法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-06-14
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N 1/20 专利号:ZL2006800240009 申请日:20060707 授权公告日:20120215
专利权的终止
2012-02-15
授权
授权
2008-08-27
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-07-02
公开
公开
技术领域
本发明涉及包括来源于粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的L-肉碱生物 合成相关基因的肠杆菌科(Enterobacteriacae)的微生物，和使用所述微生物 生产L-肉碱的方法。
背景技术
L-肉碱(3-羟基-4-三甲基氨基丁酸)在生物体中普遍存在，并且是在线 粒体中将活化的长链脂肪酸经由线粒体内膜携带到线粒体基质中的两性 离子化合物。已知在人体中L-肉碱可以从赖氨酸或蛋白质赖氨酸合成。 在哺乳动物中，蛋白质赖氨酸通常用作L-肉碱生物合成的前体，然而， 在粗糙脉孢菌中，应用游离的赖氨酸。在L-肉碱的生物合成中，形成 ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N，N，N-三甲基-β-羟基赖氨酸，N，N，N-三甲基氨 基丁醛中间体，和γ-丁酰甜菜碱，并且γ-丁酰甜菜碱通过γ-丁酰甜菜碱羟 化酶羟基化而成为L-肉碱。图1是图解粗糙脉孢菌中假定的L-肉碱生物 合成途径的流程图。
L-肉碱可以通过化学合成法、应用酶反应的半合成法、和应用微生物 的方法生产。然而，当应用化学合成法时，存在问题，即获得DL-肉碱外 消旋混合物，由此必须分离DL-外消旋混合物。作为应用酶反应的半合成 法的一个实例，美国专利号4,221,869公开了使用应用NAD作为辅酶的 肉碱脱氢酶(EC 1.1.1.108)，由脱氢肉碱生产L-肉碱的方法。然而，脱氢肉 碱极其不稳定并自发分解为丙酮基三甲铵和二氧化碳。另外，德国专利号 DE-OS-3123975公开了由γ-丁酰甜菜碱生产L-肉碱的方法，该方法使用 从粗糙脉孢菌分离的γ-丁酰甜菜碱羟化酶(EC 1.14.11.1)。然而，存在一 个缺点，即在羟基化期间必须将α-酮戊二酸和还原物(即，抗坏血酸)加入 反应物中。
关于应用微生物生产L-肉碱的方法，例如，美国专利号5,028,538公 开了一种从将大肠杆菌(E.coli)044 K 74培养在含有巴豆酸甜菜碱 (4-N，N，N-三乙基氨基巴豆酸)的培养基之后获得的培养物而收集L-肉碱的 方法。另外，美国专利号4,708,936公开了通过将木糖氧化产碱菌 (Achromobacter xylosoxydans)DSM 3225(HK 1331b)培养在含有巴豆酸甜 菜碱和/或γ-丁酰甜菜碱的培养基中来生产L-肉碱的方法。然而，存在缺 点，即，应该使用L-肉碱生物合成的前体，诸如巴豆酸甜菜碱，或不是 中间体的化合物，并且L-肉碱的产率不高。因此，在应用微生物生产L- 肉碱的方法中仍然存在提高产率的需要。
本发明的发明人已经尝试生产应用廉价前体并且还具有高产率的L- 肉碱的微生物，并且发现来源于粗糙脉孢菌与L-肉碱的生物合成相关的 基因在肠杆菌科的微生物中充分表达，由此完成本发明。
附图描述
图1是图解粗糙脉孢菌中假定的L-肉碱生物合成途径的流程图。
图2是显示洗脱溶液的天然或SDS-PAGE分析的结果的图，所述洗脱 溶液通过裂解粗糙脉孢菌培养物并且对裂解的物质进行DEAE柱层析而 获得。
图3是显示在将图2的蛋白条带a、b和c与赖氨酸和S-腺苷甲硫氨 酸反应后通过HPLC检测三甲基赖氨酸的结果的图表。
图4是显示通过HPLC分析通过将条带a蛋白反应而获得的样品、以 及三甲基赖氨酸标准物的结果的图表。
图5是显示通过PCR扩增LMT基因的电泳结果的图。
图6图示pT7-7 LMT的产生过程。
图7是显示裂解的细菌的上清液SDS-PAGE分析结果的图，所述裂解 的细菌通过在IPTG存在下培养含有来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸 -6-N-赖氨酸-甲基转移酶的大肠杆菌并且将从中获得的细菌裂解而获得。
图8图示pT7-7 TMLH的产生过程。
图9图示pT7-7 TMLA的产生过程。
图10图示pT7-7TMABADH的产生过程。
图11图示pT7-7 BBH的产生过程。
图12是显示分别插入到pT7-7 TMLH、pT7-7 TMLA、 pT7-7TMABADH和pT7-7 BBH中的每一基因的电泳结果的照片。在图 12中，泳道1代表标记，泳道2代表pT7-7 TMLH，泳道3代表pT7-7 TMLA， 泳道4代表pT7-7TMABADH，并且泳道5代表pT7-7 BBH。
图13是显示粗提物的SDS-PAGE结果的照片，所述粗提物分别获自 用pT7-7 TMLH、pT7-7 TMLA、pT7-7TMABADH和pT7-7 BBH转化的 大肠杆菌BL21(DE3)的培养物。在图13中，泳道1代表标记，泳道2 代表阴性对照组，泳道3代表pT7-7TMLH(52kDa)，泳道4代表 pT7-7TMLA(53kDa)，泳道5代表pT7-7TMABADH(55kDa)和泳道6 代表pT7-7BBH(49kDa)。
图14图示pT7-7CarABE的产生过程。
图15图示pACYC184CarCD的产生过程。
发明详述
技术问题
本发明提供能够高效率生产L-肉碱的微生物。
本发明还提供应用所述微生物生产L-肉碱的方法。
技术方案
按照本发明的一个方面，提供一种属于肠杆菌科的微生物，所述微生 物包含：编码来源粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶 (LMT)活性的多核苷酸；编码3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶(TMLA)活 性的多核苷酸；编码N-三甲基赖氨酸羟化酶(TMLH)活性的多核苷酸；编 码γ-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)活性的多核苷酸；和编码γ-丁酰甜 菜碱羟化酶(BBH)活性的多核苷酸。
按照本发明的微生物可以是含有编码所述5种蛋白的多核苷酸的任 一种。优选地，所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)，并且更优选大 肠杆菌(保藏号：KCCM-10638)。
按照本发明独立编码5种蛋白，即，LMT、TMLH、TMLA、TMABADH 和BBH的多核苷酸可以通过载体或其本身用于微生物。当独立编码所述 5种蛋白的多核苷酸通过载体用于微生物时，可以将编码所述5种蛋白的 多核苷酸插入到单一载体中尔后应用，或者可以插入到至少一种载体中尔 后应用。在本发明中，术语“载体”是本领域的技术人员公知的。载体通 常是指用于将核酸引入细胞的核酸构建体。这一核酸构建体可以是衍生于 质粒或病毒基因组的核酸构建体。
