双分流纳升级液相色谱在线脱盐、富集与质谱联用系统

摘要

本发明涉及一种双分流纳升级液相色谱在线脱盐、富集与质谱联用系统，包括：泵、第一分流器、第二分流器、进样阀、切换阀、反压阀、毛细管分离柱和质谱仪；其中，泵、第一分流器、进样阀、第二分流器、毛细管分离柱及质谱仪通过管路依次串连；第一分流器和第二分流器的分流端口通过管路分别与切换阀的两个入口相连；切换阀的出口与反压阀串连后经管路通入废液池。该方法的优点为：在样品的进样与分离过程中，系统压力波动小；柱前死体积小，克服了纳升级液相分离系统中使用大体积进样环带来的梯度延迟效应；分离重复性好，特别适合于梯度分离；可用于含盐量高、浓度低的样品的在线脱盐和富集以及与质谱联用；系统结构简单、操作方便、容易自动化。

说明书

技术领域

本发明涉及微分离系统，具体的说是一种双分流纳升级液相色谱在线脱盐、富集与质谱联用系统。

背景技术

自20世纪80年代，随着色谱理论的发展，人们开始意识到微分离系统的优势，并致力于微尺度、微流量高效液相色谱(HPLC)分离系统的研发。在这样的系统中，一般使用20-250μm内径的熔融石英毛细管、PEEK管或PEKSIL管作为柱管，在其中装填填料。在0.02-10μL/min的低流速下进行样品的分离，可获得比常规HPLC系统更高的柱效和分辨率。同时，在这样的微尺寸系统中，传统的紫外检测器由于检测光程短，检测灵敏度低，已不再适用。

电喷雾离子化(ESI)技术的出现，标志着液相分离系统与质谱联用技术的日趋成熟。近年来，随着质谱接口技术的发展，出现了大量适合于微流量液相分离系统的接口，使得电喷雾-质谱(ESI-MS)与微柱HPLC、毛细管电泳(CE)、毛细管电色谱(CEC)和加压电色谱(pCEC)等微流量(微升级、纳升级)液相分离系统的在线联用成为了可能，并发展成为新兴的分离检测技术。该联用系统已被广泛应用于环境样品分析、药物及药物代谢、生物样品、蛋白质组学等领域。

在纳升HPLC分离系统中所使用分离柱，其内径一般在150μm以下；系统中的流量一般在1μ/min以下。所以需要更加微小尺寸的连接管路，否则往往容易引起严重的柱前和柱后效应。但由于加工工艺的限制，连接管路的切口以及各个管路的接口很容易引入较大的死体积，影响分离系统的分离和检测。特别是在使用梯度分离的时候，这样的影响变得更加严重，同时，使用较小内径管路也容易被样品或流动相中的颗粒状污染物堵塞。另外，将样品引入分离系统也是引起死体积的原因之一。为了和系统匹配，一般只能使用微型进样阀，样品的进样量被限制在几十到几百的纳升。为了获得较大的进样量，也有人采用离线的方法进样。将大体积的样品直接注入分离柱，然后再与分离系统连接。但是该方法操作麻烦，系统重复性差，分离效果不好，不利于自动化。还有人采用分流的方式来进样，但是往往需要浪费大量的样品。这些均限制了该方法的使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双分流纳升级液相色谱在线脱盐、富集与质谱联用系统。利用双分流装置，可以消除系统的死体积。同时液相色谱柱可以起到脱盐和浓缩样品的作用，减少盐或其它小分子对样品离子化的影响。此外，还可以降低样品的损耗和污染，减少非挥发性盐类对质谱的污染和损害。从而实现样品的在线脱盐、富集与质谱联用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

使用双分流的形式使流动相在HPLC分离柱中的流速在纳升级范围内。通过在分离柱前添加两个分流装置，使得系统中的流动相在样品进样和分离时分别从不同位置分流。利用样品在固定相上的保留，实现对含盐量高、浓度低的样品的在线脱盐和富集，并与质谱联用。

具体系统包括：泵、第一分流器、第二分流器、进样阀、切换阀、反压阀、毛细管分离柱和质谱仪；其中，泵、第一分流器、进样阀、第二分流器、毛细管分离柱及质谱仪通过管路依次串连；第一分流器和第二分流器的分流端口通过管路分别与切换阀的两个入口相连；切换阀的出口与反压阀串连后经管路通入废液池。

所述泵的流量为1μL/min.-5mL/min。纳升级范围流速可通过改变系统的限压装置实现。限压装置可以是反压阀、细内径管路、填充柱、限压阀、阻力器、泵等。通过两个分流装置分流后的流路可共同使用单一限压装置提供分离系统中压力，也可分别使用限压装置提供分离系统中的压力。

