法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-02-10
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N30/02 授权公告日:20111026 终止日期:20141222 申请日:20061222
专利权的终止
2011-10-26
授权
授权
2008-08-20
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-06-25
公开
公开
技术领域
本发明涉及磷酸化肽的检测方法,具体地说是一种电喷雾质谱中多磷酸化位点肽段的检测和鉴定方法。
背景技术
随着人类基因组计划的完成,人类的全基因草图已成为人们进一步揭示人体奥秘的新起点。在基因序列测定技术、蛋白质分离技术、质谱技术以及生物信息学日益发展和完善的基础上,蛋白质的电泳和色谱分离、质谱鉴定以及DNA和蛋白质序列数据库检索已经发展成为一种较为可靠的蛋白质分析方法。理论上,人们已经具有了研究人体内所有蛋白质的可能。
蛋白质翻译后修饰是生物体内普遍存在的现象。它包括酶催化下分子个体与蛋白质结合(乙酰化、糖基化和磷酸化)、蛋白质分子间的交联(半胱氨酸-半胱氨酸之间的二硫键结合)以及对蛋白质的裁剪(信号肽的切除)。这些修饰不仅保证了生物体内蛋白质的完整性,同时影响着蛋白质的活性及其相互作用。此外,对细胞膜内外间的信号传导起着调控作用。在这些修饰中,蛋白磷酸化尤为重要。在蛋白质特定氨基酸残基上的可逆磷酸化修饰是细胞中的主要调控机制,对细胞的整个生理过程(细胞的成长、分裂和分化)、信号传导、基因调控和代谢过程都十分重要。
近几年,质谱已经成为分析和鉴定磷酸化蛋白和多肽以及确定磷酸化位点的主要手段。目前主要采用的方法是利用亲和技术(包括免疫亲和、固定化金属亲和及金属氧化物亲和)对磷酸化蛋白或磷酸化肽进行富集和纯化,然后进入质谱进行分析。在使用电喷雾质谱对磷酸化肽段进行分析时,由于磷酸根的存在,多肽分子不容易结合质子形成正离子,严重地抑制了磷酸化肽在质谱中的响应信号,即使通过富集和纯化,也仅能提高单磷酸肽和二磷酸化肽的检出率,而对于多磷酸化位点的检测和鉴定仍然无能为力。尽管有报道使用衍生化方法替代磷酸化肽段上的磷酸根以提高其在质谱中的响应,但这些方法都需要对样品进行复杂的化学处理,并容易引入其它干扰。
此外,磷酸化肽在进行质谱检索时,对于同一位置出峰的肽段,有时会给出多种可能的磷酸化位点的结果。因此,仅通过数据库检索可能无法准确地确定其磷酸化位点。采用在电喷雾质谱检测多磷酸化肽仍然是目前蛋白质翻译后修饰研究的一个难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电喷雾质谱中多磷酸化位点肽段的检测和鉴定方法。利用磷酸酶对磷酸化肽段进行处理。可以通过改变反应条件,控制磷酸化肽的去磷酸化程度。将处理后的样品与未处理的样品分别进入电喷雾质谱中进行分析和比较,可以测定磷酸化肽段,并确定其磷酸化位点。可作为一种电喷雾质谱中初步判断磷酸化肽存在的方法;可以提高多磷酸化肽的质谱响应信号和检出率;通过控制反应条件能够推测多磷酸化肽段的磷酸化位点,并可作为一种多级质谱分析的验证方法;方法简单、操作方便、条件可控,容易实现在线分析。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
检测和鉴定方法:利用磷酸酶对磷酸化肽段进行处理,并通过控制磷酸化肽段的去磷酸化程度。将处理后的样品与未处理的样品分别进入电喷雾质谱中进行分析和比较,可以测定多磷酸化肽段,并确定其磷酸化位点。