按照本发明的一个实施方案编码来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨 酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶(LMT)的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的S- 腺苷甲硫氨酸赖氨酸甲基转移酶。认为S-腺苷甲硫氨酸赖氨酸甲基转移酶 在粗糙脉孢菌细胞中催化通过将甲基基团附着到赖氨酸上而将赖氨酸转 化成为6-N-三甲基赖氨酸的反应，但是本发明的范围不限于这一具体的作 用机制。编码S-腺苷甲硫氨酸赖氨酸甲基转移酶的多核苷酸优选地是编码 氨基酸序列SEQ ID NO：11的多核苷酸，并且更优选地是具有核苷酸序列 SEQ ID NO：16的多核苷酸。
按照本发明的一个实施方案编码来源于粗糙脉孢菌的N-三甲基赖氨 酸羟化酶(TMLH)的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的N-三甲基赖氨酸 羟化酶(TMLH)。认为N-三甲基赖氨酸羟化酶(TMLH)在粗糙脉孢菌细胞 中催化将N-三甲基赖氨酸转化成β-羟基-ε-N-三甲基赖氨酸的反应，但是 本发明的范围不限于这一具体的作用机制。编码N-三甲基赖氨酸羟化酶 (TMLH)的多核苷酸优选地是编码氨基酸序列SEQ ID NO：12的多核苷 酸，并且更优选的是具有核苷酸序列SEQ ID NO：17的多核苷酸。
按照本发明的一个实施方案编码来源于粗糙脉孢菌的3-羟基-6-N-三 甲基赖氨酸醛缩酶(TMLA)的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的3-羟基 -6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶(TMLA)。认为3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶 (TMLA)在粗糙脉孢菌细胞中催化将β-羟基-ε-N-三甲基赖氨酸转化成γ-N- 三甲基氨基丁醛的反应，但是本发明的范围不限于这一具体的作用机制。 编码3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶(TMLA)的多核苷酸优选地是编码 氨基酸序列SEQ ID NO：13的多核苷酸，并且更优选的是具有核苷酸序列 SEQ ID NO：18的多核苷酸。
按照本发明的一个实施方案编码来源于粗糙脉孢菌的γ-三甲基氨基 醛脱氢酶(TMABADH)活性的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的γ-三甲基 氨基醛脱氢酶(TMABADH)活性。认为γ-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH) 在粗糙脉孢菌细胞中催化将γ-N-三甲基氨基丁醛转化成γ-丁酰甜菜碱的 反应，但是本发明的范围不限于这一具体的作用机制。编码γ-三甲基氨基 醛脱氢酶(TMABADH)的多核苷酸优选地是编码氨基酸序列SEQ ID NO： 14的多核苷酸，并且更优选的是具有核苷酸序列SEQ ID NO：19的多核 苷酸。
按照本发明的一个实施方案编码来源于粗糙脉孢菌的γ-丁酰甜菜碱 羟化酶(BBH)活性的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的γ-丁酰甜菜碱羟化 酶(BBH)。认为γ-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)在粗糙脉孢菌细胞中催化将γ- 丁酰甜菜碱转化成L-肉碱的反应，但是本发明的范围不限于这一具体的 作用机制。编码γ-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)的多核苷酸优选地是编码氨基 酸序列SEQ ID NO：15的多核苷酸，并且更优选地是具有核苷酸序列SEQ ID NO：20的多核苷酸。
按照本发明的另一个方面，提供生产L-肉碱的方法，所述方法包括： 在底物存在下，培养按照本发明的微生物，以在培养物中生产L-肉碱， 所述底物选自由下列各项组成的组：L-赖氨酸，N-三甲基赖氨酸，β-羟基 -N-三甲基赖氨酸，γ-N-三甲基氨基丁醛，γ-丁酰甜菜碱，及其混合物。
在按照本发明生产L-肉碱的方法中，选自由L-赖氨酸、N-三甲基赖 氨酸、β-羟基-N-三甲基赖氨酸、γ-N-三甲基氨基丁醛、γ-丁酰甜菜碱及其 混合物组成的组的底物的浓度优选地为基于培养基重量的0.1-10重量％， 但是本发明并不特别限于这一范围。
在按照本发明的方法中，从培养物收集L-肉碱的方法是本领域的技术 人员公知的。这样的方法的实例包括，但不限于，超滤、离心分离、和在 将细胞从培养物分离后得到的产物重结晶而收集L-肉碱的方法诸如倾析 法，并且对于从中获得的上清液进行阳离子交换层析或电渗析。
有利效果
按照本发明的微生物具有生产L-肉碱的良好能力，以致它可以有效用 于通过发酵生产L-肉碱的方法。
在按照本发明生产L-肉碱的方法中，使用属于肠杆菌科的微生物可以 高效地生产L-肉碱。
最佳方式
以下，将参考下列实施例更具体地描述本发明。这些实施例仅是为了 举例说明目的并不是意图限制本发明的范围。
实施例
产生编码在粗糙脉孢菌中与由L-赖氨酸生物合成L-肉碱相关的5种 蛋白的多核苷酸，以及包含其的核酸构建体。接着，用所述核酸构建体转 化大肠杆菌，并且将转化的大肠杆菌在含有通过L-肉碱生产途径获得的 中间产物的培养基中培养，以生产L-肉碱并且收集L-肉碱。
实施例1：分离编码来源于粗糙脉孢菌的LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的多核苷酸
分离并且克隆来源于粗糙脉孢菌的编码LMT、TMLH、TMLA、 TMABADH和BBH的多核苷酸，并且分析其碱基序列。
(1)制备粗糙脉孢菌的cDNA文库
从包含粗糙脉孢菌真菌体(包括孢子体)的培养物分离总mRNA，并 且使用poly T作为引物进行反转录，然后进行PCR扩增cDNA。将扩增 的cDNA用EcoR I和Xho I消化，然后将消化的cDNA插入到λAD5克隆 载体的EcoR I和Xho I位点，以制备来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库。
接着，将所述cDNA文库感染大肠杆菌BNN322，然后培养并且扩增 感染的大肠杆菌BNN322。首先，将大肠杆菌BNN322在含有50μg/ml 卡那霉素和0.2％麦芽糖的LB培养基中培养过夜。然后，对于从其获得 的培养物进行离心分离，然后去除得到的产物的上清液，并且之后将细胞 沉淀重悬在1ml 10mM MgSO4溶液中。将从得到的产物获得的混悬液与 5×107PFU的λcDNA文库在30℃不振荡地温育30分钟，向培养物中另 外加入2ml LB培养基，并且接着将得到的培养物在30℃在振荡培养箱中 振荡1个小时。将培养的细胞划线到含有氨苄青霉素(75μg/ml)的LB 培养平板上，并且在37℃培养8小时。使用Wizard试剂盒从平板的菌落 分离cDNA文库集合(cDNA library pool)。将包含分离的cDNA文库集 合的λ用作模板，以扩增编码LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH 的多核苷酸。
(2)扩增并且克隆编码LMT的多核苷酸(LMT基因)并且证实LMT生产
(a)从粗糙脉孢菌分离LMT基因并且证实所述基因的功能性表达
