红曲霉突变株及其发酵得到黄色素的方法

摘要

本发明涉及一种红曲霉突变株及其发酵得到黄色素的方法，该红曲霉突变株Monascus anka mutant MYM2于2007年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC2275。该红曲霉突变株发酵得到黄色素的方法如下：以pH值3～4.5的液体培养基作为发酵培养基，以硫酸铵和玉米浆作为主要氮源，以葡萄糖和可溶性淀粉为主要碳源，在25－35℃下发酵3－10天，摇床的转速为160－300r/min。发酵得到的黄色素着色能力非常强，耐高温，对金属离子稳定，在宽pH值下稳定，主要为脂溶性黄色素，能与其它色素复合使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌株及其发酵方法，特别是一种红曲霉突变株及其发酵得到黄色素的方法。

背景技术

历史上，红曲在中国和其他亚洲国家被作为一种食品添加剂被广泛应用。有许多美国专利(U.S.Pat.Nos.4442209和5457039)报道利用红曲霉菌株(Monascus sps.)来生产红色素，黄色素和橙色素，而这些色素都是作为主要的天然色素广泛应用在食品和医药领域。根据美国专利(U.S.PatNo.5,429,943)报道，在红曲霉菌代谢生产的色素中，红色素和黄色素的产量比例接近1∶1，也就是说，代谢产生的色素色调接近1，并且红曲色素显示的色调是红色，因而，红曲色素在食品和医药领域的应用主要是红曲红色素。也有相关的专利(U.S.Pat.No.5013564)报道利用红曲霉菌来代谢生产黄色素；而在日本专利(JP 55088696和81053589)中，通过改变生长代谢外界环境来生产黄色素的相关报道，如通过改变发酵pH值和培养基成份来发酵生产红曲黄色素。但是，生产的黄色素是通过固态发酵生产得到，效率较低，且通过此方法得到的红曲黄色素色价不高，色调也不高，其黄色素的产量是红色素的1-2倍。得到的黄色素是一种复合色素，是红曲色素与培养基成分中的氮源发生化学反应，生成的色素衍生物，呈现黄色色调。

发明内容

本发明的目的是提供一株红曲霉突变株(Monascus anka mutant)MYM2，此突变株能利用廉价的原料，通过液态或固态发酵生产红曲黄色素。

本发明的另一目的是通过利用该红曲霉突变株，提供一种发酵得到黄色素的方法。

本发明的MYM2是通过物理和化学的复合诱变得到的一株产黄色素高比例和高色价的红曲霉突变株，并且是华南理工大学生物科学与工程学院生化工程研究室通过不断诱变筛选得到的。本发明中诱变菌株所用的方法是一些传统微生物菌种育种的方法，包括化学物质(如硫酸二乙酯、氯化锂和亚硝基胍)和物理(如紫外照射)的处理。

本发明中的红曲霉突变菌株(Monascus anka mutant MYM2)于2007年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC2275。该菌株的菌落质地较松疏，毡状平坦，背面有放射状辐射纹，边缘平整，菌丝体初期绒毛圆形状，菌落白色，生长中期菌落为黄色，成熟期菌落为红色，整个菌落直径在30-40μm。

本发明以Monascus anka mutant MYM2为发酵菌株，以pH值3～4.5的液体培养基作为发酵培养基，以硫酸铵和玉米浆作为主要氮源，以葡萄糖和可溶性淀粉为主要碳源，在25-35℃下发酵3-10天，摇床的转速为160-300r/min。

在本发明中，一般的碳源和氮源可以作为培养基成分来发酵生产黄色素，碳源不限制于大米粉、玉米淀粉、大米淀粉、小麦淀粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘油；氮源不限于大豆粉、酵母粉、玉米浆、硫酸铵和硝酸钠等。

根据本发明，通过液态发酵生产的黄色素是作为一种食品添加剂，并且发酵得到的黄色素通过各种传统技术能得到进一步的纯化。如通过离子交换(JP 07216248)，通过控制溶剂和pH值和通过乙醇抽提。另外，来源于真菌的黄色素能通过传统的方法得到一定程度的纯化。根据本发明，通过液态发酵生产的黄色素能应用到食品、服装领域，如果通过进一步的分离纯化能应用到医药领域。

本发明的目的在于通过液态发酵技术，提供一种利用廉价原料，以Monascus anka mutantMYM2为生产菌株，通过一定的工艺优化，生产得到高色调的黄色素。

