一种检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法及其试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法及其试剂盒，该方法和试剂盒可应用于筛查鸡只产鱼腥味蛋性状。使用本发明的方法或试剂盒可准确、高效地判别鸡只是否携带鸡蛋鱼腥味突变等位基因，剔除实际生产中的鸡蛋鱼腥味问题，大大降低分子育种花费，有利于更广泛选择饲料原料，降低饲养成本，提高经济效益。本发明提供的检测方法或试剂盒操作简单，费用低廉，检测时间短，准确度高，可实现自动化检测，将在鸡育种中发挥巨大作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法及其试剂盒。

背景技术

随着经济的发展和物质生活水平的提高，人们对畜产品质量的要求越来越高，对鸡蛋的需求已经不再仅限于数量，对品质风味也有了更高的要求。通常饲料含鱼粉会导致鸡只产出鱼腥味蛋，然而用不含鱼粉的饲料喂养，仍然有部分鸡只产鱼腥味蛋。由于必需打开鸡蛋才能判断其是否有鱼腥味，造成了养禽生产者和加工者很大的经济损失。因此，研究鸡蛋鱼腥味的产生机理并通过育种手段剔除它，具有非常重大的经济意义和社会意义。

根据Bolton等(1976)研究发现，鸡只产鱼腥味蛋的性状为常染色体隐性遗传，传统育种方法很难剔除突变基因。随着分子生物学技术和鸡基因组研究的飞快发展，育种更准确、进展更快的分子育种已经提上历史舞台，从分子生物学角度研究鱼腥味产生的机理，并研究候选基因和分子遗传标记，运用标记辅助选择的方法可以快速、高效的达到育种的目的。

某些食物中含有三甲胺，如油菜籽，三甲胺挥发可产生很难闻的鱼腥味。含黄素单氧化酶3(flavin-containing mono-oxygenase3，FMO3)主要存在于肝脏中，其功能为促进食物中的三甲胺氧化成没有气味的N-氧化三甲胺，FMO3基因突变个体不能氧化机体从食物中摄入的三甲胺，从而导致三甲胺沉积，发生鱼腥味。有研究发现，人类和奶牛的FMO3基因突变均可导致鱼腥味的发生(Treacy，et al.1998；Akerman et al.1999；Lundén et al.2002)。FMO3基因突变的鸡只，由于不能氧化从食物中摄入的三甲胺，会导致三甲胺沉积到蛋黄中，产出鱼腥味蛋。Honkatukia等(2005)已经成功克隆了鸡的FMO3基因，该基因位于鸡8号染色体上，FMO3的cDNA全长1882bp，含9个外显子，共编码531个氨基酸残基(GenBank Accession NumberAJ431390)。

SNP(single nucleotide polymophism)，即单核苷酸多态，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。目前已有很多成熟的技术检测SNP，如单链构象多态性(PCR-SSCP)、DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)、等位基因特异寡聚核苷酸杂交、DNA芯片及TaqMan等。PCR-SSCP方法最为常用，但存在的问题有：检测步骤较多；耗时较长(12-20小时)；易出现杂带，增加错判几率，结果的可信度较低。DNA测序、等位基因特异寡聚核苷酸杂交、DNA芯片和TaqMan方法虽然准确度都比较高，但检测费用高，运用到实际育种比较困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法。

本发明所提供的检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法，是PCR扩增包括GenBank Accession Number AJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸在内的片段，用限制性核酸内切酶BsrI酶切所得的PCR扩增产物，电泳检测所得到的酶切产物，按照如下方法确定待测鸡只的GenBank Accession Number AJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸是野生型A还是突变型T：如果电泳显示为两条带，所述待测鸡只的基因型为AA，是野生型纯合体；如果电泳显示为一条带，所述待测鸡只的基因型为TT，是突变型纯合体；如果电泳显示为三条带，所述待测鸡只的基因型为AT，是杂合体。

上述检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法，具体可为：用序列是序列表中的序列1和序列是序列表中的序列2组成的一对引物进行PCR。