培养粗糙脉孢菌并且收集细胞。然后，使用含有2mM DTT和0.2mM EDTA的1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液将细胞裂解，然后提取蛋白。将硫酸 铵缓慢加入到所获得的上清液中，达到50％终饱和浓度而将蛋白沉淀下 来，然后向通过离心沉淀的蛋白加入少量0.1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液。 将得到的溶液使用T1透析膜进行脱盐，并且将脱盐的样品使用DEAE柱 纯化。在此时，使用0.1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液作为洗涤缓冲液和包含 0.3M NaCl的0.1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液作为洗脱缓冲液而进行合并 (pooling)。此后，将合并的样品使用T1透析膜脱盐。脱盐样品使用CM 柱纯化。将0.1M pH 7.4的磷酸钾缓冲液用作所述柱的洗涤缓冲液，并且 将没有吸附到柱上并且从柱上流出的样品都合并起来。
将蛋白样品再次加载到DEAE柱上，然后使用0.1M pH 7.4的磷酸钾 缓冲液，进行密度梯度洗脱，达到0-0.3M的NACl浓度。使用天然-PAGE 和SDS-PAGE对纯化的样品进行蛋白质分析。
图2是显示洗脱溶液的天然-PAGE或SDS-PAGE分析的结果的图， 所述洗脱的溶液在将粗糙脉孢菌培养物裂解并且对所裂解的物质进行 DEAE柱层析之后获得。在图2中，泳道1代表标记，泳道2和3代表 DEAE洗脱峰2的天然-PAGE分析的结果，并且泳道4和5代表DEAE 洗脱峰3的天然-PAGE分析的结果。在图2B中，泳道1代表标记，泳道 2代表DEAE洗脱峰2的天然-PAGE分析的结果，泳道3代表DEAE洗 脱峰3的天然-PAGE分析的结果，泳道4和5代表DEAE洗脱峰2的 SDS-PAGE分析的结果，并且泳道6和7代表DEAE洗脱峰3的SDS-PAGE 分析的结果。
从图2的结果，将条带a、b和c选作LMT候选蛋白，并且测量每一 蛋白的活性。首先，将与每一条带对应的凝胶切下，然后用匀浆器将凝胶 压碎。然后，向其中加入5ml 1g/L赖氨酸(终浓度500mg/L)和2ml 1g/L 甲基供体，S-腺苷甲硫氨酸(终浓度200mg/L)，并且将得到的产物在28 ℃缓慢搅拌24小时进行反应，然后使用HPLC分析三甲基赖氨酸峰。
图3是显示在蛋白条带a、b和c与赖氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反应后 通过HPLC测量三甲基赖氨酸的结果的图表。如在图3中所示，在与条带 a反应的样品中，在大约15分钟的停留时间证实为被视为三甲基赖氨酸 的峰。在图3中，1、2和3代表与每一条带a、b和c相对应的结果。为 了准确地证实所述条带，将通过与条带a的反应获得的样品与三甲基赖氨 酸标准物进行比较。
图4是显示通过HPLC分析通过与蛋白条带a反应获得的样品和三甲 基赖氨酸标准物的结果的图表。如在图4中所示，条带a的峰时，即，电 压具有最高值的时间，与标准三甲基赖氨酸样品完全一致。因此，证实条 带a包括S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶，LMT。在图4中，1 和2是指分别与标准物和条带a相对应的结果。图2和3的每一图表是独 立的HPLC图表整合在其中的图表。
接下来，分析N-端序列，以获得LMT蛋白的氨基酸序列。首先，将 在SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，然后将蛋白条带切下， 以通过Edman方法分析N-端序列。特别地，异硫氰酸苯酯(PTC)与肽在 pH值8-9和室温反应，因此获得其中N-端被硫代氨甲酰化的PTC-肽。然 后，将PTC-肽在酸性条件下反应，以从中仅分离的N-端氨基酸。分离的 氨基酸用乙酸乙酯提取，用HPLC鉴定，并且分析。结果，证实N-端序 列为AFGKL(SEQ ID NO：21)。与此相似，基于所证实的N-端氨基酸序 列进行关于已知的粗糙脉孢菌的完整的基因组序列的探寻。结果，证实具 有与LMT的N-端序列一致的氨基酸序列的蛋白和基因、以及核苷酸序列。
(b)携带LMT基因的表达载体和微生物生产
收集培养的粗糙脉孢菌，并且使用液氮裂解，然后使用RNA纯化试 剂盒纯化RNA。应用关于在(a)中证实的LMT的氨基酸和碱基序列的信息 而生产SEQ ID NOS：1和2的引物，然后，使用在(1)中产生的cDNA 文库，通过使用所述引物对作为引物的PCR而扩增S-腺苷甲硫氨酸-6-N- 赖氨酸-甲基转移酶基因(图5)。图5是显示通过PCR扩增的LMT基因 的电泳结果的图。
将获得的PCR产物和pT7-7载体分别用Nde I和BamH I消化，并且 使用T4 DNA连接酶彼此连接，以产生pT7-7 LMT载体(图6)。图6图示 pT7-7 LMT的产生过程。应用电穿孔用pT7-7 LMT载体转化大肠杆菌 BL21 DE3。将40μl的大肠杆菌BL21 DE3和1μl的pT7-7 LMT载体混 和，置于具有2mm缝隙的冰冷的小杯中，并且在2.5kV，200Ω，和25μF 的条件下通过电穿孔进行转化。将获得的转化体划线到含有氨苄青霉素的 固体平板培养基上，然后将质粒从在其中所选的转化体纯化，并且用Nde I和BamH I消化。结果，通过证实插入的基因和质粒的大小，而证实 pT7-7LMT引入到质粒中；这叫作BL21(DE3)/pT7-7LMT。
(c)在大肠杆菌中表达S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶并且从赖氨酸产生三甲基赖氨酸
将BL21(DE3)/pT7-7LMT在LB培养基中培养至OD600 0.5，然后在向 其中加入1mM IPTG后再培养4小时。对培养物进行离心，并且收集细 胞并使用超声波裂解。通过对细胞裂解物进行SDS-PAGE，证实约25kD 的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶(图7)。图7是显示上清液的 SDS-PAGE分析结果的图，其中所述上清液通过在IPTG存在下培养含有 来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶的大肠杆菌 并且将从中获得的微生物裂解而获得。在图7中，泳道M是指标记，泳 道1是指阴性对照组，泳道2和3是指细胞裂解物，并且泳道2和3中的 环形部分是指在25 kD位置与LMT相对应的条带。
将大肠杆菌BL21(DE3)/pT7-7LMT在其中置有含有50ml氨苄青霉素 的LB培养基的装有挡板的250ml烧瓶中培养至OD600 0.6，然后在向其 中加入1mM IPTG后，在28℃再培养超过8小时，以形成酶的正确的三 级结构，并且防止内含体的形成。在培养过程中，加入500mg/L的L-赖 氨酸和200mg/L的S-腺苷甲硫氨酸作为反应溶液，并且测量培养溶液中 的三甲基赖氨酸含量。结果在表1中显示。
在下述条件下通过HPLC测量三甲基赖氨酸。来源于Supelco的 SUPELCOSIL LC-DABS用作柱。A缓冲液这样制备，以致将0.1％的三 氟乙酸(TFA)加入到其中蒸馏水和乙腈以2∶8比例混和的缓冲液中，并且 B缓冲液这样制备，以致将0.1％的TFA加入到其中蒸馏水和乙腈以2∶8 的比例混和的缓冲液中。使用线性浓度梯度方法，保持0.8ml/min的流速， 分析三甲基赖氨酸。
表1.