所述控制磷酸化肽段的去磷酸化程度方式为,控制反应pH值在1-14;酶与底物的用量之比在1∶1至100,000∶1(U∶g);反应温度在10-50℃;分别于反应时间为0、依次间隔5s-0.5h取样,进入电喷雾质谱中进行分析和比较、直至磷酸化肽段完全去磷酸化,其取样次数应≥4。
所述磷酸化肽段为具有两个或两个以上磷酸化位点的肽段;
所述样品可以是含有磷酸化肽段的混合物,也可以是通过亲和富集和纯化后得到的磷酸化肽混合物,或者是单个具有多磷酸位点的肽段。
所述磷酸酶有以下特征:
1)是一种可以催化磷酸化蛋白或肽段去磷酸化反应的酶,市购(上海生工生物工程技术服务有限公司、SIGMA公司等);
2)可以是碱性磷酸酶,也可以是酸性磷酸酶;
3)可以来源于细菌或动物组织;
4)可以采用自由酶溶液形式,也可以采用将酶固定在载体上的固定化酶形式。
其中所述电喷雾质谱是指采用电喷雾技术的质谱仪,即采用在液体上施加高电压,使液体进行雾化和离子化的电离方式的质谱。
本发明的有益效果是:
1、本方法能够提高多磷酸化肽段的质谱响应信号和检出率,可作为一种电喷雾质谱中初步判断多磷酸化肽段存在的方法。当多磷酸化肽去磷酸后,其电离得到改善,肽段的质谱响应信号得以提高。原本无法在电喷雾质谱进行检测的多磷酸化肽段在经过该方法处理后,能够有效检测。利用去磷酸处理前后肽段信息的差异即可初步判定是否存在磷酸化肽。
2、本方法通过控制反应条件,能够推测多磷酸化肽段的磷酸化位点,并可作为一种多级质谱分析的验证方法。通过控制反应条件,使多磷酸化肽去磷酸化不完全,形成多个单磷酸化肽或二磷酸化肽。可以从生成的磷酸化肽的质谱检测信息来推测多磷酸化肽的部分或全部位点信息。此外,由于氨基酸序列相同、磷酸化位点不同的肽段具有不同的色谱保留值,通过与液相分离系统联用,可以进一步得到磷酸化肽段出峰时间变化的信息,提供判断多磷酸化肽的位点信息的依据。
3、方法简单、容易实现。本发明仅使用磷酸酶催化磷酸化肽的去磷酸化反应。反应容易控制、操作简单。
4、容易实现在线分析和自动化。利用酶固定技术可将磷酸酶固定于载体上,实现在线分析。
附图说明
图1为本发明的操作流程图。
图2为本发明实施例2对磷酸化肽段进行高效液相色谱/电喷雾质谱联用(HPLC-ESI/MS)分离检测得到的总离子流图。其中A为β-casein蛋白酶解产物直接进行分离得到的谱图;B为富集后的磷酸化肽段的分离谱图;C为使用碱性磷酸酶去磷酸化处理后的肽段的分离谱图。
图3为本发明实施例3中通过改变反应温度控制去磷酸化反应的样品经HPLC-ESI/MS分离检测得到的总离子流图。A样品为β-casein蛋白酶解产物经TiO2柱富集后的磷酸化肽段;B样品为富集的磷酸化肽在25℃部分去磷酸化肽段;C样品为富集的磷酸化肽在37℃完全去磷酸化肽段。
图4为本发明实施例4中通过改变磷酸酶的浓度控制去磷酸化反应的样品经HPLC-ESI/MS分离检测得到的总离子流图。其中:A中碱性磷酸酶浓度为125μU/μL;B中碱性磷酸酶浓度为417μU/μL;C中碱性磷酸酶浓度为1250μU/μL。
图5为本发明实施例5通过改变去磷酸化反应的时间控制磷酸化肽去磷酸化程度的样品经HPLC-ESI/MS分离检测得到的总离子流图。其中:A反应时间为180min;B反应时间为270min;C反应时间为420min。
具体实施方式
实施例1
一种电喷雾质谱中多磷酸化位点肽段的检测和鉴定方法的操作流程如图1所示。包括:a,磷酸化蛋白酶解:将磷酸化蛋白用蛋白酶进行水解,使其成为含有磷酸化肽段的多肽混合物。b,磷酸化肽的富集:将a中得到的多肽混合物使用亲和富集的方法(固定化亲和,金属氧化物亲和,免疫亲和)进行富集。c,磷酸化肽的洗脱:利用洗脱缓冲溶液将磷酸化肽洗脱(包括在线洗脱和离线洗脱)。d,磷酸化肽的去磷酸化:使用磷酸酶(酸性磷酸酶和碱性磷酸酶)催化磷酸化肽的去磷酸化反应,通过控制反应条件(温度、酶浓度、反应时间、pH值)使磷酸根去除。最后,分别使用质谱对c和d中得到的肽段进行检测。