上述检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法，具体可为：以所述待测鸡只的基因组DNA为模板，用序列是序列表中的序列1和序列是序列表中的序列2组成的一对引物进行PCR，用限制性核酸内切酶BsrI酶切所得的PCR扩增产物，按照如下方法确定待测鸡只的GenBank Accession Number AJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸是野生型A还是突变型T：如酶切产物为143bp和226bp两个片段，所述待测鸡只的基因型为AA，是野生型纯合体；如酶切产物为369bp一个片段，所述待测鸡只的基因型为TT，是突变型纯合体；如酶切产物为143bp、226bp及369bp三个片段，所述待测鸡只的基因型为AT，是杂合体。

本发明的另一个目的是提供一种检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的试剂盒。

本发明所提供的检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的试剂盒，含有PCR扩增包括GenBank Accession Number AJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸在内的片段所用的引物对和限制性核酸内切酶BsrI。

该试剂盒中，所述引物对的一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2。

所述试剂盒中还可包括进行PCR-RFLP所需的其它试剂，这些试剂均可从商业途径得到。

本发明还提供了上述检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法在确定鸡只产鱼腥味蛋性状中的应用。

本发明还提供了上述检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的试剂盒在确定鸡只产鱼腥味蛋性状中的应用。

通过本发明所提供的检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法或试剂盒，可确定待测鸡只的GenBank Accession Number AJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸是野生型A还是突变型T，从而确定鸡只产鱼腥味蛋性状：突变型纯合体TT在饲喂含有三甲胺的饲料时产鱼腥味蛋；野生型纯合体AA、杂合体AT，在饲喂含有三甲胺的饲料时不产鱼腥味蛋。

利用本发明提供的方法或试剂盒检测鸡只是否携带鸡蛋鱼腥味突变等位基因，可以确定鸡只产鱼腥味蛋性状，使配制饲料过程中不用刻意剔除含有三甲胺的原料，大大节省饲料成本，获得可观的经济效益。本发明为蛋鸡育种工作中针对产鱼腥味蛋性状开展标记辅助选择，提供了一个分子遗传标记检测方法，使用该方法和遗传标记对蛋鸡的产鱼腥味蛋性状进行标记辅助选择，可大大降低分子育种的花费，并可有效剔除实际生产中的产鱼腥味蛋问题，为加速改善鸡蛋风味的分子育种奠定了基础。本发明提供的方法或试剂盒操作简单，只需将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，可确定待测鸡只的GenBank Accession Number AJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸是野生型A还是突变型T。准确度高，没有杂带；耗时短，4-6小时；费用低廉；可实现自动化检测。为鸡的育种工作提供便利，将在鸡的育种中发挥巨大作用。

附图说明

图1为酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

本发明提供的检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法可用于检测鸡只产鱼腥蛋性状。

下述实施例提供了具体的检测鸡只产鱼腥味蛋性状的方法：PCR扩增包括GenBank Accession Number AJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸在内的片段，用限制性核酸内切酶BsrI酶切所得的PCR扩增产物，电泳检测酶切产物，按照如下方法确定待测鸡只的GenBank Accession Number AJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸是野生型A还是突变型T，从而确定待测鸡只的产鱼腥味蛋性状：如果电泳显示为两条带，所述待测鸡只的基因型为AA，是野生型纯合体，在饲喂含有三甲胺的饲料时不产鱼腥味蛋；如果电泳显示为一条带，所述待测鸡只的基因型为TT，是突变型纯合体，在饲喂含有三甲胺的饲料时产鱼腥味蛋；如果电泳显示为三条带，所述待测鸡只的基因型为AT，是杂合体，在饲喂含有三甲胺的饲料时不产鱼腥味蛋。

进行所述PCR扩增的一对引物中，一个引物的核苷酸序列具体可为序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列具体可为序列表中序列2。