如在表1中所示，证实来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖 氨酸-甲基转移酶的基因在大肠杆菌中表达，并且从中将L-赖氨酸转化成 三甲基赖氨酸。
(3)扩增并且克隆编码TMLH的多核苷酸(TMLH基因)，并且证实TMLH的产生
(a)扩增并且克隆编码TMLH的多核苷酸(TMLH基因)
使用包含(1)的cDNA文库集合的λ作为模板，并且使用SEQ ID NOS： 3和4作为引物进行PCR。然后，对于获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳。结果，证实约1.4kb的需要产物。SEQ ID NOS：3和4的引物包括 假定编码来源于粗糙脉孢菌的TMLH的起始密码子和终止密码子的序列。 通过在从粗糙脉孢菌基因组表达的全蛋白的氨基酸序列和来源于人和大 鼠的已知的TMLH的氨基酸序列之间进行同源性搜索而搜索来源于粗糙 脉孢菌的潜在的TMLH，从潜在的TMLH的氨基酸序列设计SEQ ID NOS： 3和4的引物。
将PCR产物用EcoRI和SalI消化，并且与用相同的酶消化的pBS KS+(Stratagene Inc.)连接，然后将大肠杆菌DH5α用其中插入所获得的PCR 产物的pBS KS+(TMLH)转化。将转化的大肠杆菌DH5α在37℃培养8小 时，然后分离pBS KS+(TMLH)，并且用EcoRI和SalI消化，以确定PCR 产物是否正确插入。接着，将分离的pBS KS+(TMLH)用NdeI和SalI消 化，然后在琼脂糖凝胶电泳之后将NdeI和SalI片段分离。将所述片段与 用相同的酶消化的表达载体pT7-7连接，以获得pT7-7 TMLH(参见图8)。 将pT7-7(TMLH)转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。
(b)证实TMLH产生
将用获得的pT7-7(TMLH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃在 其中置有含有100μg/ml氨苄青霉素的50ml LB培养基的装有挡板的250 ml烧瓶中培养至OD600 0.6，并且在向其中加入1mM IPTG之后继续培养 4个小时。将pT7-7(TMLH)从培养物分离，并且用NdeI和SalI消化， 然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果在图12中显示。如在图12中所示，证实 与NdeI和SalI片段相对应的条带(泳道2)。接着，分离pT7-7(TMLH)， 并且分析TMLH的核苷酸序列。结果，TMLH的核苷酸序列证实是与在 NCBI的粗糙脉孢菌基因组数据库中保存的序列相同的序列(SEQ ID NO： 17)。
另外，在用pT7-7(TMLH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)的培养物中 证实表达的TMLH蛋白。首先，在4,000xg离心15分钟对培养物进行离 心分离，并且收集细胞沉淀。向获得的细胞沉淀中加入1ml的裂解缓冲 液(140mM NaCl，200g/l甘油和1mM DTT，在10mM pH 7.4的磷酸钠缓冲 溶液中)并且重悬。将细胞混悬液置于冰浴中，并且通过传送超声波5次 每次10秒而将细胞使用超声破碎器裂解。对细胞裂解物进行离心分离， 在4℃，10,000g离心20-30分钟，然后去除细胞碎片，并且收集上清液 以获得细胞粗提物。通过收集来源于获得的细胞粗提物的样品而进行8％ SDS-PAGE(参见图13，泳道2)。作为进行SDS-PAGE的结果，证实与 TMLH相对应的约52kDa的条带。
(3)扩增并且克隆编码3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶(TMLA)的多核苷酸并且证实TMLA的产生
(a)扩增并且克隆编码3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶(TMLA)的多核苷酸
使用包含(1)的cDNA文库集合的λ作为模板，并且使用SEQ ID NOS： 5和6作为引物进行PCR。然后，对于获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳。结果，证实约1.4kb的需要产物。SEQ ID NOS：5和6的引物包括 编码来源于粗糙脉孢菌的TMLA的起始密码子和终止密码子的序列。通 过在从粗糙脉孢菌基因组表达的全蛋白的氨基酸序列和来源于人和大鼠 的已知的TMLA的氨基酸序列之间进行同源性搜索而搜索来源于粗糙脉 孢菌的潜在的TMLA，从潜在的TMLA的氨基酸序列设计引物SEQ ID NOS：5和6。
将PCR产物用EcoRI和SalI消化，并且与用相同的酶消化的pBS KS+(Stratagene Inc.)连接，然后将大肠杆菌DH5α用其中插入所获得的PCR 产物的pBS KS+(TMLA)转化。将转化的大肠杆菌DH5α在37℃培养8小 时，然后从中分离pBS KS+(TMLA)，并且用EcoRI和SalI消化，以确定 PCR产物是否正确插入。接着，将分离的pBS KS+(TMLA)用NdeI和SalI 消化，然后在琼脂糖凝胶电泳之后将NdeI和SalI片段分离。将所述片段 与用相同的酶消化的表达载体pT7-7连接，以获得pT7-7(TMLA)(参见图 9)。将大肠杆菌BL21(DE3)用pT7-7(TMLA)转化。
(b)证实TMLA产生
将用获得的pT7-7(TMLA)转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃在 其中置有含有100μg/ml氨苄青霉素的50ml LB培养基的装有挡板的250 ml烧瓶中培养至OD600 0.6，并且在向其中加入1mM IPTG之后继续培养 4个小时。将pT7-7(TMLA)从培养物分离，并且用NdeI和SalI消化， 然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果在图12中显示。如在图12中所示，证实 与NdeI和SalI片段相对应的条带(泳道3)。接着，分离pT7-7(TMLA)， 并且分析TMLA的核苷酸序列。结果，TMLA的核苷酸序列证实是与在 NCBI的粗糙脉孢菌基因组数据库中保存的序列相同的序列(SEQ ID NO： 18)。
另外，在用pT7-7(TMLA)转化的大肠杆菌BL21(DE3)的培养物中 证实表达的TMLA蛋白。首先，在4,000xg离心15分钟对培养物进行离 心分离，并且收集细胞沉淀。向获得的细胞沉淀中加入1ml的裂解缓冲 液(140mM NaCl，200g/l甘油和1mM DTT，在10mM pH 7.4的磷酸钠缓冲 溶液中)并且重悬。将细胞混悬液置于冰浴中，并且通过传送超声波5次 每次10秒而将细胞使用超声破碎器裂解。对细胞裂解物进行离心分离， 在4℃，10,000g离心20-30分钟，然后去除细胞碎片，并且收集上清液 以获得细胞粗提物。通过收集来源于获得的细胞粗提物的样品而进行8％ SDS-PAGE(参见图13，泳道3)。作为进行SDS-PAGE的结果，证实与 TMLA相对应的约53kDa的条带。
(4)扩增并且克隆编码γ-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)的多核苷酸并且证实TMABADH的产生
(a)扩增并且克隆编码γ-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)的多核苷酸
使用包含(1)的cDNA文库集合的λ作为模板，并且使用SEQ ID NOS： 7和8作为引物进行PCR。然后，对于获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳。结果，证实约1.5kb的需要产物。SEQ ID NOS：7和8的引物包括 编码来源于粗糙脉孢菌的TMABDH的起始密码子和终止密码子的序列。 通过在从粗糙脉孢菌基因组表达的全蛋白的氨基酸序列和来源于人和大 鼠的已知的TMABADH的氨基酸序列之间进行同源性搜索而搜索来源于 粗糙脉孢菌的潜在的TMABADH，并且从潜在的TMABADH的氨基酸序 列设计引物SEQ ID NOS：7和8。将PCR产物用EcoRI和SalI消化，并 且与用相同的酶消化的pBS KS+(Stratagene Inc.)连接，然后将大肠杆菌 DH5α用其中插入所获得的PCR产物的pBS KS+(TMABADH)转化。将转 化的大肠杆菌DH5α在37℃培养8小时，然后从中分离pBS KS+(TMABADH)，并且用EcoRI和SalI消化，以确定PCR产物是否正确插 入。接着，将分离的pBS KS+(TMABADH)用NdeI和SalI消化，然后在 琼脂糖凝胶电泳之后将NdeI和SalI片段分离。将所述片段与用相同的酶 消化的表达载体pT7-7连接，以获得pT7-7(TMABADH)(参见图10)。将 大肠杆菌BL21(DE3)用pT7-7(TMABADH)转化。
(b)证实TMABADH产生
将用获得的pT7-7(TMABADH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)在 37℃在其中置有含有氨苄青霉素的50ml LB培养基的装有挡板的250ml 烧瓶中培养至OD600 0.6，并且在向其中加入1mM IPTG之后继续培养4 个小时。将pT7-7(TMABADH)从培养物分离，并且用NdeI和SalI消 化，然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果在图12中显示。如在图12中所示， 证实与NdeI和SalI片段相对应的条带(泳道4)。接着，分离pT7-7 (TMABADH)，并且分析TMLH的核苷酸序列。结果，TMABADH的 核苷酸序列证实是与在NCBI的粗糙脉孢菌基因组数据库中保存的序列相 同的序列(SEQ ID NO：19)。
另外，在用pT7-7(TMABADH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)的培养 物中证实表达的TMABADH蛋白。首先，对培养物进行离心分离，在 4,000xg离心15分钟，并且收集细胞沉淀。向获得的细胞沉淀中加入1ml 的裂解缓冲液(140mM NaCl，200g/l甘油和1mM DTT，在10mM pH 7.4的 磷酸钠缓冲溶液中)并且重悬。将细胞混悬液置于冰浴中，并且通过传送 超声波5次每次10秒而将细胞使用超声破碎器裂解。对细胞裂解物进行 离心分离，在4℃，10,000g离心20-30分钟，然后去除细胞碎片，并且 收集上清液以获得细胞粗提物。通过收集来源于获得的细胞粗提物的样品 而进行8％SDS-PAGE(参见图13)。作为进行SDS-PAGE的结果，证实 与TMABADH相对应的约55kD的条带。
(5)扩增并且克隆编码γ-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)的多核苷酸并且证实BBH的产生