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

黄色素和红色素的分析：把通过液态发酵得到的发酵液进行离心，沉淀用70％乙醇抽提，抽提液经过适当的稀释，用紫外分光光度计于410nm和510nm两个波长下进行吸光度检测，其中410nm为黄色素，510nm为红色素。410nm的吸光度值和510nm的吸光度值的比值(即色调)来判断黄色素质量的高低，比值(色调)越高说明黄色素的比例越大。

附图说明

图1为红曲黄色素的吸收光谱图(溶剂为70％乙醇)。

具体实施方式

实施例1：菌株的诱变和突变株的筛选。

Monascus anka菌株接种在麦芽汁琼脂(糖份10％的麦芽汁粉10％，琼脂2％)斜面上，在31℃培养2-3天后，用5mL生理盐水冲洗菌种斜面的菌体(苔)，经玻璃珠打散，无菌擦镜纸过滤，制成含孢子1×10⁵个/mL悬浮液。在15W紫外灯，距离30cm下照射，同时磁力搅拌，红光下涂平板(含一定浓度氯化锂的麦芽汁琼脂平板)，避光培养。培养2-3天后用5mL生理盐水冲洗菌种斜面的菌体(苔)，经玻璃珠打散，无菌擦镜纸过滤，制成含孢子1×10⁵个/mL悬浮液。取一定量的孢子悬浮液，加入一定量的硫酸二乙酯配制成一定浓度，振荡30min，然后加入硫代硫酸钠终止反应。然后倒平板(含一定浓度氯化锂的麦芽汁琼脂平板)，培养2-3天后用5mL生理盐水冲洗菌种斜面的菌体(苔)，经玻璃珠打散，无菌擦镜纸过滤，制成含孢子1×10⁵个/mL悬浮液。菌悬液加入一定浓度的亚硝基胍，31℃充分振荡处理30min，离心去上清液，然后用pH7.0的磷酸缓冲液等梯度大量稀释孢子沉淀以终止反应。然后倒平板(麦芽汁琼脂平板)培养2-3天。通过菌落颜色来挑选突变菌株。最后通过平板培养来筛选稳定性菌株，挑选的形态稳定性菌株通过液态发酵(培养基成分：玉米粉7％，硫酸铵1.5％，氯化钙0.01％，磷酸二氢钾0.5％，pH4左右)来验证突变菌株的稳定性。

突变菌株在麦芽汁琼脂平板于31℃下培养2-3天，然后用无菌水洗涤孢子，制成孢子个数为10⁵个/mL左右的孢子悬浮液，然后吸取1毫升孢子悬浮液加到30毫升(250毫升的三角瓶，装液量为30毫升)的发酵培养基中，在转速为200r/min和31℃下培养6-7天，发酵液通过离心，用70％乙醇抽提菌体，再离心得到的上清液通过适当的稀释，于410nm和510nm下进行吸光度检测，所有实验均三个平行，突变菌株连续进行5代的传代稳定性实验，实验结果如表1所示，表1为MYM2产黄色素稳定性实验。表1的数据显示诱变得到的突变菌株生长代谢性状比较稳定。

表1

  MYM2 传代次数 1  2  3  4  5  6  黄色素色价  (U/mL)  胞内色调  胞外色调 27.5±0.15  3.1±0.035 3.5±0.076  29.8±0.17   3.2±0.094  3.4±0.024  27.6±0.20   3.0±0.038  3.27±0.02  24.8±0.23   3.1±0.092  3.4±0.011  25.6±0.14   3.2±0.068  3.4±0.051  26.2±0.19   3.1±0.076  3.3±0.025

最后得到的菌株形态。图1为红曲霉突变菌株在麦芽汁琼脂平板上的菌落形态。该菌株的菌落质地较松疏，毡状平坦，背面有放射状辐射纹，边缘平整，菌丝体初期绒毛圆形状，菌落白色，生长中期菌落为黄色，成熟期菌落为红色，整个菌落直径在30-40μm。图1为红曲黄色素的吸收光谱图(溶剂：70％乙醇)，图1表明，突变菌株代谢形成的黄色素在410nm波段左右有最大吸收峰。突变菌株与本实验室保藏的红曲霉出发菌株发酵液色调的对比结果见表2，其数据显示突变得到的红曲霉突变菌株MYM2代谢形成的色素发酵液的黄色素色调比其它红曲霉菌株代谢形成的色素发酵液的黄色素色调要高很多。

表2

 菌株    胞外色调    胞内色调    总色调 Monascus anka M53 Monascus purpureus M32 Monascus rubber KRM12 Monascus pilous MPM245 Monascus rubber MRM24 Monascus anka mutant MYM2    1.51±0.020    1.23±0.059    1.27±0.026    1.42±0.049    1.34±0.035    3.30±0.025    1.32±0.019    1.40±0.047    1.26±0.090    1.83±0.092    1.28±0.079    3.12±0.076    1.36±0.056    1.37±0.067    1.26±0.084    1.73±0.067    1.30±0.030    3.21±0.127