所述PCR扩增的模板具体可为所述待测鸡只的基因组DNA。

以上述待测鸡只的基因组DNA作为模板应用上述引物对进行PCR扩增后，用限制性核酸内切酶BsrI酶切所得的PCR扩增产物，电泳检测酶切产物，可按照如下方法确定待测鸡只的GenBank Accession Number AJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸是野生型A还是突变型T，从而确定待测鸡只的产鱼腥味蛋性状：如酶切产物为143bp和226bp两个片段，所述待测鸡只的基因型为AA，是野生型纯合体，在饲喂含有三甲胺的饲料时不产鱼腥味蛋；如酶切产物为369bp一个片段，所述待测鸡只的基因型为TT，是突变型纯合体，在饲喂含有三甲胺的饲料时产鱼腥味蛋；如酶切产物为143bp、226bp及369bp三个片段，所述待测鸡只的基因型为AT，是杂合体，在饲喂含有三甲胺的饲料时不产鱼腥味蛋。

下列实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法。所用原料都可从商业途径获得。引物合成及测序工作均由奥科生物有限公司完成。

实施例1、检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法的建立

一、A985T多态性位点的确定

1、PCR扩增

选择矮小型褐壳蛋鸡纯系为实验材料。根据GenBank Accession NumberAJ431390设计引物，令扩增得到的目的片段包含GenBank Accession NumberAJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸，引物序列如下：

U(上游引物)：5’-CAGGGTGGTATCAAGCCTGT-3’(序列表中序列1)

D(下游引物)：5’-GATCCAAAGGACTGGACCAA-3’(序列表中序列2)

以矮小型褐壳蛋鸡纯系基因组DNA为模板，使用引物U和D进行PCR扩增。

扩增体系如下：

鸡基因组DNA               50ng

10×PCR扩增缓冲液         1.5μL

dNTPs(4mmol/L)混合液      0.8μL

上、下游引物(10pmol/L)    各0.3μL

Taq DNA聚合酶             0.5U

Mg²⁺                      2.5mmol/L(终浓度)

用ddH₂O补充反应体系至15μL

PCR反应条件为：95℃变性5min；循环程序为：95℃变性20s，68℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

2、RFLP分析

使用限制性内切酶BsrI，酶切步骤1中的PCR扩增产物。BsrI的酶切序列如下(其中的箭头所指位置为酶切位点，N表示任何碱基)：

5’-ACTGGN↓-3’

3’-TGAC↑CN-5’

酶切反应体系如下：

PCR反应混合物        8μl

10×酶切缓冲液       1.6μl

内切酶BsrI(10U/μl)  1μl

ddH₂O                13.4μl

总体积               24μl

恒温水浴65℃孵育1-3小时。

酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压8V/cm，时间30min)。使用凝胶成像系统观察，结果如图1所示。

由图可见，酶切产物呈现3种带型。部分样本显示两条电泳条带，序列长度分别为143bp、226bp；部分样本显示为一条电泳条带，序列长度为369bp；剩下的样本显示为三条电泳条带，序列长度分别为143bp、226bp及369bp，其中长度为143bp、226bp的两条电泳条带亮度之和为369bp长度电泳条带亮度。

3、克隆测序及序列分析

根据PCR-RFLP分析结果，分别将显示不同电泳条带的样本的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收纯化，回收的DNA片段连接载体pGEM-T(Promega公司)后，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，根据载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明不同样本的扩增片段长度均为369bp，只存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(A/T)，此脱氧核糖核苷酸为GenBankAccession Number AJ431390的自5′末端第1034位脱氧核糖核苷酸(即从起始密码子ATG开始第985位)，命名为A985T。

根据测序结果和PCR-RFLP结果，对基因型进行如下限定：

若该位点的等位基因为A，其纯合体基因型为AA，PCR-RFLP检测为两条电泳条带，序列长度分别为143bp、226bp；

若该位点的等位基因为T，其纯合体基因型为TT，PCR-RFLP检测为一条电泳条带，序列长度为369bp；

该位点杂合体基因型为AT，PCR-RFLP检测为三条电泳条带，序列长度分别为143bp、226bp及369bp，其中长度为143bp、226bp的两条电泳条带亮度之和为369bp长度电泳条带亮度。