(a)扩增并且克隆编码γ-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)的多核苷酸
使用包含(1)的cDNA文库集合的λ作为模板，并且使用SEQ ID NOS： 9和10作为引物进行PCR。然后，对于获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳。结果，证实约1.3kb的需要产物。SEQ ID NOS：9和10的引物包 括假定编码来源于粗糙脉孢菌的BBH的起始密码子和终止密码子的序 列。通过在从粗糙脉孢菌基因组表达的全蛋白的氨基酸序列和来源于人和 大鼠的已知的BBH的氨基酸序列之间进行同源性搜索而搜索来源于粗糙 脉孢菌的潜在的BBH，并且从潜在的BBH的氨基酸序列设计引物SEQ ID NOS：9和10。
将PCR产物用EcoRI和SalI消化，并且与用相同的酶消化的pUC19 连接，然后将大肠杆菌DH5α用其中插入所获得的PCR产物的pUC19 (BBH)转化。将转化的大肠杆菌DH5α在包含100μg/ml氨苄青霉素的LB 培养基中在37℃培养8小时，然后从中分离pUC19(BBH)，并且用EcoRI 和SalI消化，以确定PCR产物是否正确插入。接着，将分离的pUC 19(BBH) 用NdeI和SalI消化，然后在琼脂糖凝胶电泳之后将NdeI和SalI片段分 离。将所述片段与用相同的酶消化的表达载体pT7-7连接，以获得 pT7-7(BBH)(参见图11)。将大肠杆菌BL21(DE3)用pT7-7(BBH)转 化。
将用获得的pT7-7(BBH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃在 其中置有含有100μg/ml氨苄青霉素的50ml LB培养基的装有挡板的250 ml烧瓶中培养至OD600 0.6，并且在向其中加入1mM IPTG之后继续培养 4个小时。将pT7-7(BBH)从培养物分离，并且用NdeI和SalI消化，然 后进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。结果在图12中显示。如在图12中所示， 证实与NdeI和SalI片段相对应的条带(泳道5)。接着，分离pT7-7(BBH)， 并且分析BBH的核苷酸序列。结果，BBH的核苷酸序列证实是与在NCBI 的粗糙脉孢菌基因组数据库中保存的序列相同的序列(SEQ ID NO：20)。
(b)证实BBH蛋白的产生
在用pT7-7(BBH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)的培养物中证实表达 的BBH蛋白。首先，在4,000xg离心15分钟，对培养物进行离心分离， 并且收集细胞沉淀。向获得的细胞沉淀中加入1ml的裂解缓冲液(140mM NaCl，200g/l甘油和1mM DTT，在10mM pH 7.4的磷酸钠缓冲溶液中)并 且重悬。将细胞混悬液置于冰浴中，并且通过传送超声波5次每次10秒 而将细胞使用超声破碎器裂解。对细胞裂解物进行离心分离，在4℃， 10,000g离心20-30分钟，然后去除细胞碎片，并且收集上清液以获得细 胞粗提物。通过收集来源于获得的细胞粗提物的样品而进行8％ SDS-PAGE(参见图13，泳道5)。作为进行SDS-PAGE的结果，证实与 BBH相对应的约49kDa的条带。
实施例2：产生包含所有的LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH基因的宿主细胞
扩增来源于在实施例1中产生的粗糙脉孢菌cDNA文库的LMT、 TMLH和BBH基因，并且产生具有所有这三种基因的pT7-7 ABE。另外， 产生来自实施例1中产生的粗糙脉孢菌cDNA文库的TMLA和 TMABADH基因，并且产生具有所有这两种基因的pACYC184-CarCD。 将所产生的pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD用于大肠杆菌，以产生 具有所有的LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH基因的转化的微 生物。将所转化的微生物叫做大肠杆菌BL21(DE3)CJ2004-2，并且于2004 年12月13日保藏在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)，一个国际保藏机构(保藏号KCCM-10638)。
(1)产生具有所有三种基因LMT、TMLH和BBH的pT7-7-CarABE
首先，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板，并且使用SEQ ID NOS：1和2的寡核苷酸作为引物，从T7启动子扩增包含终止密码子 的1mt。接着，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板，并且使用 SEQ ID NOS：3和4的寡核苷酸作为引物，从T7启动子扩增包含终止密 码子的TMLH。然后，使用寡核苷酸SEQ ID NOS：9和10作为引物，从 T7启动子扩增包含终止密码子的BBH。将LMT、TMLH和BBH的扩增 产物引入到pT7-7中。首先，将BBH的扩增产物用限制性酶诸如BamHI 和SalI消化，并且从中获得BamHI和SalI片段，然后，将所述片段与用 相同的酶消化的pT7-7连接，以获得pT7-7 BBH。接着，将TMLH的扩 增产物用NdeI和EcoRI消化，并且从中获得NdeI和EcoRI片段，然后， 将所述片段与用相同的酶消化的pT7-7 BBH连接，以获得pT7-7 CarBE。 然后，将LMT的扩增产物用ClaI消化，并且从中获得ClaI片段，然后， 将所述片段与用相同的酶消化的1mt连接，以获得pT7-7 CarABE(参见图 14)。
(2)产生具有所有基因TMLA和TMABADH的pACYC184 CarCD
首先，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板，并且使用SEQ ID NOS：5和6的寡核苷酸作为引物，从T7启动子扩增包含终止密码子 的TMLA。接着，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板，并且 使用SEQ ID NOS：7和8的寡核苷酸作为引物，从T7启动子扩增包含终 止密码子的TMABADH。将TMLA和TMABADH的扩增产物引入到 pACYC184中。首先，将TMLA的扩增产物用BamHI和HindIII消化， 并且从中获得BamHI和HindIII片段，然后，将所述片段与用相同的酶消 化的pACYC184连接，以获得pACYC184 TMLA。接着，将TMABADH 的扩增产物用BamHI和SalI消化，并且从中获得BamHI和SalI片段，然 后，将所述片段与用相同的酶消化的pACYC184 TMLA连接，以获得 pACYC184 CarCD。
实施例3：使用包含编码LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的多核苷酸的微生物生产L-肉碱
将其中引入在实施例2中产生的pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD 二者的大肠杆菌BL21(DE3)在含有L-赖氨酸的培养基中培养，并且测量 L-肉碱的产量。pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD引入大肠杆菌 BL21(DE3)应用如实施例1所述的电穿孔进行。
(1)通过培养用在实施例2中产生的pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD二者转化的大肠杆菌BL21(DE3)而生产L-肉碱
首先，将用pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD二者转化的大肠杆菌 BL21(DE3)接种在含有氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)的 LB固体平板培养基中，并且进行培养。将在固体平板培养基上的微生物 菌落在含有20ml LB培养基的烧瓶中在37℃培养12小时至OD600 1.0， 其中所述LB培养基中加入氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)。 将0.1ml所培养的微生物的培养物接种到装有挡板的250ml烧瓶中，其 中含有具有2mM L-赖氨酸的20ml LB培养基，并且接着在37℃培养至 OD600 0.6。当加入IPTG时，在OD600值达到0.6后加入1mM IPTG，然 后将微生物继续培养4个小时。将在无L-赖氨酸的LB培养基中培养所述 微生物应用上文所述的相同方法用IPTG诱导的组，和在含有L-赖氨酸的 LB培养基中培养所述微生物不用IPTG诱导的组，用作对照组。在培养 终止后，使用如(1)中相同的方法确定培养物的L-肉碱含量。结果在表 2中显示。
表2.通过单一培养物生产L-肉碱
如表2所示，通过在含有L-赖氨酸的培养基中培养含有编码LMT、 TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的所有多核苷酸的微生物，能够以 高效率生产L-肉碱。另外，在表2中表示的L-肉碱产量之间相互比较， 并且证实当在含有赖氨酸的培养基中培养时L-肉碱具有更高的产率。
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示
(PCT细则13bis)
PCR/RO/134表(1998年7月)
序列表
<110>CJ株式会社
<120>携带与L-肉碱生物合成相关基因的肠杆菌科属微生物和使用该微生物生产L-肉碱的方法
<130>PN060068
<160>21
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
ggaattccat atggccttcg gaaagcttta cac 33
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
cgggatcctt agacgttggt caacttgggg 30
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
atgaattcca tatgagaccg caagtggtag gg 32
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
atgaattctc attttccgct ggtttctttc cg 32
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
atggatccta atacgactca ctataggga 29
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