实施例2
实验条件:碱性磷酸酶溶液(1U/μL,小牛肠提取物,购于上海生工生物工程技术服务有限公司,使用时溶解于50mM碳酸氢铵水溶液),TiO2捕集柱,反相分离柱:250μm×50mm,C18-3μm填充PEEK柱,美国Michrom公司ParadigmMG4液相系统,美国Finnigan公司ESI质谱检测器。液相分离条件:流速:5μL/min,流动相:A(0.1%甲酸水溶液),B(含0.1%甲酸的ACN溶液),梯度:0.0min(5%B)-20.0min(65%B)-35.0 min(65%B),进样量:2μL。MS条件:喷雾电压:2kV,加热毛细管温度:180℃,正离子模式,扫描范围:m/z=400-2000。
样品:β-casein(牛奶提取物,购于sigma公司)的蛋白酶解产物。
请参阅图2,即利用本发明所提供的方法在对磷酸化肽段进行HPLC-ESI/MS分离检测得到的总离子流图。其中A为50μg/mL β-casein蛋白酶解产物直接进行分离得到的谱图;B为100μL 1mg/mL β-casein蛋白酶解产物经TiO2柱富集,收集的200μL磷酸化肽段洗脱组分,经10倍稀释后进行分离得到的谱图(相当于反应时间为0时取样);C为100μL 1mg/mL β-casein蛋白酶解产物经TiO2柱富集后的200μL磷酸化肽段洗脱组分,经冷冻干燥后,加入1250μU/μL碱性磷酸酶进行去磷酸化处理,25℃反应,从0s开始,每隔10min取样一次,连续取样4次,其中30min取样进行分离得到的谱图。
经TiO2柱富集后,磷酸化肽(m/z=1032、1279)得到了选择性富集,其相对丰度得到大大提高;进而经碱性磷酸酶的去磷酸处理后,可以检测和发现难以电离的多磷酸化肽(m/z=1402为多磷酸化肽段完全去磷酸化所对应的非磷酸化肽,m/z=1442为多磷酸化肽部分去磷酸化后的单磷酸化肽),同时可以佐证单磷酸化肽段的存在(磷酸化肽段m/z=1032去磷酸化后为m/z=992;磷酸化肽段m/z=1279去磷酸化后为m/z=1239)。
实施例3
实验条件:碱性磷酸酶溶液,TiO2捕集柱,反相分离柱:250μm×50mm,C18-3μm填充PEEK柱,美国Michrom公司Paradigm MG4液相系统,美国Finnigan公司ESI质谱检测器。液相分离及质谱检测条件参阅实施例2。
样品:β-casein蛋白酶解产物。
图3为通过改变反应温度控制去磷酸化反应的样品经HPLC-ESI/MS分离检测得到的的总离子流图。A为100μL 1mg/mL β-casein蛋白酶解产物经TiO2柱富集,收集的200μL磷酸化肽段洗脱组分,经10倍稀释后的样品进行分离得到的谱图(相当于反应时间为0时取样);B为100μL 1mg/mL β-casein蛋白酶解产物经TiO2柱富集后的200μL磷酸化肽段洗脱组分,经冷冻干燥后,加入1250μU/μL碱性磷酸酶进行去磷酸化处理,25℃反应,从0s开始,每隔10min取样一次,连续取样4次,其中30min取样进行分离得到的谱图;
C为样品B在37℃反应,从0s开始,每隔10min取样一次,连续取样4次,其中30min取样进行分离得到的谱图。
37℃反应30min后,去磷酸化完全,可以检测到难以电离的多磷酸化肽段(m/z=1402为多磷酸化肽段所对应的非磷酸化肽);通过降低反应温度(25℃),控制去磷酸化反应的程度,可以检测到多磷酸化肽部分去磷酸化后得到的单磷酸化肽(m/z=1442)。
实施例4
实验条件:碱性磷酸酶溶液,TiO2捕集柱,反相分离柱:250μm×50mm,C18-3μm填充PEEK柱,美国Michrom公司Paradigm MG4液相系统,美国Finnigan公司ESI质谱检测器。液相分离及质谱检测条件参阅实施例2。