4、鸡蛋鱼腥味突变等位基因检测试剂盒的制备

鸡蛋鱼腥味突变等位基因检测试剂盒包括：一对引物，其中一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2；限制性核酸内切酶BsrI；步骤1中PCR反应体系中的所有试剂和步骤2中酶切反应体系中的所有试剂。

二、鸡只基因型与产鱼腥味蛋性状的关联分析

用含有油菜籽(含三甲胺)的饲料饲喂丝羽乌骨鸡。

利用鸡蛋鱼腥味突变等位基因检测试剂盒进行检测。以待检测鸡只的基因组DNA为模板，按照步骤一中1进行PCR扩增，按照步骤一中2进行RFLP分析。检测鸡只产的蛋是否有鱼腥味，分析鸡只基因型与产鱼腥蛋性状的关联性。

鸡只基因型与产鱼腥蛋性状的关联如表1所示。在所检测的48只鸡中，AA基因型29只，AT基因型9只，TT基因型10只。所有AA基因型和AT基因型个体所产鸡蛋都不表现鱼腥味，所有TT基因型个体所产鸡蛋都表现出浓重的鱼腥味。

以上结果证明了A985T多态与鸡只产鱼腥蛋性状密切关联，可以作为鸡只产鱼腥蛋性状筛选的分子标记。

表1 FMO3基因A985T位点基因型与所产鱼腥味蛋性状的关联

实施例2、通过鸡蛋鱼腥味突变等位基因检测试剂盒检测不同品种鸡只携带鸡蛋鱼腥味突变等位基因的情况及基因型-鸡只产鱼腥味蛋性状关联验证分析

用含有油菜籽(含三甲胺)的饲料饲喂白来航蛋鸡、H褐蛋鸡、东乡绿壳蛋鸡。

利用鸡蛋鱼腥味突变等位基因检测试剂盒检测上述不同品种鸡只的A985T多态。鸡蛋鱼腥味突变等位基因检测试剂盒包括：一对引物，其中一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2；限制性核酸内切酶BsrI；该试剂盒还包括PCR-RFLP所需的常规试剂。以待检测鸡只的基因组DNA为模板，按照实施例1中步骤一的1进行PCR扩增，按照实施例1中步骤一的2进行RFLP分析。

分析三个品种鸡只A985T等位基因和基因型的分布情况。三个品种鸡只A985T等位基因和基因型的分布情况如表2所示。

表2 FMO3基因A985T等位基因和基因型在不同鸡种中的分布

 品种检测的只数等位基因频率     基因型频率   A  T  AA  AT TT白来航蛋鸡H褐蛋鸡东乡绿壳蛋鸡是否鱼腥味鸡蛋9679196   1.000  0.772  1.000   0.000  0.228  0.000   1.000  0.684  1.000  否  0.000  0.177  0.000  否 0.000 0.139 0.000 是

由表2可见，白来航蛋鸡不携带突变等位基因T，没有TT基因型，对鸡只所产蛋进行鱼腥味检测的结果表明该鸡种不产鱼腥味鸡蛋，这与其他研究报道一致(Bolton et al.1976)，说明检测结果可靠。东乡绿壳蛋鸡中同样不携带突变等位基因T，没有TT基因型，对鸡只所产蛋进行鱼腥味检测的结果表明该鸡种不产鱼腥味鸡蛋，说明绿壳鸡蛋不会有鱼腥味出现，鸡蛋风味较好。H褐蛋鸡中携带等位基因A频率为0.772、携带突变等位基因T频率为0.228，AA基因型的频率为0.684、AT基因型的频率为0.177、TT基因型的频率为0.139，对鸡只所产蛋进行鱼腥味检测的结果表明所有AA、AT基因型个体不产鱼腥味鸡蛋，所有TT基因型个体均产鱼腥味鸡蛋，说明饲喂含三甲胺的饲料，该鸡种中13.9％的鸡只(TT基因型)会生产鱼腥味鸡蛋，需要利用分子育种手段剔除突变等位基因T。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种检测鸡蛋鱼腥味突变等位基因的方法及其试剂盒

<130>CGGNARY81036

<160>2

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

cagggtggta tcaagcctgt     20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gatccaaagg actggaccaa     20