attaagcttt tagagaccgg catcgtatct 30
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
atggatccta atacgactca ctataggga 29
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
attgtcgact catgccgcca ggtttacatg gat 33
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
atggatccta atacgactca ctataggga 29
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
attagtcgac tcaataccct cccccaccctg 31
<210>11
<211>216
<212>PRT
<213>粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)
<400>11
Met Ala Phe Gly Lys Leu Tyr Thr Tyr Glu Ala Asn Pro Arg Ser Thr
1 5 10 15
Ala Ile Leu Ala Val Ala Lys Ala Asn Asn Leu Asp Leu Glu Val Ile
20 25 30
Lys Val Asp Leu Glu Ala Ala Ile Glu Glu Tyr Lys Lys Val Asn Pro
35 40 45
Leu Gly Lys Val Pro Thr Phe Val Gly Ala Asp Gly Tyr Thr Leu Phe
50 55 60
Glu Cys Ile Ala Ile Ala Ile Tyr Val Ala Ser Gln Asn Glu Lys Thr
65 70 75 80
Thr Leu Leu Gly Lys Thr Lys Gln Asp Tyr Ala Ser Ile Leu Lys Trp
85 90 95
Leu Ser Phe Phe Asn Thr Glu Val Leu Pro Pro Leu Ala Gly Trp Tyr
100 105 110
Arg Pro Leu Leu Gly Lys Ala Pro Tyr Asn Lys Lys Ala Val Glu Asp
115 120 125
Ala Gln Ala Thr Ala Leu Lys Ala Ile Ser Val Ala Glu Ala His Leu
130 135 140
Lys Asn Asn Thr Phe Pro Val Gly Glu Arg Ile Thr Leu Ala Asp Leu
145 150 155 160
Phe Ala Thr Gly Ile Ile Ala Arg Gly Phe Glu Phe Phe Phe Asp Lys
165 170 175
Ala Trp Arg Glu Gln Tyr Pro Asn Val Thr Arg Trp Tyr Thr Thr Val
180 185 190
Tyr Asn Gln Pro Ile Tyr Ser Ala Val Ala Pro Pro Phe Ala Leu Leu
195 200 205
Asp Thr Pro Lys Leu Thr Asn Val
210 215
<210>12
<211>471
<212>PRT
<213>粗糙脉孢菌
<400>12
Met Arg Pro Gln Val Val Gly Ala Ile Leu Arg Ser Arg Ala Val Val
1 5 10 15
Ser Arg Gln Pro Leu Ser Arg Thr His Ile Phe Ala Ala Val Thr Val
20 25 30
Ala Lys Ser Ser Ser Pro Ala Gln Asn Ser Arg Arg Thr Phe Ser Ser
35 40 45
Ser Phe Arg Arg Leu Tyr Glu Pro Lys Ala Glu Ile Thr Ala Glu Gly
50 55 60
Leu Glu Leu Ser Pro Pro Gln Ala Val Thr Gly Gly Lys Arg Thr Val
65 70 75 80
Leu Pro Asn Phe Trp Leu Arg Asp Asn Cys Arg Cys Thr Lys Cys Val
85 90 95
Asn Gln Asp Thr Leu Gln Arg Asn Phe Asn Thr Phe Ala Ile Pro Ser
100 105 110
Asp Ile His Pro Thr Lys Val Glu Ala Thr Lys Glu Asn Val Thr Val
115 120 125
Gln Trp Ser Asp Asn His Thr Ser Thr Tyr Pro Trp Pro Phe Leu Ser
130 135 140
Phe Tyr Leu Thr Ser Asn Ala Arg Gly His Glu Asn Asp Gln Ile Ser
145 150 155 160
Leu Trp Gly Ser Glu Ala Gly Ser Arg Pro Pro Thr Val Pro Phe Pro
165 170 175
Arg Val Met Ala Ser Asp Gln Gly Val Ala Asp Leu Thr Ala Met Ile
180 185 190
Lys Glu Phe Gly Phe Cys Phe Val Lys Asp Thr Pro His Asp Asp Pro
195 200 205
Asp Val Thr Arg Gln Leu Leu Glu Arg Ile Ala Phe Ile Arg Val Thr
210 215 220
His Tyr Gly Gly Phe Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Leu Ala Met Ala Asp
225 230 235 240
Thr Ala Tyr Thr Asn Leu Ala Leu Pro Ala His Thr Asp Thr Thr Tyr
245 250 255
Phe Thr Asp Pro Ala Gly Leu Gln Ala Phe His Leu Leu Glu His Lys
260 265 270
Ala Ala Pro Ser Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
275 280 285
Ser Glu Glu Lys Glu Ala Ala Gly Ser Ala Ala Gly Glu Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Glu Gly Gly Lys Ser Leu Leu Val Asp Gly Phe Asn Ala Ala
305 310 315 320
Arg Ile Leu Lys Glu Glu Asp Pro Arg Ala Tyr Glu Ile Leu Ser Ser
325 330 335
Val Arg Leu Pro Trp His Ala Ser Gly Asn Glu Gly Ile Thr Ile Ala
340 345 350
Pro Asp Lys Leu Tyr Pro Val Leu Glu Leu Asn Glu Asp Thr Gly Glu
355 360 365
Leu His Arg Val Arg Trp Asn Asn Asp Asp Arg Gly Val Val Pro Phe
370 375 380
Gly Glu Lys Tyr Ser Pro Ser Glu Trp Tyr Glu Ala Ala Arg Lys Trp
385 390 395 400
Asp Gly Ile Leu Arg Arg Lys Ser Ser Glu Leu Trp Val Gln Leu Glu
405 410 415
Pro Gly Lys Pro Leu Ile Phe Asp Asn Trp Arg Val Leu His Gly Arg
420 425 430
Ser Ala Phe Ser Gly Ile Arg Arg Ile Cys Gly Gly Tyr Ile Asn Arg
435 440 445
Asp Asp Phe Ile Ser Arg Trp Arg Asn Thr Asn Tyr Pro Arg Ser Glu
450 455 460
Val Leu Pro Arg Val Thr Gly
465 470
<210>13
<211>480
<212>PRT
<213>粗糙脉孢菌
<400>13
Met Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Glu Thr His Lys Ala Met Leu Glu His
1 5 10 15
Ser Leu Val Glu Ser Asp Pro Gln Val Ala Glu Ile Met Lys Lys Glu
20 25 30
Val Gln Arg Gln Arg Glu Ser Ile Ile Leu Ile Ala Ser Glu Asn Val
35 40 45
Thr Ser Arg Ala Val Phe Asp Ala Leu Gly Ser Pro Met Ser Asn Lys
50 55 60
Tyr Ser Glu Gly Leu Pro Gly Ala Arg Tyr Tyr Gly Gly Asn Gln His
65 70 75 80
Ile Asp Glu Ile Glu Val Leu Cys Gln Asn Arg Ala Leu Glu Ala Phe
85 90 95
His Leu Asp Pro Lys Gln Trp Gly Val Asn Val Gln Cys Leu Ser Gly
100 105 110
Ser Pro Ala Asn Leu Gln Val Tyr Gln Ala Ile Met Pro Val His Gly
115 120 125
Arg Leu Met Gly Leu Asp Leu Pro His Gly Gly His Leu Ser His Gly
130 135 140
Tyr Gln Thr Pro Gln Arg Lys Ile Ser Ala Val Ser Thr Tyr Phe Glu
145 150 155 160
Thr Met Pro Tyr Arg Val Asn Ile Asp Thr Gly Leu Ile Asp Tyr Asp
165 170 175
Thr Leu Glu Lys Asn Ala Gln Leu Phe Arg Pro Lys Val Leu Val Ala
180 185 190