所述毛细管分离柱可以为反相色谱柱、正相色谱柱、疏水色谱柱、亲和色谱柱、固定化金属亲和色谱柱或体积排阻色谱柱。

所述第一分流器或第二分流器可使用多流路接头进行分流；多流路接头可为三通或四通。所述进样阀可以为自动进样器。上述不同位置分流至少需要有一处在进样装置前，至少需要有一处在进样装置后。

所述含盐量高、浓度低的样品包括各种在一定条件下能在色谱柱上吸附或保留，并通过改变条件能够洗脱的样品，包括蛋白质样品、多肽样品、生物样品、中药提取物、环境污染物和化工产品等。用于样品在富集和洗脱时需改变分离条件。这些条件包括流动相的种类和组成、pH值、离子强度、电场方向、添加剂的种类和浓度等。

本发明的有益效果是：

1、实现了利用常规液相色谱泵构建纳升级HPLC在线脱盐、富集与质谱联用系统。通过双分流系统消除了系统中由连接管路和进样装置所引入的死体积；同时，利用样品在液相色谱柱上的保留，可以对样品进行在线脱盐和浓缩；使纳升级分离系统的进样体积可达到微升级。

2、实现了样品的纳升级HPLC在线脱盐、富集以及与质谱联用。通过对样品的脱盐，可以减少盐或其它小分子对样品离子化的影响，提高质谱检测的灵敏度。此外，还可以降低样品的损耗和污染，减少非挥发性盐类对质谱的污染和损害，可应用于高盐样品的质谱检测。

3、系统构建简单、容易实现。无须使用低流量液相色谱泵和微阀，仅需使用常规泵即可实现分离系统的纳升级流量；使用一般进样阀即可实现样品的大量进样；利用色谱柱对样品的保留，可实现样品的富集和脱盐。

4、具有良好的通用性，实用性强，具有较高的推广价值。该系统可用于多种与质谱匹配的分离模式的在线脱盐、富集以及与质谱联用，包括反相色谱、正相色谱、疏水色谱、亲和色谱、固定化金属亲和色谱、体积排阻色谱等。

5、应用范围广。本发明可用于二维或者多维色谱分离，包括蛋白质样品、多肽样品、生物样品、中药提取物、环境污染物和化工产品等复杂样品的分离分析；可实现常规分离系统与纳升级分离系统的耦联；容易实现自动化。

其中所述常规分离系统可以是无法与质谱匹配的分离系统。

附图说明

图1为本发明专用的装置示意图。系统由泵1、第一分流器2、第二分流器3、进样阀4、切换阀5、反压阀6、(毛细管)分离柱7和质谱8组成。从泵1输运出的流动相可以通过第一分流器2和第二分流器3进行分流；进样阀4接在第一分流器2和第二分流器3之间，两分流器又分别与切换阀5相连。最后，通路通过反压阀6通入废液中。毛细管分离柱7其中一个末端经过加热和拉伸后成为锥形，不仅可直接使固定相固定于分离柱中，而且能够和质谱相连；另一末端则直接与第二分流器3相连。

图2为使用双分流纳升级液相色谱在线脱盐、富集与质谱联用系统，对小鼠癌细胞蛋白的胰蛋白酶酶解产物进行分离检测后得到的色谱图。

图3为本发明双分流纳升级HPLC在线脱盐、富集与质谱联用系统和固定化亲和色谱整体柱在线联用的装置示意图。

图4为五个肽段使用固定化亲和色谱整体柱和双分流纳升级液相色谱在线脱盐、富集与质谱联用系统偶联进行分离检测得到的色谱图。其中a为总离子流图，c和e为磷酸化肽的选择性离子图，b，d，f为在固定化亲和色谱整体柱上没有保留的肽段的选择性离子图。

图5使用双分流纳升级液相色谱在线脱盐、富集与质谱联用系统，对含有不同盐浓度的牛血清白蛋白酶解产物的分离谱图。其中图A和图C为含100mMNH₄HCO₃的样品通过双分流纳升级液相色谱在线脱盐、富集后得到的分离谱图；图B为含1MNH₄Ac的样品通过双分流纳升级液相色谱在线脱盐、富集后得到的分离谱图。

具体实施方式

实施例1：

请参阅图1，系统由泵1、第一分流器2、第二分流器3、进样阀4、切换阀5、反压阀6、(毛细管)分离柱7和质谱8组成。从泵1输运出的流动相可以通过第一分流器2和第二分流器3进行分流；进样阀4接在第一分流器2和第二分流器3之间，两分流器又分别与切换阀5相连。最后，通路通过反压阀6通入废液中。毛细管分离柱7其中一个末端经过加热和拉伸后成为锥形，不仅可直接使固定相固定于分离柱中，而且能够和质谱相连；另一末端则直接与第二分流器3相连。

