合物Ic，43mM   0.05   93.5   化合物Id，43mM   0.1   87

结果显示，所有化合物I盐都显示了对光感受器眼细胞暗过氧化 的显著抗氧化活性。

实施例4.与mexydole相比，化合物Ic的抗自由基活性的测定。

用半发光方法，通过测量它们与乙基-苯k₇过氧化物自由基反应 的速度常数，来测定作为自由基反应抑制剂的3-羟基吡啶衍生物的功 效。

使用CNK-7仪器(由IHF RAN USSR设计并制造)进行化学发 光(HL)强度的测量。将光电倍增管FAU-38用作光接受器。由引发 剂即偶氮-二-异丁腈控制在异丙基甲苯氧化过程中自由基的固定浓度 (cumole)。

为了增加HL发射，使用活化剂螯合Eu (铕tristenoyl triphtoroacetonate与1，10-phenatroline)，这允许以低速值的自由基引 发(W₁＝10^-8-10^-9mol/l.s.)，并且，因此以少量的添加样品进行测量。 将称重的量的研究样品稀释在适合的溶剂(氯苯或乙腈)中，并将少 量的制备溶液(0.1-0.25ml)加入安置于HL装置的控温反应容器中 的反应混合液(5-6ml)中。记录发射强度的变化。将得到的结果于 表3中显示。

表3.氮杂环的对-羟基衍生物(p-oxyderivatives)对 乙基-苯过氧化物自由基的抗自由基活性。

  化合物   k₇×10^-4l/mol×sec   Metoxydole   4.5   化合物Ic   9.5

显示了化合物1与mexydole的抗自由基活性的对比评估，化合物 1显示高出2倍的抗自由基活性。

实施例5.化合物Ic对在急性心肌缺血情况下

坏死缺血区域大小的影响的研究。

对体重为250-300g的非纯种(non-pedigree)雄性大鼠进行该实 验，用香草二乙胺钠(sodium ethaminale)(40mg/kg腹膜内给药) 将大鼠麻醉。通过结扎左侧冠状动脉到心耳(auricula atrii)下沿水 平的降支，建立动物的心肌梗塞模型，动物转向呼吸受控。

在闭合冠状动脉后4小时之内，通过不同的指示剂方法测定坏死 区域与缺血区域的大小，其原理是基于伊文思蓝(Evan’s blue)(缺 血区域的指示剂)和甲臜红(red phormazane)(坏死区域的指示剂) 的单独定量测定。

表4.与其它3-羟基吡啶衍生物比较，化合物Ic的抗局部缺血

活性(大鼠冠状动脉闭合后4小时之内)

  实验条件   剂量，   mg/kg   动物   数量   坏死区域与心肌   总量的比率(％)   坏死区域与缺血   区域的比率(％)   对照   -   17   22±2.0   68±4.3   化合物1   16   7   4±2.3   11±3.3

  Emoxypine   26   8   9±2.4   32±4.6   Mexydole   26   8   8±1.4   46±5.6   Nicorandile   12   8   10±1.6   42±5.4

如可看到的，化合物Ic显示了比其它3-羟基吡啶更高得多的抗局 部缺血活性。

实施例6.化合物Ic对眼组织的局部刺激作用的研究。

对6只兔进行实验性测量。使所有动物接受右眼内单次滴入1％ 的化合物1溶液，左眼内滴入1％的emoxypine溶液。在滴入后1分 钟内用20D透镜通过焦点照明法控制眼的前面部分。结果显示：

在动物的右眼中未检测到眼睑和眼球的结膜、或角膜的反应。

4只动物的左眼中观察到明显的眼球的结膜充血和下眼睑的结膜 充血。其它两只动物显示中等的眼部结膜充血。

因此，该结果证明，所要求保护的化合物Ic及其盐具有抗氧化、 老年保护和抗局部缺血的活性，并未显示对眼组织的局部刺激作用。

化合物Ic与广泛用于医疗实践中的药物mexydole与emoxypine 的抗氧化、老年保护和抗局部缺血活性的对比评价表明了所要求保护 的物质的更高功效和更低的毒性，并且也显示了所述物质在眼科和心 脏病学实践以及其它医学领域中使用的前景。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1. 具有抗氧化、老年保护和抗局部缺血活性的药学上可接受的 2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶与低级二羧酸所成的盐(化合物Ia-Id)，

其中

X选自(化合物Ia，乙二酸盐，C₉H₁₁NO·C₂H₂O₄)、CH₂(化合 物Ib，丙二酸盐，C₉H₁₁NO·C₃H₄O₄)、CH₂CH₂(化合物Ic，琥珀酸 盐，C₉H₁₁NO·C₄H₆O₄)和CH₂CH(OH)(化合物Id，苹果酸盐， C₉H₁₁NO·C₄H₆O₅)。

2. 制备权利要求1的2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶盐的方法，其中在 沸腾温度下，将摩尔数相等量的2，4，6-三甲基-3-羟基吡啶和二羧酸在 低级醇的溶液中反应，接着用有机溶剂处理该反应物质，并且任选地， 在10℃-15℃保持2-5小时。