Gly Thr Ser Ala Tyr Cys Arg Leu Ile Asp Tyr Glu Arg Met Arg Lys
195 200 205
Ile Ala Asp Ser Val Gly Ala Tyr Leu Val Val Asp Met Ala His Ile
210 215 220
Ser Gly Leu Ile Ala Ser Glu Val Ile Pro Ser Pro Phe Leu Tyr Ala
225 230 235 240
Asp Val Val Thr Thr Thr Thr His Lys Ser Leu Arg Gly Pro Arg Gly
245 250 255
Ala Met Ile Phe Phe Arg Arg Gly Val Arg Ser Val Asp Ala Lys Thr
260 265 270
Gly Lys Glu Thr Leu Tyr Asp Leu Glu Asp Lys Ile Asn Phe Ser Val
275 280 285
Phe Pro Gly His Gln Gly Gly Pro His Asn His Thr Ile Thr Ala Leu
290 295 300
Ala Val Ala Leu Lys Gln Ala Ala Ser Pro Glu Phe Lys Glu Tyr Gln
305 310 315 320
Gln Lys Val Val Ala Asn Ala Lys Ala Leu Glu Lys Lys Leu Lys Glu
325 330 335
Leu Gly Tyr Lys Leu Val Ser Asp Gly Thr Asp Ser His Met Val Leu
340 345 350
Val Asp Leu Arg Pro Ile Gly Val Asp Gly Ala Arg Val Glu Phe Leu
355 360 365
Leu Glu Gln Ile Asn Ile Thr Cys Asn Lys Asn Ala Val Pro Gly Asp
370 375 380
Lys Ser Ala Leu Thr Pro Gly Gly Leu Arg Ile Gly Thr Pro Ala Met
385 390 395 400
Thr Ser Arg Gly Phe Gly Glu Ala Asp Phe Glu Lys Val Ala Val Phe
405 410 415
Val Asp Glu Ala Val Lys Leu Cys Lys Glu Ile Gln Ala Ser Leu Pro
420 425 430
Lys Glu Ala Asn Lys Gln Lys Asp Phe Lys Ala Lys Ile Ala Thr Ser
435 440 445
Asp Ile Pro Arg Ile Asn Glu Leu Lys Gln Glu Ile Ala Ala Trp Ser
450 455 460
Asn Thr Phe Pro Leu Pro Val Glu Gly Trp Arg Tyr Asp Ala Gly Leu
465 470 475 480
<210>14
<211>495
<212>PRT
<213>粗糙脉孢菌
<400>14
Met Glu Val Glu Leu Thr Ala Pro Asn Gly Lys Lys Trp Met Gln Pro
1 5 10 15
Leu Gly Leu Phe Ile Asn Asn Glu Phe Val Lys Ser Ala Asn Glu Gln
20 25 30
Lys Leu Ile Ser Ile Asn Pro Thr Thr Glu Glu Glu Ile Cys Ser Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Ala Glu Asp Val Asp Ala Ala Val Ser Ala Ala Arg
50 55 60
Lys Ala Phe Arg His Glu Ser Trp Lys Ser Leu Ser Gly Thr Glu Arg
65 70 75 80
Gly Ala Leu Met Arg Lys Leu Ala Asp Leu Val Ala Glu Asn Ala Glu
85 90 95
Ile Leu Ala Thr Ile Glu Cys Leu Asp Asn Gly Lys Pro Tyr Gln Thr
100 105 110
Ala Leu Asn Glu Asn Val Pro Glu Val Ile Asn Val Leu Arg Tyr Tyr
115 120 125
Ala Gly Tyr Ala Asp Lys Asn Phe Gly Gln Val Ile Asp Val Gly Pro
130 135 140
Ala Lys Phe Ala Tyr Thr Val Lys Glu Pro Leu Gly Val Cys Gly Gln
145 150 155 160
Ile Ile Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Asp Met Ala Ala Trp Lys Leu Gly
165 170 175
Pro Ala Leu Cys Cys Gly Asn Thr Val Val Leu Lys Leu Ala Glu Gln
180 185 190
Thr Pro Leu Ser Val Leu Tyr Leu Ala Lys Leu Ile Lys Glu Ala Gly
195 200 205
Phe Pro Pro Gly Val Ile Asn Ile Ile Asn Gly His Gly Arg Glu Ala
210 215 220
Gly Ala Ala Leu Val Gln His Pro Gln Val Asp Lys Ile Ala Phe Thr
225 230 235 240
Gly Ser Thr Thr Thr Gly Lys Glu Ile Met Lys Met Ala Ser Tyr Thr
245 250 255
Met Lys Asn Ile Thr Leu Glu Thr Gly Gly Lys Ser Pro Leu Ile Val
260 265 270
Phe Glu Asp Ala Asp Leu Glu Leu Ala Ala Thr Trp Ser His Ile Gly
275 280 285
Ile Met Ser Asn Gln Gly Gln Ile Cys Thr Ala Thr Ser Arg Ile Leu
290 295 300
Val His Glu Lys Ile Tyr Asp Glu Phe Val Glu Lys Phe Lys Ala Lys
305 310 315 320
Val Gln Glu Val Ser Val Leu Gly Asp Pro Phe Glu Glu Ser Thr Phe
325 330 335
His Gly Pro Gln Val Thr Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Val Leu Gly Tyr
340 345 350
Ile Asn Val Gly Lys Glu Glu Gly Ala Thr Val Met Met Gly Gly Glu
355 360 365
Pro Ala Pro Gln Asn Gly Lys Gly Phe Phe Val Ala Pro Thr Val Phe
370 375 380
Thr Asn Val Lys Pro Thr Met Lys Ile Phe Arg Glu Glu Ile Phe Gly
385 390 395 400
Pro Cys Val Ala Ile Thr Thr Phe Lys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Thr
405 410 415
Leu Ala Asn Asp Ser Met Tyr Gly Leu Gly Ala Ala Leu Phe Thr Lys
420 425 430
Asp Leu Thr Arg Ala His Arg Val Ala Arg Glu Ile Glu Ala Gly Met
435 440 445
Val Trp Val Asn Ser Ser Asn Asp Ser Asp Phe Arg Ile Pro Phe Gly
450 455 460
Gly Val Lys Gln Ser Gly Ile Gly Arg Glu Leu Gly Glu Ala Gly Leu
465 470 475 480
Ala Pro Tyr Cys Asn Val Lys Ser Ile His Val Asn Leu Ala Ala
485 490 495
<210>15
<211>425
<212>PRT
<213>粗糙脉孢菌
<400>15
Met Ala Thr Ala Ala Val Gln Val Ser Val Pro Ala Pro Val Gly Gln
1 5 10 15
Pro Asp Ile Gly Tyr Ala Pro Asp His Asp Lys Tyr Leu Ala Arg Val
20 25 30
Lys Arg Arg Arg Glu Asn Glu Lys Leu Glu Ser Ser Leu Pro Pro Gly
35 40 45
Phe Pro Arg Arg Leu Asp Ser Asp Leu Val Trp Asp Gly Asn Thr Leu
50 55 60
Ala Glu Thr Tyr Asp Trp Thr Tyr Arg Leu Thr Glu Glu Ala Ile Asp
65 70 75 80
Glu Ile Glu Ala Ala Leu Arg His Phe Lys Ser Leu Asn Lys Pro Leu
85 90 95
Gly Tyr Ile Asn Gln Glu Thr Phe Pro Leu Pro Arg Leu His His Thr
100 105 110
Leu Arg Ser Leu Ser His Glu Leu His His Gly His Gly Phe Lys Val
115 120 125
Leu Arg Gly Leu Pro Val Thr Ser His Thr Arg Glu Glu Asn Ile Ile
130 135 140
Ile Tyr Ala Gly Val Ser Ser His Val Ala Pro Ile Arg Gly Arg Gln
145 150 155 160
Asp Asn Gln His Asn Gly His Pro Ala Asp Val Val Leu Ala His Ile
165 170 175
Lys Asp Leu Ser Thr Thr Val Ser Asp Val Ser Lys Ile Gly Ala Pro
180 185 190
Ala Tyr Thr Thr Glu Lys Gln Val Phe His Thr Asp Ala Gly Asp Ile