在对分离柱进行平衡时如图1-a，通过控制切换阀5，使流动相在第二分流器3处进行分流，而第一分流器2不再分流；

在样品进样时如图1-b，通过控制切换阀5，使流动相在第一分流器2处进行分流，而第二分流器3不再分流。样品以分流柱中的流速进入分离柱，不进行分流，能够保证样品完全进入分离柱。同时，因为样品与固定相有相互作用，能够被保留在柱头，而溶液中的盐和其它没有保留的物质则从通过分离柱。通过这样的步骤，可以对样品进行除盐和富集。

在对样品进行分离时，通过控制切换阀5，使流动相在第二分流器3处进行分流，而第一分流器2不再分流；由3-4引入的死体积，在较高的流速下，可以被忽略，从而达到消除死体积的效果。

此外，系统中选用一个反压阀6作为压力控制器，这样整个体系的压力恒定；在切换阀5进行切换时，没有显著的压力变化，从而可以保证分离柱中流速的恒定，同时可以防止分离柱由于压力变化而损坏。

图2为使用双分流纳升级HPLC在线脱盐、富集与质谱联用系统，对小鼠癌细胞蛋白的胰蛋白酶酶解产物进行分离检测后得到的色谱图。

实施例2：

请参阅图3，系统由泵1、第一分流器2、第二分流器3、进样阀4、切换阀5、反压阀6、(毛细管)分离柱7、固定化金属亲和色谱整体柱(IMC)8以及质谱9组成。从泵1输运出的流动相可以通过第一分流器2和第二分流器3进行分流。进样阀4接在第一分流器2和第二分流器3之间，两分流器又分别与切换阀5相连。最后，通路通过反压阀6通入废液中。毛细管分离柱7其中一个末端经过加热和拉伸后成为锥形，不仅可直接使固定相固定于分离柱中，而且能够和质谱相连；另一末端则直接与第二分流器3相连。

样品通过泵注入固定化金属亲和色谱(IMAC)整体柱8中。磷酸化的多肽与IMAC整体基质有特异性相互作用可以得到保留，其它与基质没有作用的物质则不被保留。使用洗脱溶液直接将磷酸化肽洗脱，进入进样阀4的进样环后，再进一步分离分析。

图4为5个多肽使用双分流纳升级HPLC在线脱盐、富集与质谱联用系统进行分离检测后所得到的色谱图。其中的2个肽为磷酸化肽被固定化亲和色谱整体柱选择性保留后，得到了质谱检测。

实施例3：

请参阅图1，系统由泵1、第一分流器2、第二分流器3、进样阀4、切换阀5、反压阀6、(毛细管)分离柱7和质谱8组成。从泵1输运出的流动相可以通过第一分流器2和第二分流器3进行分流。进样阀4接在第一分流器2和第二分流器3之间，两分流器又分别与切换阀5相连。最后，通路通过反压阀6通入废液中。毛细管分离柱7其中一个末端经过加热和拉伸后成为锥形，不仅可直接使固定相固定于分离柱中，而且能够和质谱相连；另一末端则直接与第二分流器3相连。

在对分离柱进行平衡时如图1-a，通过控制切换阀5，使流动相在第二分流器3处进行分流，而第一分流器2不再分流；

在样品进样时如图1-b，通过控制切换阀5，使流动相在第一分流器2处进行分流，而第二分流器3不再分流。样品以分流柱中的流速进入分离柱，不进行分流，能够保证样品完全进入分离柱。同时，因为样品与固定相有相互作用，能够被保留在柱头，而溶液中的盐和其它没有保留的物质则从通过分离柱。通过这样的步骤，可以对样品进行除盐和富集。

在对样品进行分离时，通过控制切换阀5，使流动相在第二分流器3处进行分流，而第一分流器2不再分流。由3-4引入的死体积，在较高的流速下可以被忽略，从而达到消除死体积的效果。

此外，系统中选用一个反压阀6作为压力控制器，可使整个体系的压力恒定。在切换阀5进行切换时，没有显著的压力变化，从而既可以保证分离柱中流速的恒定，同时又可以防止分离柱由于压力变化而损坏。

使用双分流纳升级HPLC在线脱盐、富集与质谱联用系统，对含有不同盐浓度的牛血清白蛋白酶解产物进行了分析，结果如图5。当样品中含有高达1M的NH₄AC时(图B)，样品仍得到分离检测。其分离谱图与含有100mM NH₄HCO₃(图A和图C)和的牛血清白蛋白酶解产物的分离谱图十分相似，其数据库检索结果也无明显差异。