样品:100μL 1mg/mL β-casein蛋白酶解产物经TiO2柱富集后,收集的200μL磷酸化肽段洗脱组分,经冷冻干燥后的固体粉末,分别加入100μL 一定浓度的碱性磷酸酶,25℃反应,从0s开始,每隔10min取样一次,连续取样4次,以30min取样的分离谱图作以比较。
图4为通过改变磷酸酶浓度控制去磷酸化反应的样品经HPLC-ESI/MS分离检测得到的总离子流图。其中:A为加入125μU/μL碱性磷酸酶,进行30min取样进行分离得到的谱图,B为加入417μU/μL碱性磷酸酶,进行30min取样进行分离得到的谱图,C为加入1250μU/μL碱性磷酸酶,进行30min取样进行分离得到的谱图。
通过改变磷酸酶的浓度,同样可以实现部分去磷酸化作用,而得到多磷酸化肽部分去磷酸化后的单磷酸化肽(m/z=1442)的检测。
实施例5
实验条件:125μU/μL碱性磷酸酶溶液,TiO2捕集柱,反相分离柱:250μm×50mm,C18-3μm填充PEEK柱,美国Michrom公司Paradigm MG4液相系统,美国Finnigan公司ESI质谱检测器。液相分离及质谱检测条件参阅实施例2。
样品:100μL 1mg/mL β-casein蛋白酶解产物经TiO2柱富集后,收集的200μL磷酸化肽段洗脱组分,经冷冻干燥后的固体粉末,加入100μL 125μU/μL碱性磷酸酶溶液,25℃,分别进行0、5、15、30、45、60、120、150、180、240、270、360、420min取样,并进行质谱分析。结果显示,从5min开始,已经有去磷酸化作用。
图5为通过改变反应的时间来控制去磷酸化程度的样品经HPLC-ESI/MS分离检测得到的总离子流图。其中:A反应时间为180min,B反应时间为270min,C反应时间为420min。
通过改变磷酸酶的反应时间,可以实现部分去磷酸化作用,多磷酸化肽经部分去磷酸化后相应的单磷酸化肽(m/z=1442)得到检测,图中还可以看出单磷酸化肽(m/z=1442)在两个位置出峰,且两峰峰面积均呈现由小到大的变化趋势。
机译: 鉴定已知序列的DNA片段的插入位点的方法,插入一段DNA gen的序列中的方法忽略了身体的位置。确定一段未知的DNA gen的序列的方法一种已知序列的制备方法,用于鉴定序列已知的DNA片段的插入位点的制剂,插入到生物体基因组DNA的未知位置。试剂盒用于鉴定其DNA片段的插入位点该序列是已知的,插入人体的DNA基因的未知位置,并使用所述制剂。
机译: 鉴定可改变脊椎动物表皮黑素细胞色素沉着的物质,抑制,增强或调节c-β激酶蛋白介导的酪氨酸酶磷酸化的物质的方法,使用可调节或抑制由c-beta激酶介导的丝氨酸残基或苏氨酸的磷酸化的试剂的方法蛋白c-beta激酶,用于特异性干扰蛋白c-beta激酶介导的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化的肽中,使用DNA或肽构建物制造药物以减少头发上的色素沉着,脊椎动物的毛,羊毛或毛发,以及调节c-beta激酶介导的酪氨酸酶磷酸化的物质的用途。
机译: 核酸,核酸序列,使用核酸的过程,使用载体的过程,产生聚肽,施用聚肽以治疗动物I中的疾病或失调,以确定动物中的疾病或失调I,生产任何脂肽,鉴定,分离和扩增神经母细胞核素核酸序列的方法,诊断或评估疾病或病症或它们的易感性,评估纯化的神经母细胞的脂肽或先例的调节剂活性的衍生物或片段,用于治疗或预防疾病。使用一种或多种核酸序列治疗神经系统疾病,并鉴定候选化合物诱导由神经母细胞,载体介导的生物学效应的细胞,该细胞用核酸,lipeptept,cmposi,抗体,合成基因和集合转化。