195 200 205
Val Ala Leu Phe Cys Leu Gly Glu Ala Ala Glu Gly Gly Gln Ser Tyr
210 215 220
Leu Ser Ser Ser Trp Lys Val Tyr Asn Glu Leu Ala Ala Thr Arg Pro
225 230 235 240
Asp Leu Val Arg Thr Leu Ala Glu Pro Trp Val Ala Asp Glu Phe Gly
245 250 255
Lys Glu Gly Arg Lys Phe Ser Val Arg Pro Leu Leu His Phe Gln Ser
260 265 270
Thr Ala Ala Ala Ala Ser Arg Glu Ala Lys Pro Glu Ser Glu Arg Leu
275 280 285
Ile Ile Gln Tyr Ala Arg Arg Thr Phe Thr Gly Tyr Trp Gly Leu Pro
290 295 300
Arg Ser Ala Asp Ile Pro Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ala Glu Ala Leu
305 310 315 320
Asp Ala Leu His Phe Thr Ala Glu Lys Tyr Ala Val Ala Leu Asp Phe
325 330 335
Arg Gln Gly Asp Val Gln Phe Val Asn Asn Leu Ser Val Phe His Ser
340 345 350
Arg Ala Gly Phe Arg Asp Glu Gly Glu Lys Gln Arg His Leu Val Arg
355 360 365
Leu Trp Leu Arg Asp Pro Glu Asn Ala Trp Glu Thr Pro Glu Ala Leu
370 375 380
Lys Glu Arg Trp Glu Arg Val Tyr Gly Gly Val Ser Pro Glu Arg Glu
385 390 395 400
Val Phe Pro Leu Glu Pro Gln Ile Arg Ser Ala Ser Lys Gly Glu Ser
405 410 415
Val Gly Thr Gln Gly Gly Gly Gly Tyr
420 425
<210>16
<211>651
<212>DNA
<213>粗糙脉孢菌
<400>16
atggccttcg gaaagcttta cacctacgag gcgaaccccc gctccacggc catcttggct 60
gtcgcgaagg ccaacaacct cgacctcgag gttatcaagg tcgaccttga ggctgccatc 120
gaggagtaca agaaggtcaa ccctctcggc aaggtcccca ccttcgttgg tgccgacggc 180
tacactctct tcgagtgcat cgccatcgcc atctatgtcg cttcccagaa cgagaagacc 240
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aacaccgagg tccttccccc tcttgctggc tggtaccgcc ctctccttgg caaggctccc 360
tacaacaaga aggctgttga ggacgctcag gctactgccc tcaaggccat ctctgtcgcc 420
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ttcgccactg gcatcattgc ccgcggcttc gagttcttct tcgacaaggc ctggcgcgag 540
cagtacccca acgtcacccg ttggtacacc actgtctaca accagcccat ctactcggcc 600
gttgctcctc ccttcgctct ccttgatacc cccaagttga ccaacgtcta a 651
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<212>DNA
<213>粗糙脉孢菌
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ctttcgagga cccatatctt tgctgccgtc actgttgcaa agtcctcatc acctgcccag 120
aactcgagaa gaaccttttc atcctctttc cgacggttgt atgagccaaa ggcggagata 180
acagctgagg gacttgagtt gagccctcca caggctgtta cgggtggaaa gcggactgtt 240
ttacccaact tctggctacg tgacaactgc cggtgtacga aatgcgtgaa ccaagatact 300
ctccagagaa acttcaacac ttttgccatc ccctccgaca tccacccaac aaaggttgaa 360
gccaccaagg agaacgtcac cgtccaatgg tccgacaacc acacatccac ctacccctgg 420
cccttcctct ctttctacct cacctccaac gcgcgcgggc acgaaaacga ccagatctcc 480
ctctggggct ccgaagccgg ctcccgcccg ccaaccgtct ccttccctcg cgtgatggca 540
tcagaccagg gcgtcgccga cctaaccgcc atgatcaaag agttcggctt ctgtttcgtc 600
aaagacacac cccatgacga cccggacgtg acccgccagc ttctggagag aatcgccttt 660
atccgagtga cccattacgg cggcttttac gatttcacgc ccgacctcgc gatggccgac 720
acggcgtaca cgaacctggc gctgccggcg catacggata cgacgtactt cacggacccg 780
gcggggttgc aggcttttca cttgttggag cataaggccg ctccttctcg tcctcctcct 840
cctcctcctc ctcctcctcc tccttctgaa gaaaaagaag ctgcaggctc agcagcaggg 900
gaggcggcgg cggcagcaga agggggaaag tcgttgttgg tcgatgggtt caacgccgcg 960
aggattctga aggaggagga tccccgggct tatgagatct tgagcagcgt gagactgccg 1020
tggcatgcga gtggaaacga agggatcacg attgcgcccg ataagcttta tccggtgctg 1080
gaactgaatg aggataccgg ggaactgcat agggttaggt ggaataatga tgataggggt 1140
gtggtgccgt ttggggagaa gtacagcccg tcagagtggt atgaggcggc gaggaagtgg 1200
gatgggattt tgaggaggaa gagcagcgag ttgtgggtgc agttggagcc ggggaagccg 1260
ttgaggttct tcatggacgg agcgcgttct cgggtattag gaggatttgt ggagggtata 1320
tcaaccgcga tgacttcatc tctcggtgga ggaacacgaa ttacccaagg agcgaggttc 1380
ttccgagggt tactggttaa ggactga 1407
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<212>DNA
<213>粗糙脉孢菌
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tccgaccccc aggtcgccga gatcatgaag aaggaggttc agcgccagcg cgagtccatc 120
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atgtccaaca agtactcgga gggtcttccc ggcgcccgct actatggtgg caaccagcac 240
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caggccatca tgcccgtcca cggcagactc atgggtcttg acctccccca cggtggccat 420
ctttcccacg gttaccagac cccccagcgc aagatctctg ctgtctctac ctacttcgag 480
accatgccct accgcgtcaa cattgacact ggtctcatcg actacgatac cctcgagaag 540
aacgcccagc tcttccgccc caaggtcctc gtcgccggta cctctgccta ctgccgtctg 600
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atggctcaca tttccggcct cattgcctcc gaggttatcc cctcgccctt cctctacgcc 720
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ttccgccgcg gtgtccgctc cgttgacgcc aagaccggca aggagaccct ctacgacctt 840
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taa 1443
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<213>粗糙脉孢菌
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<213>粗糙脉孢菌
<400>21
Ala Phe Gly Lys Leu
1 5
机译： 包括L-肉碱生物合成相关基因的肠细菌属微生物，以及使用该微生物生产L-肉碱的方法
机译： 肠杆菌科属微生物与L-肉碱生物合成相关的基因和利用该微生物生产L-肉碱的方法
机译： 肠杆菌科属微生物与L-肉碱生物合成相关的基因和利用该微生物生产L-肉碱的方法