实施例2：黄色素发酵生产pH的选择

根据实施例1种所述方法，Monascus anka mutant MYM2的孢子悬浮液接种于发酵培养基中，发酵培养基成分如下：玉米粉70g/L，硝酸钠30g/L，FeSO₄.7H₂O 0.01g/L，CaCl₂ 0.1g/L，KH₂PO₄ 5g/L，培养基初始pH值分别为2.0，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0。培养条件为31℃和200r/min下振荡培养6-7天，发酵液离心后，菌丝体用70％乙醇等体积抽提一小时，离心上清液于410nm和510nm下用紫外分光光度计检测吸光度，结果如表3所示。表3为不同pH对红曲色素色调的影响。结果显示培养基初始pH值在3-4..5最适合黄色素的代谢形成。

表3

  pH    总色调    总黄色素(U/mL)  2  3  3.5  4  4.5  5  6    3.83±0.022    3.71±0.013    3.75±0.029    3.64±0.019    3.17±0.011    2.75±0.013    2.65±0.044    11.92±0.042    13.85±0.013    17.88±0.012    16.77±0.015    14.89±0.009    13.88±0.002    13.82±0.047

实施例3：黄色素发酵生产氮源的选择

根据实施例2所述方法，Monascus anka mutant MYM2的孢子悬浮液接种于发酵培养基中，发酵培养基成分如下：玉米粉70g/L，氮源30g/L，FeSO₄.7H₂O 0.01g/L，CaCl₂ 0.1g/L，KH₂PO₄ 5g/L。玉米浆，硝酸钠，蛋白胨胰蛋白胨，酪蛋胨，酵母抽提物，尿素，草酸铵，硫酸铵，硝酸铵和柠檬酸三铵作为有机氮源和无机氮源。培养条件为25℃和160r/min下培养10天，发酵液离心后，菌丝体用70％乙醇等体积抽提1小时，离心后上清液于410nm和510nm下用紫外分光光度计检测吸光度。其结果如表4，表4为混合氮源(硫酸铵加玉米浆)的实验。结果表明，硫酸铵是一种有利于黄色素代谢形成的无机氮源，玉米浆是一种有利于黄色素代谢形成的有机氮源。

表4

  胞内色调  胞外色调  总色调  胞外黄色素色  价(U/mL) 胞内黄色素色 价(U/mL) 总黄色素色价 (U/mL)  3.19±0.035  3.53±0.076  3.24±0.053 22.34±1.756 54.15±2.207 76.51±2.189

实施例4：黄色素发酵生产碳源的选择

根据实施例2所述方法，其培养条件为35℃和300r/min下培养3-4天，所有实验均重复三次。Monascus anka mutant MYM2的孢子悬浮液接种于发酵培养基中，发酵培养基成分如下：碳源70g/L，硫酸铵1.5％，玉米浆1.0％，FeSO₄.7H₂O 0.01g/L，CaCl₂ 0.1g/L，KH₂PO₄ 5g/L。淀粉，麦芽糖，蔗糖，葡萄糖和甘油作为碳源。发酵培养方法和色素检测方法如实施例2中所述。结果如表5。表5为单一碳源对色调的影响。淀粉和葡萄糖混合碳源的实验结果如表6。结果表明，淀粉和葡萄糖的混合碳源对黄色素的代谢形成有利，色调也比较高。

表5

碳源    胞外色调    胞内色调    总色调淀粉麦芽糖葡萄糖    4.53±0.203    1.34±0.091    5.60±0.795    4.65±0.352    0.81±0.004    4.66±0.239    4.62±0.266    0.92±0.011    4.701±0.197

蔗糖甘油  1.34±0.009  1.35±0.031  0.87±0.037  0.82±0.013    0.97±0.037    0.90±0.017

表6

胞内色调  胞外色调  总色调  胞外黄色素色  价(U/mL) 胞内黄色素色 价(U/mL) 总黄色素色价 (U/mL)4.50±0.1500  4.580±0.050  4.54±0.917  5.64±0.837 85.52±6.989 91.16±5.826

综上所述，通过红曲霉突变株Monascus anka mutant MYM2发酵得到的黄色素的色调和色价都比较高，并且能利用廉价的原料通过液态发酵得到，得到的黄色素是一种天然的微生物来源的食品级色素。